JBCS



8:10, sex fev 14

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Artigo


Determinação de ácido salicílico em leite utilizando spot test em papel e processamento de imagens digitais
Determination of salicylic acid in milk using paper-based spot tests and digital image treatment

Josiele Aparecida Magalhães Conrado; João Flávio da Silveira Petruci*

Instituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia, 38400-902 Uberlândia - MG, Brasil

Recebido: 26/02/2024
Aceito: 24/07/2024
Publicado online: 19/11/2024

Endereço para correspondência

*e-mail: jfpetruci@gmail.com

RESUMO

Milk is a worldwide consumed product, and therefore, quality control is essential. The addition of salicylic acid (SA) represents a common type of adulteration, used to reduce the growth of microorganisms and extend shelf life. However, excessive ingestion of SA can cause gastrointestinal issues and even lead to death. This study describes the development of a simple analytical method for the determination of salicylic acid in milk based on the colorimetric reaction between the analyte and FeIII ions. The quantification was performed by digital image treatment. Different linear ranges were obtained for each type of milk analyzed: 100 to 1500 mg L-1 for raw milk, 300 to 2000 mg L-1 for skimmed milk, 500 to 2000 mg L-1 for powdered milk, 100 to 2000 mg L-1 for whole milk, and 100 to 1500 mg L-1 for lactose-free milk. The accuracy of the method was obtained by comparison with a reference method, and the recovery percentage provided values between 71 and 120%. An RSD (relative standard deviation) of 0.7% was obtained. The parameters evaluation resulted in a simple and miniaturized analytical method without a sample preparation step for the determination of SA in milk, serving as a tool for identifying adulteration practices.

Palavras-chave: RGB; colorimetry; paper-based devices; food quality.

INTRODUÇÃO

O leite é um produto de grande importância na alimentação diária devido ao seu elevado valor nutritivo e por ser fonte de proteínas, lipídios, carboidratos, minerais e vitaminas.1 Ele é uma das commodities agropecuária mais importantes do mundo, pertencendo a um dos ramos industriais mais expressivos do país.2 A qualidade do leite é, basicamente, associada ao seu estado de conservação e composição química.3 A adição ou remoção de substâncias, próprias ou estranhas à sua composição, é uma prática comum de adulteração, com objetivo de alterar os parâmetros físico-químicos, aumentar o valor nutricional ou o tempo de prateleira.4 Qualquer composto químico adicionado ou retirado do leite é considerado fraude, sendo a gordura a única substância permitida.5

Um dos parâmetros utilizados para o controle de qualidade do leite é a contagem de bactérias totais, uma vez que quanto menor a contaminação microbiana, maior será o valor agregado. A adição de conservantes químicos é uma forma de diminuir a contaminação e, por consequência, obter maior remuneração no leite produzido.6 O ácido salicílico (AS) é um dos conservantes mais adicionados ao leite e seu uso pode provocar danos à saúde humana em função da quantidade absorvida, tais como alterações metabólicas, problemas respiratórios, febre, hemorragia e hipoglicemia. Geralmente, ingestão inferior a 150 mg kg-1 não causa sintomas agudos de toxicidade, enquanto valores entre 150 e 300 mg kg-1 podem produzir efeitos moderados. Doses maiores que 500 mg kg-1 podem levar a sintomas severos, como convulsões e coma.7 Se ingerido por via oral, o ácido salicílico é absorvido rapidamente e pode atingir o valor máximo em cerca de 1 h.8 Além dos efeitos citados, a ingestão oral pode provocar irritação gastrointestinal e em elevadas doses pode danificar o revestimento do estômago e dos intestinos, causando úlceras, pressão arterial baixa e choque.9

