JBCS

INTRODUÇÃO

O gênero Piper pertence à família Piperaceae e é composto por 1000 espécies. Compreende ervas, arbustos e pequenas árvores distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do globo.¹ Várias espécies de Piper são utilizadas na medicina popular como analgésicas, anti-inflamatórias e para o tratamento de picadas de cobra.² Uma variedade de compostos tem sido isolada de espécies de Piper, incluindo amidas, lignanas, neolignanas, hidroquinonas, alcaloides, terpenos, derivados do ácido benzóico e aristolactamas. Frequentemente observa-se o isolamento de flavonoides, representados por flavonas, di-hidrochalconas, chalconas e flavanonas.^3-5

Piper glandulosissimum Yuncker (Piperaceae) é um arbusto nativo do Norte do Brasil,⁶ utilizado na medicina tradicional como anti-inflamatório. Testes realizados com o seu extrato hidroalcóolico revelaram uma elevada atividade antioxidante devido à presença de polifenóis.⁷ Foram realizados também testes de atividade antimicrobiana do seu extrato aquoso, contudo, não foi evidenciada nenhuma atividade.⁸ Existem poucos estudos fitoquímicos relacionados à espécie, podendo ser enfatizados a obtenção de óleos essenciais⁹ e a identificação de flavonóis, flavanóis e ácido hidroxicinâmico por CLAE.⁸

Durante os nossos estudos de espécies de Piperaceae do Norte e Nordeste brasileiro foram isolados alguns compostos químicos, tais como: flavonoides,¹⁰ amidas¹¹ e aristolactamas.¹² Neste trabalho descrevemos o isolamento e a identificação estrutural de 2',4'-di-hidroxi-3',6'-dimetoxichalcona (1), 2',4'-di-hidroxi-6'-metoxichalcona (2), 2',4'-di-hidroxi-6'-metoxidi-hidrochalcona (3), 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4), 5,8-di-hidroxi-7-metoxiflavanona (5) e 5,7,8-trimetoxiflavanona (6). As estruturas dos compostos foram determinadas pelas análises dos espectros de UV, IV e RMN de ¹H e ¹³C, incluindo técnicas de RMN bidimensionais, além de comparações com dados descritos da literatura.

PARTE EXPERIMENTAL

Métodos gerais

Nas colunas cromatográficas foi utilizada como fase fixa Sephadex LH-20 (Merck) e gel de sílica 60 (MERCK - 0,063-0,200 mm e 0,2-0,5 mm), que também foi usada para a confecção de placas cromatográficas em camada delgada analítica e preparativa. Os compostos foram visualizados usando luz UV (λ_max 254 e 366 nm). Espectros no IV foram obtidos em aparelho Perkin-Elmer (FT-IR-1750) utilizando pastilha de KBr. A análise espectroscópica na região do ultravioleta (UV) foi realizada em aparelho Vankel, modelo Vankel-50 UV-Vis, utilizando-se CH₃OH e os seguintes reagentes de deslocamento: acetato de sódio (NaOAc) anidro P.A., solução de cloreto de alumínio (AlCl₃) anidro P.A. em metanol e solução de ácido clorídrico (HCl) P.A. em água destilada (50% V:V).¹³ Os espectros uni e bidimensionais de RMN foram registrados em espectrômetros da Varian mod. MERCURY operando a 200 e 500 MHz (¹H) e 50 MHz e 125 MHz (¹³C) e Bruker mod. AC operando a 300 (¹H) e 75 MHz (¹³C). Os deslocamentos químicos foram relatados em ppm tendo como referência interna o TMS. Foram empregados os seguintes solventes: acetona-d₆, CDCl₃, CD₃OD e DMSO-d₆.

As reações de acetilação foram realizadas com o uso de anidrido acético e piridina, obedecendo a proporção de 0,5 mL de anidrido acético e 1 mL de piridina para cada 100 mg de composto a reagir. O progresso das reações foi monitorado por CCDA. Após o término da reação, a mistura foi tratada com água destilada gelada até a formação de um precipitado, que foi filtrado e lavado com água destilada, dissolvido em CHCl₃ e seco com Na₂SO₄. O solvente remanescente foi evaporado em evaporador rotativo.¹⁴

Material vegetal

As partes aéreas de Piper glandulosissimum Yuncker foram coletadas em maio de 2002 juntamente com a exsicata (número MG 165.227, Herbário João Murça Pires do Museu Paraense Emílio Goeldi - MPEG, Belém, PA) e identificada pela Dra. Elsie Guimarães.