A adição de ácido salicílico no leite não é permitida e seu uso é considerado fraude. Os testes físico-químicos de rotina (e.g., acidez, densidade, teor de gordura) são ineficazes para identificar se determinadas substâncias foram adicionadas no leite.4 Dentro deste contexto, o desenvolvimento de métodos analíticos rápidos e confiáveis para determinação de ácido salicílico em leite é de grande importância para garantir a qualidade do produto. Diversas técnicas analíticas foram aplicadas para a determinação de ácido salicílico em diferentes tipos de amostra, tais como folhas de tomate,10 alimentos em conserva (manga, tamarindo e mostarda verde),11 vegetais,12 leite bovino e tecido muscular13 e chá.14 A cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (HPLC-MS) foi aplicada para determinação de AS em leite utilizando precipitação das proteínas e extração em fase sólida (SPE) como preparo de amostra.13 Em outro trabalho,15 um biossensor amperométrico foi aplicado para quantificação de ácido salicílico em amostras de plasma e leite bovino, baseado na oxidação eletrocatalítica do analito em um eletrodo de disco de grafite revestido com polipirrol e tecido de banana como fonte de polifenol oxidase. Sistemas de análise em fluxo com detecção espectrofotométrica foram utilizados para a determinação de AS em amostras de leite UHT (do inglês, ultra high temperature) desnatado, leite de vaca cru e leite de cabra desnatado. O método baseou-se na reação de complexação do FeIII com o ácido salicílico e obteve uma faixa linear entre 103 e 415 mg L-1.16 O sistema HPLC-UV-Vis (cromatografia líquida de alta eficiência-ultravioleta visível) foi utilizado para determinação de ácido salicílico em mosto e vinho.17 Todavia, essas técnicas instrumentais possuem alto custo, utilizam grandes volumes de reagentes e solventes e demandam etapas complexas e demoradas de pré-tratamento de amostra. Levando em consideração as desvantagens mencionadas, o desenvolvimento de propostas simples, de baixo custo, menor consumo de reagentes e que não necessite de etapas de preparo das amostras é primordial.18

A adaptação de métodos analíticos utilizando pequenos volumes (e.g., microfluídicos) na superfície de papel tem sido considerada uma estratégia atraente para o desenvolvimento de métodos analíticos miniaturizados. O uso do papel como plataforma analítica é interessante, pois é de fácil acesso, baixo custo, fácil descarte e o transporte de soluções é facilitado pela hidrofobicidade do material. A combinação do papel com reações colorimétricas foi inicialmente explorada por Fritz Feigl19,20 e retomada por Whitesides e colaboradores,21 que apresentou o uso do papel como substrato para a fabricação de dispositivos microfluídicos. Nos últimos anos, uma variedade de trabalhos tem sido publicada utilizando reações colorimétricas em dispositivos microfluídicos em papel para aplicações, em áreas de análise ambiental,22,23 bioanalítica24,25 e análises de alimentos.26

Adicionalmente ao emprego de reações colorimétricas em substratos de papel, a utilização de dispositivos eletrônicos para a aquisição de imagens digitais, tais como smartphones, câmeras digitais e scanners, aumentam o grau de portabilidade, baixo custo e de facilidade de manuseio para aplicações analíticas.21 Diversos modelos de cores são utilizados para fins quantitativos, tais como RGB (do inglês, red, green and blue), CMY (do inglês, cyano, magenta channels), HSV (hue, saturation and value) e outros.27 O modelo RGB é o mais utilizado para fins analíticos, já que é o mais simples e os parâmetros de intensidade de cor (R, G e B) podem ser diretamente relacionados com a concentração do analito.28,29 Além disso, a transformação de RGB para escala de cinza (EC) tem sido aplicada para obtenção de sinal analítico proporcional a concentração. A utilização do processamento de imagens digitais como ferramenta de quantificação tem sido amplamente empregada em métodos in situ e point of care (POC). Diversos artigos de revisão30,31 estão disponíveis na literatura para leitores mais interessados.