Obtenção do extrato e isolamento dos compostos químicos

O material vegetal foi triturado em moinho com lâminas cortantes e o pó resultante (1.880 kg) foi exaustivamente extraído com etanol (6 x 2,5 L). Após a remoção do solvente em evaporador rotativo obteve-se o extrato etanólico bruto (180 g). Uma parte deste extrato (90 g) foi dissolvida em uma solução de CH₃OH:H₂O (7:3) na proporção de 1:5 e particionado em solventes de polaridade crescente fornecendo as fases hexânica (4,5 g), clorofórmica (26 g), acetato de etila (30 g) e CH₃OH:H₂O (6 g). Alíquota de 1,4 g da fase hexânica foi submetida à cromatografia em coluna com gel de sílica utilizando-se como fase móvel hexano e clorofórmio em misturas binárias e gradiente crescente de polaridade, fornecendo 26 frações. As frações 18-21 (0,145 g) foram reunidas e submetidas a coluna com Sephadex LH-20 utilizando como fase móvel CHCl₃: CH₃OH (1:1), obtendo-se, após recristalização em acetona, o composto 3 (0,015 g). Alíquota de 15 g da fase clorofórmica foi submetida à cromatografia em coluna usando gel de sílica e os solventes hexano, AcOEt e CH₃OH em gradiente crescente de polaridade, fornecendo 130 frações. As frações 10-11 (0,085 g), após recristalização em tetracloreto de carbono, forneceram 1 (0,020 g), que foi acetilado para a obtenção de 1a. A CCDP da fração 14 (0,067g), usando-se como eluente CHCl₃, resultou no isolamento de 2 (0,015 g). Da fração 76 (1,5 g), após recristalização com benzeno, obteve-se 70 mg de 4, acetilado para a obtenção de 4a. As frações 80-82 (0,195 g), após eluídas em coluna utilizando como fase móvel clorofórmio e acetato de etila em grau crescente de polaridade, forneceram 3 frações (80-82A, 80-82B, 80-82C). Cromatoplacas preparativas das frações 80-82B (0,035 g) e 80-82C (0,017 g) resultaram no isolamento de 5 (0,006 g) e de 6 (0,004 g), respectivamente.

2',4'-di-hidroxi-3',6'-dimetoxichalcona (1) cristais avermelhados, P.F.=144-146 ºC (lit. 124-125 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, acetona-d₆), (Tabela 1).

2',4'-diacetoxi-3',6'-dimetoxichalcona (1a), RMN de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃), (Tabela 1).

2',4'-di-hidroxi-6'-metoxichalcona (2) cristais vermelhos, P.F.=163-165 ºC (lit. 193-196 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃), (Tabela 2).

2',4'-di-hidroxi-6'-metoxidi-hidrochalcona (3) cristais amarelos, P.F.=174-176 ºC (lit. 185-187 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (500 e 125 MHz, CD₃OD), (Tabela 2).

7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4) cristais amarelos, P.F. = 158,5-160,5 ºC (lit.190-192 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, acetona-d₆), (Tabela 3).

7-acetoxi-5,8-dimetoxiflavanova (4a), RMN de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃).

5,8-di-hidroxi-7-metoxiflavanona (5) cristais amarelos, P.F. = 216-218 ºC (lit. 220-225 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, DMSO-d₆), (Tabela 3).

5,7,8-trimetoxiflavanona (6) cristais amarelos, P.F. = 160-162 ºC (154-156 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, CDCl₃), (Tabela 3).

Avaliação da atividade antimicrobiana

O método usado foi a técnica de difusão em meio sólido.¹⁵ Em placas estéreis foi depositado 1 mL de cada cepa de microrganismo em suspensão em soro fisiológico, padronizada pelo tubo 0,5 da escala de McFarland e ajustada para 90% T (530 nm), correspondendo aproximadamente a 10⁶ UFC. Em seguida, adicionou-se 21 mL do meio sólido fundido a 50 ºC. Quando solidificado, foram feitas no meio de cultura cavidades de 6 X 8 mm de diâmetro. Após essa etapa, foram depositados 50 µL do composto 4 solubilizado em DMSO em diferentes concentrações. Os controles foram realizados com cloranfenicol para bactérias e cetoconazol para fungos. Os ensaios foram incubados a 24-48 h para bactérias e leveduras a temperatura ambiente (28-30 ºC) e durante 10-14 dias para fungos filamentosos.¹⁶ A atividade biológica do produto foi considerada positiva quando o halo de inibição de crescimento foi igual ou superior a 8 mm de diâmentro.¹⁷ Para os ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana foram utilizados os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus - ATCC 6528, Staphylococcus epidermidis - ATCC 12.228, Pseudomonas aeruginosa - LM B6, Escherichia coli - B 04, Candida albicans - LM 32, Candida tropicalis - LM 25, Candida knisei - LM 07, Candida guilliermondii - LM 16, Trichophyton rubrum - LM 75, Trichophyton mentagrophytes - LM 06, Microsporum caniis - LM 828, Aspergillus flavus - LM 27, Penicillium - LM 131 e Fusarium - LM 135.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O espectro no IV de 1 (ν_max., KBr, cm^-1) mostrou banda de absorção forte em 3.511 cm^-1 com ombro em 3.458 cm^-1, sugerindo a presença de hidroxilas livre e quelada, bandas fracas entre 3.081-3.028 cm^-1 e 2.992-2.832 cm^-1, características de deformação axial de C-H olefínicos e de estiramento C-H de grupos metílicos e metínicos, além de bandas intensas entre 1.601 cm^-1 - 1.434 cm^-1 e em 1632 cm-¹, sugestivas de deformação axial C=C de anel aromático e de grupamento carbonílico na molécula.¹⁸

O espectro de RMN de ¹H (acetona-d₆, 300 MHz) de 1 mostrou sinais característicos de hidroxila quelada (δ_H 14,40), de grupamento carbonílico α, β insaturado {δ_H: 8,03 (d, J=15,6 Hz) e 7,78 (d, J=15,6 Hz)], este corroborado pela presença de um sinal em δ_C 193,79 no espectro de RMN ¹³C (técnica BB), de anel aromático monossubstítuido [δ_H 7,74-7,70 (m, 2H); δ_H 7,49-7,42 (m, 3H)] e pentassubstítuido [δ_H 9,17 (sl, 1H); δ_H 6,13 (s, 1H); δ_H 3,98 (s, 3H); δ_H 3,76 (s, 3H) e δ_H 14,40 (s, 1H)] e permitiu atribuir δ_H: 14,40; 8,03; 7,78; 7,74-7,70; 7,49-7,42 e 3,76, respectivamente, para as posições 2', β, α, 2/6, 3/4/5 e OCH₃-3', a última definida pelas correlações δ_H 14,40/δ_C 130,07; δ_C 106,69; δ_C 160,89 e δ_H 3,76/130,07, encontradas no experimento HMBC, que também definiu os sinais em δ_C: 160,89 e 106,69 para C-2' e C-1', respectivamente. O deslocamento químico de OCH₃-3' (δ_C 60,69) permitiu propor a presença de substituinte na posição 4'; tal dado, ao lado das correlações cruzadas entre o sinal em δ_H 6,13 com δ_C: 130,07; 106,69; 159,84 e 158,14, definiu δ_H 6,13 para H-5', originando as possibilidades estruturais A (OH-4' e OCH₃-6') e B (OH-6' e OCH₃-4')

Preparação do derivado acetilado de 1 (1a) mostrou, no espectro ¹H x ¹H NOESY (CDCl_3, 200 MHz), correlação entre δ_H 2,34 (s, 3H, CH₃) e δ_H 6,62 (s, 1H, H-5' ) e permitiu sugerir δ_H 2,34 para a metila da acetoxila na posição 4' ou 6'. Tal dado aliado ao sinal da correlação entre δ_H 2,34 e δ_H 3,75 (OCH₃-3') sugeriu substituinte OH [δ_H 9,17(sl, 1H)] em C-4' (A), proposta corroborada pelo espectro no UV de 1 (λ_max., CH₃OH), o qual mostrou um deslocamento batocrômico da banda I de 361 nm para 389 nm (após a adição de acetato de sódio) indicando a presença de uma chalcona¹⁰ com grupo OH livre na posição 4' do anel A¹⁹ e, consequentemente, o substituinte metoxílico em δ_H 3,98 para C-6' em 1.

Os demais sinais vistos no espectro de RMN de ¹³C de 1 (acetona-d₆, 75 MHz) foram atribuídos com o auxílio dos espectros bidimensionais HMQC (300/75 MHz, acetona-d₆) e HMBC (300/75 MHz, acetona-d₆) (Tabela 1).

Análise conjunta dos dados extraídos dos espectros citados permitiu sugerir que 1 trata-se de: 2',4'-di-hidroxi-3',6'-dimetoxichalcona (Figura 1), já isolada de uma espécie da família Poligonaceae,²⁰ mas pela primeira vez em Piperaceae. O derivado 1a é descrito pela primeira vez na família Piperaceae.

Figura 1. Compostos isolados e derivados obtidos das partes aéreas de P. glandulosissimum

O espectro de 2 no IV (ν_max., KBr, cm^-1) mostrou bandas de absorção em 3.433 cm^-1, indicativa de grupamento hidroxila na molécula, entre 3.065 cm^-1 e 2.851 cm^-1, sugestivas de deformação axial de C-H de olefinas e de grupos metílicos e metínicos, e em 1.682 cm^-1 e 1.125 cm^-1 que apontaram para a presença de grupamento carbonílico e para deformação axial de C-O-C de alquilaril éter,²¹ respectivamente.