Neste trabalho, um método analítico para determinação de ácido salicílico em diversos tipos de amostras de leite foi adaptado a partir da realização de uma reação colorimétrica na superfície de dispositivos de papel em formato circulares (spots). A quantificação do analito foi realizada utilizando processamento de imagens digitais obtidas por um scanner convencional e as amostras de leite foram utilizadas sem nenhum tipo de pré-tratamento.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Soluções e reagentes

Todas as soluções foram preparadas com reagentes de grau de pureza analítica. A solução estoque de FeIII foi preparada em um balão volumétrico de 10,00 ± 0,025 mL dissolvendo 1,0031 g de cloreto de ferro hexahidratado (FeCl3.6H2O) (Vetec, Duque de Caxias, Brasil) em álcool etílico (Dinâmica, Indaiatuba, Brasil). A solução estoque de ácido salicílico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) foi preparada em um balão volumétrico de 25,00 ± 0,03 mL, pela dissolução de 1,7310 g de ácido salicílico em álcool etílico. Soluções de concentrações de trabalho de FeIII e AS utilizadas nas etapas de otimização e calibração foram preparadas por diluições.

Fabricação dos dispositivos de papel

Os dispositivos de papel foram fabricados pelo método de cera utilizando uma impressora modelo ColorQube 8580 (Xerox, Nova Iorque, EUA). O substrato empregado foi um papel de filtro quantitativo (Whatman 1, Whatman, Millipore, EUA). As zonas reacionais circulares de diferentes diâmetros foram desenhadas com o auxílio do software gráfico Inkscape. Os dispositivos impressos foram aquecidos a 200 ºC por 180 s em uma chapa de aquecimento (GT-CAD5L) para promover a fusão da cera e, assim, criar as barreiras hidrofóbicas no substrato de papel.

Obtenção das imagens digitais e tratamento dos dados

O método de quantificação foi realizado por meio do processamento das imagens digitais obtidas com resolução de 300 dpi por um scanner HP Deskjet G4050. O software ImageJ®32 foi empregado para extração dos parâmetros RGB de cada imagem. Nesta etapa, é necessário que a seleção da área de interesse (ROI) seja a mais homogênea e representativa possível, fornecendo os respectivos valores de RGB que compõem a coloração da área selecionada. Os valores de RGB foram transformados em escala de cinza (EC) por meio da Equação 1:

Influência da ordem da adição dos reagentes no padrão

Para avaliar a influência da ordem de adição dos reagentes no sinal analítico, utilizou-se 10 µL de solução padrão de ácido salicílico e 10 µL de solução de FeIII de concentração 100 mg L-1. Foi definido como "antes", o experimento em que a solução de FeIII era dispensada ao spot em papel seguido pela solução de ácido salicílico e como "depois" a situação inversa. As imagens foram obtidas e as informações de intensidade de cor (RGB) foram extraídas. O sinal analítico final foi considerado como sendo a subtração do valor de escala de cinza obtida do spot test do branco da escala de cinza contendo AS (ECbranco - ECsinal).

Obtenção das figuras de mérito do método

O procedimento de "validação no laboratório (in house)" foi aplicado para a metodologia desenvolvida, como sugerido na literatura.33 As figuras de mérito avaliadas foram: linearidade, exatidão, recuperação, precisão, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ). A precisão foi obtida por meio da obtenção do coeficiente de variação (CV, %) da resposta analítica utilizando 12 amostras de leite desnatado fortificadas com 500 mg L-1 de ácido salicílico e submetidas ao procedimento otimizado (spot de 30 mm e concentração de FeIII de 100 mg L-1).

Para a avaliação da linearidade, foram construídas curvas analíticas utilizando soluções padrão de AS preparadas em etanol, na faixa de 100 a 1200 mg L-1, e em amostras dos leites em diferentes faixas de concentração: leite integral de 100 a 2.000 mg L-1, leite desnatado de 300 a 2.000 mg L-1, leite em pó de 500 a 2.000 mg L-1, leite zero lactose de 100 a 1.500 mg L-1 e leite cru de 100 a 1.500 mg L-1.