O espectro de UV (λ_max., CH₃OH) apresentou a banda I em 348 nm e um ombro em 310 nm. O uso de AlCl₃/HCl provocou um deslocamento batocrômico da banda I para 375 nm, com magnitude de 27 nm em relação ao espectro em CH₃OH e ainda fez emergir uma banda II em 310 nm, esta menos intensa que a primeira, o que é característico de chalconas.¹⁰

O espectro de RMN de ¹H (CDCl₃, 200 MHz) de 2, semelhante ao de 1, sugeriu que 2 difere de 1 apenas quanto a substituição do anel A. O sinal simples em δ_H 14,35, característico de hidroxila quelada em C-2', mostrou, no experimento bidimensional HMBC, correlações com os sinais em δ_C 167,10, 105,59 e 96,15 e foram atribuídas as posições 2', 1' e 3', respectivamente. O espectro HMQC (CDCl_3, 200/50 MHz) mostrou correlação de δ_C 96,15 e δ_H 5,92 (d, J=2,0 Hz, 1H), o que permitiu atribuir este sinal a H-3' e, consequentemente, δ_H 5,88 (d, J=2,0 Hz, 1H) para a posição 5'. O singleto em δ_H 3,83 (3H), juntamente com a correlação mostrada no HMBC, de δ_H 5,88 com os sinais: δ_C 164,82 e δ_C 163,21, sugeriram a existência de mais dois carbonos oxigenados no anel A e permitiram definir C-6'e C-4' como as posições que sustentam metoxila (δ_H 3,83, s, 3H) e hidroxila, respectivamente, uma vez que a inversão dessas posições levaria a um único valor de deslocamento químico para os dois hidrogênios (H-3' e H-5') do anel A. Os demais carbonos da molécula foram atribuídos com o auxílio dos espectros ¹H x ¹³C- HMQC e HMBC (Tabela 2).

Análise dos espectros de RMN ¹H e ¹³C uni e bidimensionais, IV e UV, e comparações com modelos da literatura, permitiram sugerir que 2 seja 2',4'-di-hidroxi-6'-metoxichalcona (Figura 1), conhecida como cardamonina e já isolada de espécies de Piper,²² e de espécies de Fabaceae,²³ Lauraceae²⁴ e Pteridaceae.²⁵

O espectro no IV de 3 (ν_max., KBr, cm^-1) apresentou bandas de absorção em: 3.292, 1.373, 1.653, sendo as duas primeiras típicas de deformação axial de O-H em ligação de hidrogênio intramolecular e deformação angular no plano de OH, respectivamente e a terceira da presença de carbonila em ligação de hidrogênio.¹⁴ Anel aromático foi inferido a partir de bandas observadas em 1.618 e 1.568 cm^-1, referentes à deformação axial de C=C de anel aromático. Bandas intensas em 1.298 e 1.195 cm^-1 foram atribuídas a estiramento e deformação de grupo C-O.

O espectro de UV de 3 (λ_max., CH₃OH e CH₃OH + AlCl₃) apresentou uma banda de absorção em 289 nm, além de um ombro em 332 nm, sugerindo núcleo flavonoídico tipo di-hidrochalcona.¹³ O uso de AlCl₃ provocou deslocamento batocrômico das bandas II e I para 310 e 365 nm, respectivamente.

O espectro de RMN de ¹H de 3 (CD₃OD, 500 MHz), semelhante a 2, diferiu apenas quanto a ausência de sinais correspondentes a hidrogênios olefínicos α, β-carbonílicos, sugerindo a estrutura de uma di-hidrochalcona, que foi confirmada pela presença de dois tripletos em δ_H 3,28 (J=7,5 Hz, 2H) e δ_H 2,95 (J=7,5 Hz, 2H), vistos correlacionados no espectro bidimensional ¹H x ¹H - COSY. O experimento gHMBC mostrou as correlações: δ_H 3,28/δ_C 32,25; δ_C 143,22 e δ_C 205,83 e δ_H 2,95/δ_C 47,11; δ_C 143,22 e δ_C 205,83 que permitiram propor δ_H 3,28 e δ_H 2,95 para as posições α e β e atribuir δ_C 32,35; δ_C 47,11; δ_C 143,22 e δ_C 205,83 para os carbonos β, α, 1 e β', respectivamente. O espectro HMBC ainda apresentou as correlações: δ_H 5,98 (d, J=2,2 Hz, 1H)/δ_C: 166,60; 106,00; 165,08 e 97,13 e de δ_H 5,92 (d, J=2,2 Hz, 1H)/δ_C: 106,00 e 92,25, o que permitiu sugerir δ_H 5,98 e δ_H 5,92 para H-5' e H-3' e os sinais de carbono em δ_C: 166,60; 106,00; 165,08; 97,13 e 92,25 para as posições 4', 1', 6', 3' e 5', respectivamente. As correlações cruzadas δ_H 3,86 (s, 3H)/δ_C 165,08 e δ_H 3,86 (s, 3H)/δ_H 5,98 vistas, respectivamente, nos experimentos gHMBC e NOESY, corroboraram δ_H 3,86/δ_C 165,08 e δ_C 166,60 para as posições 6' e 4' e permitiram inferir δ_C 168,37 para C-2'. Os dados relatados e sumarizados na Tabela 2 permitem identificar 3 (Figura 1) como 2'-4'-di-hidroxi,6'-metoxidi-hidrochalcona, conhecida como uvangoletina²⁶ e anteriormente descrita em algumas famílias, como Myrtaceae,²⁷ Annonaceae,²⁸ Piperaceae.²⁹

O espectro no IV de 4 mostrou bandas em 3.552 cm^-1, 3.473 cm^-1 e 3.242 cm^-1, atribuídas a grupos hidroxila e deformação axial de C-H de carbonos aromáticos. Absorções na região entre 2.983 cm^-1 e 2.851 cm^-1 são oriundas de estiramento C-H de grupos metílicos, metilênicos e metínicos. Bandas devidas à deformação axial de C=C aromáticos são visíveis na região entre 1.605 cm^-1 e 1.429 cm^-1 e em 1.647 cm^-1 absorção de deformação axial de C=O. Bandas de deformação axial de C-O-C assimétrica e simétrica de alquilaril éteres foram observadas em 1.285 cm^-1, 1.200 cm^-1 e 1.114 cm^-1, sugerindo a presença de função éter no composto.

O espectro no UV, em CH₃OH, mostrou banda I em 324 nm e banda II em 288 nm, esta última de maior intensidade, o que sugere esqueleto de flavanona.¹³ A adição de acetato de sódio ao metanol provocou deslocamento batocrômico da banda II para 328 nm, numa magnitude de 40 nm, que sugeriu a presença de grupo 7-OH livre na molécula.

O espectro de RMN de ¹H de 4 (acetona-d₆, 300 MHz) mostrou sinais em δ_H 9,03 (sl, 1H), δ_H 3,79 (s, 3H) e δ_H 3,76 (s, 3H), característicos de hidroxila aromática não quelada e de duas metoxilas aromáticas, respectivamente, além de um sinal simples em δ_H 6,21 (1H), dois multipletos em δ_H 7,62-7,61 (m, 2H) e δ_H 7,59-7,36 (m, 3H) e três duplo dubletos em δ_H 5,55 (J=12,7 e 3,0 Hz, 1H); δ_H 2,97 (J=12,7 e 16,38 Hz, 1H) e δ_H 2,71 (J=16,38 e 3,0 Hz, 1H). A análise dos duplos dubletos, aliada às correlações observadas no experimento COSY entre δ_H 5,55/δ_H 2,71 e δ_H 2,97, sugeriram estes sinais para hidrogênios oxi-metínico (H-2) e metilênicos (H-3) de esqueleto flavanônico. Correlações vistas no HMQC entre δ_H 5,55/δ_C 80,16 e δ_H 2,97 e δ_H 2,71/δ_C 46,44 permitiram atribuir δ_C 80,16 e δ_C 46,44 a C-2 e C-3. Esses dados aliados à presença dos dois sinais múltiplos em δ_H 7,62-7,61 (2H) e δ_H 7,59-7,36 (3H) permitiram sugerir que o composto 4 trata-se de uma flavanona com anel B monossubstítuido e anel A pentassubstítuido com duas metoxilas e uma hidroxila.

As correlações vistas no espectro HMBC entre: δ_H 7,62-7,61/δ_C 80,16 permitiram a atribuição de δ_H 7,62-7,61/δ_C 127,14 para as posições 2'/6'; δ_H 2,71/ δ_C 188,12 e δ_H 2,97/δ_C 188,12 e 140,69 sugeriram δ_C 188,12 e 140,69 para C-4 e C-1', respectivamente. O sinal em δ_H 6.21 mostrou correlação direta, no espectro HMQC, com δ_C 94,02 e foi sugerido para H-6. No HMBC foram observadas as correlações: δ_H 6,21/δ_C 158,85; 106,55; 130,29 e 157,35; δ_H 3,76/δ_C 130,29; δ_H 3,79/δ_C 158,85, além das correlações δ_H 3,79/δ_C 56,22 e δ_H 3,76/δ_C 61,32, vistas no experimento HMQC, que permitiram sugerir δ_H 3,79/δ_C 56,22 e δ_H 3,76/δ_C 61,32, para as posições 5 e 8 e, consequentemente, δ_C: 130,29; 158,85 e 106,55 para C-8, C-5 e C-10 do anel A de 4. A posição da hidroxila em C-7 e, consequentemente, de δ 6,21 (s, 1H) para H-6 foi estabelecida a partir da análise do espectro HMBC que mostrou a correlação de δ_H 6,21/δ_C 106,55 (C-10) e δ_C 157,35 (C-7). Os espectros de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃) do derivado acetilado 4a mostraram os sinais dos átomos de carbonos das metoxilas em δ_C 56,30 e δ_C 60,95, além do sinal da acetoxila em δ_C 149,29, confirmando as posições das metoxilas em 5 e 8 e a presença de grupo OH em C-7 de 4. O sumário dos dados extraídos dos espectros analisados encontra-se na Tabela 3 e permite propor que 4 trata-se de 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona³⁰ (Figura 1), isolado pela primeira vez na família Piperaceae.