A exatidão foi avaliada por meio da comparação dos resultados da concentração de ácido salicílico obtido pelo método proposto com um método espectrofotométrico de referência13,16 utilizando a mesma faixa de concentração avaliada no método desenvolvido. Neste procedimento, 200 µL de amostra de leite foram diluídos em 10,00 mL de água deionizada. Uma alíquota de 5,00 mL dessa solução foi transferida para um balão volumétrico de 10,00 mL, adicionou-se 3,00 mL da solução de FeIII e o volume foi ajustado com água. Após 3 min, mediu-se a absorbância em 525 nm. O teste t de Student foi utilizado para comparação dos resultados obtidos pelos dois métodos.

Procedimento de análise das amostras de leite

As amostras de leite do tipo integral, zero lactose, desnatado e em pó foram obtidas no mercado local da cidade de Uberlândia, MG, bairro Santa Mônica. O leite cru foi coletado na cidade de Iturama, MG. As amostras foram mantidas sobre refrigeração e não passaram por nenhuma etapa de pré-tratamento. Em cada análise, 50 μL de amostra de leite foram adicionados ao dispositivo de papel, seguidos de 50 μL da solução de FeIII. Após a secagem, as imagens foram obtidas e processadas para extração dos parâmetros RGB. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A reação colorimétrica utilizada para a quantificação de ácido salicílico em papel é baseada na formação de um complexo de cor roxa após o contato entre o analito e íons Fe3+ em meio ácido, conforme apresentado na Figura 1. A seletividade desta reação foi avaliada previamente em outros trabalhos disponíveis na literatura.34,35 Verificou-se que a reação de formação do complexo entre FeIII e ácido salicílico não sofre interferência de outras espécies iônicas - tais como HgII, FeII, PbII, CdII, Na+, K+, Zn2+, Ca2+, Mg2+, Sn2+, NO3-, NO2-, CO32-, SCN- e oxalato - bem como de outras substâncias, como lactose, ácido cítrico, amido e glicose. Para a obtenção das melhores condições da realização da reação colorimétrica na superfície do papel, alguns parâmetros experimentais foram avaliados, tais como: tamanho do spot, concentração da solução de FeIII, estabilidade do produto formado e a ordem de adição dos reagentes. Estes parâmetros foram avaliados e otimizados para resultar em um sinal analítico de maior intensidade e uniformidade.

 

 

Avaliação do tamanho do spot test

O tamanho das zonas circulares em que a reação colorimétrica se realizará influencia diretamente no sinal analítico. Tamanhos maiores permitem a adição de um maior número de mols do analito, favorecendo assim a detecção de concentrações menores. Por outro lado, é comum a formação de gradientes de cores quando as reações colorimétricas são realizadas em papéis circulares, com uma maior concentração de cor na borda do papel. Esse fato pode reduzir a repetibilidade e a detectabilidade do método. Para esta avaliação foram utilizados papéis preparados com zona circulares com tamanhos de 10, 20, 30 e 40 mm e curvas analíticas foram construídas utilizando, inicialmente, os parâmetros de intensidade de cor do modelo RGB. Como pode ser observado na Figura 1S (Material Suplementar), as relações lineares obtidas utilizando os canais RGB como sinais analíticos não foram satisfatórias. Isso pode ser explicado pelo fato de que a coloração roxa do complexo formado é uma combinação dos componentes vermelho (R), verde (G) e azul (B) do modelo de cores. Quando relacionados com a concentração, nenhum apresenta relação diretamente linear. Nesse caso, os valores de RGB obtidos podem ser transformados em um único parâmetro, denominado escala de cinza (EC).36 Portanto, os valores de escala de cinza de cada reação realizada na faixa de 50 a 3500 mg L-1 de ácido salicílico foram calculados e os resultados apresentados na Tabela 1. Verificou-se o aumento do sinal analítico em diâmetro de até 40 mm. A faixa linear e o limite de detecção foram menores utilizando tamanho de 40 mm, pois quanto maior o tamanho do spot maior será o número de mols adicionados ao papel para formação do complexo. Entretanto, o tempo de secagem e homogeneidade da cor formada apresentaram melhores resultados com tamanho de 30 mm, sendo que a faixa linear e LOD estão próximos aos obtidos com 40 mm. Dessa forma, o tamanho de spot de 30 mm foi estabelecido como ideal e utilizado para otimização dos outros parâmetros.