Os espectros de RMN ¹H de 5 (DMSO, 300 MHz) e 6 (Acetona-d₆, 300 MHz) mostraram sinais característicos de esqueleto flavanônico com anel B não substítuido, como em 4, diferindo apenas quanto ao padrão de substituição do anel A. O espectro de 5 apresentou quatro sinais simples em δ_H: 11,80 (1H); 8,18 (1H); 6,22 (1H) e 3,84 (3H), os dois primeiros sugestivos de substituintes hidroxílicos e o último de grupo metoxílico no anel A do esqueleto flavanônico. O sinal em δ_H 11,80 permitiu definir a presença de grupo OH-5; além disso, as correlações deste sinal com δ_C 92,58; δ_C 102,34 e δ_C 155,75; vistas no espectro HMBC (DMSO, 300 e 75 MHz), permitiram atribuí-los para C-6, C-10 e C-5 e, portanto, o sinal em δ_H 6,22 (s, 1H), que no experimento HMQC (DMSO, 300 e 75MHz) mostrou correlação com δ_C 92,58, para H-6. As posições de OCH₃ (δ_H 3,84, s, 3H) e OH (δ_H 8,18, s, 1H) foram definidas para C-7 e C-8 por meio das correlações: δ_H 6,22/δ_C 126,65 e 157,23; δ_H 3,84/δ_C 157,23 e de δ_H 8,18/δ_C 126,65, 157,23 e 148,02, vistas no experimento HMBC e, como consequência, δ_C 157,23; δ_C 126,65 e δ_C 148,02 foram definidos para os carbonos 7, 8 e 9, respectivamente. O espectro de RMN ¹H de 6 apresentou quatro sinais em δ_H : 3,71 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,94 (s, 3H) e 6,40 (s, 1H), os três primeiros característicos de metoxílas em anel aromático, o que permitiu deduzir a presença de anel A pentasubstítuido; por outro lado, o espectro bidimensional HMBC (Acetona-d₆, 300 e 75 MHz) mostrou correlações de δ_H 3,71/δ_C 131,98, δ_H 3,86/δ_C 158,74, δ_H 3,94/δ_C 159,72 e de δ_H 6,40/δ_C 159,72; 158,74; 131,98 e 107,16, que ao lado das correlações vistas no HMQC (Acetona-d₆, 300 e 75 MHz): δ_H 3,71/δ_C 60,99, δ_H 3,86/δ_C 56,45, δ_H 3,94/δ_C 56,59 e δ_H 6,40/δ_C 91,25 permitiram sugerir os sinais δ_H 3,71/δ_C 60,99 para a posição 8 do anel aromático e os demais em δ_H 3,86 e δ_H 3,94 para as posições 7 e 5, respectivamente. A flavanona 5 já foi isolada das folhas de Uvaria scheffleri,³¹ mas não de Piperaceae, e a flavanona 6 (Figura 1) é descrita pela segunda vez no gênero Piper.³²

Atividade antimicrobiana de 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4)

Os resultados para a atividade antimicrobiana são mostrados na Tabela 4. O composto 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4) mostrou atividade antibacteriana fraca contra Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. De uma forma geral, o efeito antibacteriano dos flavonoides deve-se a presença de grupos fenólicos que apresentam afinidade para as proteínas e, por essa razão, atuam como inibidores de enzimas bacterianas, assim como interferem nas suas vias de síntese.³³ Já a atividade antifúngica contra Trichophyton mentagrophytes e Microsporum canis mostrou-se bem mais promissora, com a formação de halos de inibição de 20 e 22 mm, respectivamente, valores de diâmetro próximos aos halos de inibição dos antifúngicos controle. Os flavonoides exibem uma ampla capacidade de inibir a germinação de esporos patogênicos em plantas.³⁴ Estes compostos também têm a capacidade de formar complexos com proteínas solúveis presentes nas paredes das células fúngicas e, por isso, têm sido frequentemente propostos para combater infecções causadas por fungos no homem.³⁵

Não houve inibição do crescimento para os demais microrganismos testados.

CONCLUSÃO

O estudo químico de Piper glandulosissimum Yuncker e o consequente isolamento desses compostos contribuem para uma maior compreensão da quimiossistemática do gênero Piper³ e da família Piperaceae. Este é um dos primeiros relatos de estudo químico desta espécie e os compostos isolados pertencem a um grupo de metabólitos secundários (flavonoides) que responde por cerca de 4% do montante de compostos isolados no gênero Piper. Em pesquisas anteriores com Piper montealegreanum¹⁰ e Piper carniconnectivum,¹⁰ duas espécies de Piper oriundas também da região Norte do Brasil, foram obtidos vários flavonoides, alguns deles com um ótimo potencial biológico. A continuação dos estudos químico-farmacológicos com espécies desse gênero tem se mostrado bastante promissora, pois além de novos compostos isolados na família, tem sido registradas atividades biológicas interessantes, como é o caso da atividade antifúngica obtida com o composto 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4).

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo suporte financeiro, à Dra. Maria das Graças B. Zoghbi (Museu Paraense Emílio Goeldi) pela coleta do material vegetal, à Dra. Elsie Guimarães pela identificação do material botânico, a Vicente Carlos Oliveira Costa e ao Prof. Edilberto Rocha Silveira pelos espectros de RMN.

REFERÊNCIAS

1. Marques, J. V.; Oliveira, A.; Raggi, L.; Young, M. C. M.; Kato, M. J.; J. Braz. Chem. Soc. 2010, 21, 1807. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532010001000003

2. Di Stasi, L. C.; Oliveira, G. P.; Carvalhaes, M. A.; Queiroz Jr, M.; Tien, O. S.; Kakinami, S. H.; Reis, M. S.; Fitoterapia 2002, 73, 69; Giorgetti, M.; Negri, G.; Rodrigues, E.; J. Ethnopharmacol. 2007, 109, 338. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0367-326X(01)00362-8 PMID: 11864767

3. Parmar, V.; Jain, S. C.; Bisht, K. S.; Jain, R.; Tanela, P.; Jha, A.; Tyagi, O. D.; Prasad, A. D.; Wengel, J.; Olsen, C. E.; Boll, P. M.; Phytochemistry 1997, 49, 597; DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(97)00328-2

. Wu, Q-L.; Wang, S-P.; Tu, G. Z.; Feng, Y.; Yang, J. S.; Phytochemistry 1997, 44, 727; DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(96)00585-7

. Yamaguchi, L. F.; Lago, J. H. G.; Tanikazi, T. M.; Mascio, P. D.; Kato, M. J.; Phytochemistry 2006, 67, 1838. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2006.03.001 PMID: 16624353

6. http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB24230, acessada em Junho 2014.

7. Lizcano, L. J.; Bakkali, F.; Ruiz-Larrea, M. B.; Ruiz-Sanz, J. I.; Food Chem. 2009, 119, 1566. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.09.043

8. Lizcano, J. L.; Bernal, M. V.; Vicente, F.; Berrueta, L. A.; Gallo, B.; Martínez-Cañamero, M.; Ruiz-Larrea, M. B.; Ruiz-Sanz, J. I.; Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 5454. DOI: http://dx.doi.org/10.3390/ijms13055454 PMID: 22754307

9. Erade, E. H. A.; Zoghbi, M. das G. B.; J. Essent. Oil Res. 2007, 19, 401. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/10412905.2007.9699935

10. Alves, H. S.; Souza, M. F. V.; Chaves, M. C. O.; J. Braz. Chem. Soc. 2011,22, 1610; Alves, H. S.; Oliveira, G. E.; Zoghbi, M. G.; Chaves, M. C. O.; Braz. J. Pharmacogn. 2010, 20, 160. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532011000800026

11. Chaves, M. C. O.; da Cunha, E. V. L.; Gray, A. I.; Phytochemistry 1997, 44, 559; Chaves, M. C. O.; Santos, B. V. O.; Biochem. Syst. Ecol. 1999, 27, 113; Chaves, M. C. O.; Santos, B. V. O.; Oliveira, A. H.; Biochem. Syst. Ecol. 2003, 31, 1213. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(96)00503-1

12. Chaves, M. C. O.; Araújo Júnior, J. X.; da Cunha, E. V. L.; Gray, A. I.; Biochem. Syst. Ecol. 1999, 27, 325; Chaves, M. C. O.; Cardozo Júnior, E. L.; Pharm. Biol. 2003, 41, 216. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0305-1978(98)00049-0

13. Mabry, T. J.; Markham, K. R.; Thomas, M. B.; The Systematic Identification of Flavonoids. Springer-Verlag: New York, 1970, 354 p.