 

 

Influência da ordem da adição dos reagentes em solução padrão

A ordem de adição dos reagentes é um parâmetro importante no desenvolvimento de uma reação colorimétrica. Visando maximizar a intensidade do sinal analítico, avaliou-se a intensidade de cor gerada pela reação em função da ordem dos reagentes, com concentrações de ácido salicílico variando entre 800 e 1700 mg L-1. O sinal analítico líquido considerado foi a subtração do valor das escalas de cinza adquirida antes (ECbranco) e depois (ECsinal) da adição dos reagentes. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. Como pode ser observado, o sinal analítico foi maior quando a solução de FeIII foi adicionada primeiro (indicado como "antes" na Tabela 2. A coluna "depois" trata-se dos resultados obtidos com a adição de FeIII após a adição de ácido salicílico). Este fato pode estar relacionado a interação dos grupos hidroxila do papel com as moléculas de ácido salicílico, resultando em uma menor disponibilidade do AS para reagir com os íons FeIII.37 Portanto, o procedimento estabelecido foi adicionar à solução de FeIII inicialmente ao dispositivo de papel.

 

 

Avaliação da variação da concentração de ferro(III)

Por fim, o último parâmetro da reação colorimétrica a ser otimizado foi a concentração da solução de FeIII, que foi avaliada na faixa de 80 a 330 mg L-1. As concentrações de ácido salicílico também foram preparadas em três níveis: 100, 300 e 500 mg L-1. Os valores de sinal analítico em função da concentração de FeIII estão apresentados a Figura 2. Um efeito significativo nos valores do sinal analítico com o aumento da concentração de FeIII é observado. O sinal atinge o máximo valor com 100 mg L-1, permanecendo constante em 200 mg L-1. Após esse valor, o sinal diminui de maneira considerável. Isto ocorre pelo fato de que o sinal analítico é obtido por meio da diferença entre a intensidade da escala de cinza do branco com o extraído da reação de FeIII com AS. Dessa forma, se o sinal analítico do branco for maior que o sinal analítico da reação, o valor é negativo. Concentrações elevadas de FeIII possuem colorações maiores e, consequentemente, o sinal do branco é maior. Por essa razão, a concentração de 100 mg L-1 de FeIII foi selecionada para o desenvolvimento das próximas etapas do trabalho.

 

 

Estudo da estabilidade do sinal analítico em função do tempo

Uma das vantagens do método proposto é a formação imediata do complexo após a adição dos reagentes. Para avaliar a estabilidade do complexo formado, foram adquiridas imagens após adição de AS ao spot test contendo FeIII em intervalo de tempo de 0 a 35 min. As aquisições das imagens foram realizadas a cada dois minutos e meio. A variação do sinal analítico, em termos de coeficiente de variação, foi inferior a 2%, indicando uma estabilidade adequada do complexo formado na superfície do papel.

Obtenção das figuras de mérito do método

A avaliação da precisão foi realizada por meio da obtenção de um coeficiente de variação (CV) de 0,7%, indicando boa repetibilidade do método proposto. Em seguida, foi avaliada a linearidade da relação entre o sinal analítico e a concentração de ácido salicílico. A Figura 3 apresenta as curvas analíticas construídas utilizando soluções padrão preparadas em etanol e em leite zero lactose. Como pode ser observado, os coeficientes angulares das retas foram distintos, evidenciando a ocorrência do efeito matriz.38 Desse modo, as curvas de calibração devem ser construídas utilizando a matriz de análise. Em todas as curvas analíticas construídas, um coeficiente de determinação (R2) > 0.99 foi obtido, indicando linearidade adequada. As curvas analíticas estão apresentadas na Tabela 3. Os limites de detecção e quantificação foram calculados considerando 3 e 10 vezes, respectivamente, o desvio padrão obtido de 5 medidas do branco dividido pelo coeficiente angular de cada curva de calibração construída. Os valores de LOD e LOQ estão apresentados na Tabela 3. A figura de mérito de recuperação foi avaliada fortificando todas as amostras de leite (integral, desnatado, zero lactose, em pó e cru) com três níveis de concentração de AS. Todas as análises foram feitas em triplicata e o percentual de recuperação para cada amostra foi calculado. Os resultados estão apresentados na Tabela 4. Os valores de recuperação calculados estão na faixa entre 71,4 e 120%, que é considerado adequado segundo os guias de validação.33 A homocedasticidade das curvas analíticas foi avaliada e não foram verificados padrões, sendo os resíduos distribuídos de forma aleatória em torno de y = 0. Os gráficos dos resíduos estão apresentados na Figura 2S (Material Suplementar).39