14. Silva, T. M. S; Carvalho, M. G.; Braz-Filho, R.; Quim. Nova 2009,32, 1119. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422009000100025

15. Bauer, A. W.; Kirby, W. M.; Sherris, J. C.; Tueck, M.; Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45, 493. PMID: 5325707

16. Cleland, R.; Squires, E.; Antibiotics in Laboratory Medicine, 3th ed., Willians & Wilkins: Baltimore, 1991; Hadacek, F.; Greger, H.; Phytochem. Anal. 2000, 11, 137.

17. Catao, R. M. R.; Barbosa-Filho, J. M.; Gutierrez, S. J. C.; Lima, E. O.; Pereira, M. S. V.; Arruda, T. A.; Antunes, R. P. M. A.; Rev Bras. Anal. Clin. 2005, 37, 247.

18. Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Introduçao à espectroscopia, 4ª ed, Cengage Learning: Sao Paulo, 2010, 700 p.

19. Bohm, B. A.; Biochem. Syst. Ecol. 1999, 27, 755. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0305-1978(98)00062-3

20. Maradufu, A.; Ouma, J. H.; Phytochemistry 1978, 14, 823. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(00)94251-1

21. Silverstein, R. M.; Bassler, G. C.; Morril, T. C.; Identificaçao espectrométrica de compostos orgânicos, 6ª ed., LTC Editora: Rio de Janeiro 2000, 460 p.

22. Terreaux, C.; Gupta, M. P.; Hostettmann, K.; Phytochemistry 1998, 49, 461. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(98)00197-6

23. Bohlmann, F.; Planta Med. 1984, 50, 271. DOI: http://dx.doi.org/10.1055/s-2007-969699 PMID: 17340312

24. Jakupovic, J.; Kuhnke, J.; Schuster, A.; Metwaaly, M. A.; Bohlmann, F.; Phytochemistry 1986, 25, 1133. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0031-9422(00)81569-1

25. Jaipetch, T.; Aust. J. Chem. 1982, 35, 351. DOI: http://dx.doi.org/10.1071/CH9820351

26. Cheenpracha, S.; Karalai, C.; Ponglimanont, C.; Subhadhirasakul, S.; Tewtrakul, S.; Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1710. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2005.10.019 PMID: 16263298

27. Kuo, Y. C.; Yang, L. M.; Lin, L. C.; Planta Med. 2004, 70, 1237. DOI: http://dx.doi.org/10.1055/s-2004-835859 PMID: 15643565

28. Ichimaru, M.,; Nakatani, N.; Takanashi, T.; Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Kato, A.; Mathenge, S. G.; Juma, F. D.; Nganga, J. N.; Chem. Pharm. Bull. 2004, 52, 138. DOI: http://dx.doi.org/10.1248/cpb.52.138 PMID: 14709883

29. Isobe, T.; Ohsaki, A.; Nagata, K.; J. Pharm. Soc. Jpn. 2002, 122, 291 (CA 137:291662)

30. Lopez, S. N.; Sierra, M. G.; Gattuso, S. J.; Furlan, R. L.; Zacchino, S. A.; Phytochemistry, 2006, 67, 2152 ; Bratoeff, E. A.; Perez-Amador, M. C.; Phyton 1994, 55, 71. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2006.06.018 PMID: 16884749

31. Moshi, M.; Joseph, C.; Innocent, E.; Pharm. Biol. 2004, 42, 269. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/13880200490511035

32. Vieira, P.; De Alvarenga, M. A.; Gottlieb, O. R.; Gottlieb, H. E.; Planta Med. 1980, 39, 153. DOI: http://dx.doi.org/10.1055/s-2008-1074918

33. Alcaráz, L. E.; Blanco, S. E.; Puig, O. N.; Tomás, F.; Ferreti, F. H.; J. Theor. Biol. 2000, 205, 231; Avila, P. H.; Smânia, E. F. A.; Monache, F. D.; Júnior, A. S.; Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 9790; Li, Y.; Luo, Y.; Hu, Y.; Zhu, D. D.; Zhang, S.; Liu, Z. J.; Gong, H. B.; Zhu, H. L; Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 4316. DOI: http://dx.doi.org/10.1006/jtbi.2000.2062 PMID: 10873434

34. Tiwari, V. K.; Opportunity, challenge and scope of Natural Products in Medicinal Chemistry. 1^st ed., Research Signpost: Trivandrum, 2011, chap. 9.

35. Salas, P. M.; Céliz, G.; Geronazzo, H.; Daz, M.; Resnik, S. L.; Food Chem. 2011, 124, 1411. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.07.100