 

 

 

 

 

 

A capacidade de um método analítico em fornecer resultados próximos a um valor real ou aceito é avaliada por meio da figura de mérito de exatidão. Neste trabalho, os resultados obtidos pelo método proposto foram comparados com os obtidos pelo método de referência13,16 utilizando o teste t de Student. Os valores de concentração de ácido salicílico em diferentes amostras de leite obtidos pelos dois métodos estão apresentados na Tabela 5. Considerando que o valor t tabelado é 2,78 (a = 0,05), é possível concluir que os resultados obtidos são estatisticamente idênticos no nível de confiança de 95%.40,41

 

 

O desempenho analítico do método desenvolvido foi comparado com outros métodos disponíveis na literatura,10,11,13,15,16,42-44 conforme apresentado na Tabela 6. Dos oito trabalhos descritos na Tabela 6, três realizaram estudos em amostras de leite utilizando instrumento de alto custo, como o HPLC-MS (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas), ou de preparo laborioso de amostras, com exceção do método que utiliza injeção em fluxo, que emprega apenas uma diluição. A faixa linear obtida neste trabalho está próxima aos métodos que utilizaram reações colorimétricas e espectrofotometria. As grandes vantagens do método proposto são a simplicidade operacional, miniaturização, nenhum preparo de amostra, baixo consumo de reagentes e custo reduzido quando comparadas às técnicas instrumentais utilizadas nos trabalhos descritos.

 

 

Aplicação em amostras de leite

As amostras leite desnatado, em pó, cru, zero lactose e integral foram submetidas ao procedimento proposto e ao procedimento espectrofotométrico convencional, descrito na literatura.45 Não foi detectada a presença de ácido salicílico dentro da faixa linear obtida neste trabalho. É importante mencionar que a presença de ácido salicílico não é permitida em qualquer concentração e em nenhum tipo de amostra de leite.

 

CONCLUSÕES

Neste trabalho foi desenvolvido um método analítico para quantificação de ácido salicílico em amostras de leite utilizando uma reação colorimétrica realizada na superfície de um dispositivo de papel no formato zonas circulares. As principais vantagens do método proposto estão relacionadas com a não necessidade de preparo da amostra, pouca geração de resíduos pelo uso de pequeno volume de amostra e reagente, rapidez, simplicidade e utilização do processamento de imagens digitais para fins quantitativos, tornando o método possível de ser aplicado em praticamente qualquer local. Além disso, o baixo custo e a alta disponibilidade do papel de filtro como substrato é uma vantagem adicional do método proposto.

A presença de ácido salicílico não foi detectada nas amostras de leite analisadas, dentro da faixa de trabalho avaliada. As amostras que foram fortificadas com AS em diferentes faixas de concentração e foram submetidas ao método proposto apresentaram valores adequados de recuperação. Esses resultados demonstram que o método pode ser aplicado para controle de qualidade de diferentes tipos de leite em função da concentração de ácido salicílico.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

O material suplementar desse trabalho (curvas analíticas e os gráficos de resíduos) está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br/, na forma de arquivo PDF, com acesso livre.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 403929/2021-0) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG, APQ­00196-22) pelo financiamento da pesquisa e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de doutorado da autora.

 

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Editor responsável pelo artigo: Jorge M. David

On-line version ISSN 1678-7064 Printed version ISSN 0100-4042
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