JBCS

INTRODUÇAO

Os compostos orgânicos etilbenzeno, estireno, tolueno e xileno sao amplamente utilizados como solventes em indústrias de plástico, resina, borracha e farmacêutica.^1-4 Também sao constituintes de combustíveis, tintas, vernizes e colas.^4-6 Trabalhadores expostos a níveis elevados desses solventes podem apresentar efeitos adversos, como irritaçao (da pele e do trato respiratório), alteraçoes do sistema nervoso central, alteraçoes funcionais nos nervos ótico e óptico.⁵ Portanto, a monitorizaçao da exposiçao, tanto ambiental quanto biológica, sao atividades complementares e fundamentais na prevençao de tais efeitos. A monitorizaçao ambiental avalia o risco à saúde do indivíduo exposto através da concentraçao dos solventes na zona respiratória, comparando-a aos Limites de Exposiçao Ocupacional. Por sua vez, a monitorizaçao biológica pode avaliar a dose interna do composto para verificar se a exposiçao do trabalhador está em níveis aceitáveis, por comparaçao com o respectivo Limite para o Indicador Biológico utilizado. Para os solventes, os marcadores biológicos (ou indicadores biológicos) podem ser a própria substância ou os seus metabólitos presentes em matrizes biológicas.⁷

A principal via de absorçao do etilbenzeno, estireno, tolueno e xileno é a via respiratória e a eliminaçao ocorre, principalmente, através dos metabólitos urinários.⁵ Os principais metabólitos do etilbenzeno e do estireno sao o ácido mandélico (AM) e o ácido fenilglioxílico (AFG). No entanto, esses metabólitos nao sao indicadores específicos, pois também sao formados quando há exposiçao a outras substâncias, por exemplo, estirenoglicol, óxido de estireno, fenilglicol, acetofenona, fenilglicina.⁵ O principal metabólito urinário do orto-, meta- e para-xileno sao os ácidos orto-, meta- e para-metil hipúricos (o-, m- e p-AMH), respectivamente, os quais sao completamente excretados dentro de 1 ou 2 dias depois da exposiçao, fato que limita a utilizaçao desses metabólitos como indicadores biológicos apenas a exposiçoes recentes.⁸ Para o tolueno, o principal metabólito é o ácido hipúrico (AH). Os valores de referência (VR) e os índices biológicos máximos permitidos (IBMP) desses indicadores biológicos estabelecidos pela Norma Regulamentadora nº 7 (NR-7) e os BEIs^® - Biological Exposure Indices propostos pela ACGIH (American Conference of Governmental Industrial Hygienists) - sao apresentados na Tabela 1.^5,9

Este estudo teve por objetivo desenvolver e validar um método simples para análise simultânea de AFG, AM, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH em urina por cromatografia líquida de alta eficiência com detecçao por ultravioleta (CLAE-UV).

Esta Nota Técnica foi apresentada no 8º Congresso de Extensao Universitária da UNESP e seu resumo expandido encontra-se disponível online.¹⁰

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes

Os padroes do ácido fenilglioxílico (AFG, 97%), ácido mandélico (AM, 99%), ácido hipúrico (AH, 98%), ácido metil hipúrico (orto-AMH, meta-AMH e para-AMH, 98%) e fenacetina (padrao interno) foram obtidos da Sigma Aldrich (St Louis, MO, EUA). Os solventes metanol (J.T. Baker, Ecatepec, Estado do México, México), acetato de etila (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA), diclorometano (J. T. Baker, Center Valley, PA, EUA) e acetonitrila (J.T. Baker, Center Valley, PA, EUA) utilizados foram grau CLAE. O ácido o-fosfórico 85% (Synth, Diadema, Brasil), fosfato de sódio monobásico (Synth, Diadema, Brasil) e ácido clorídrico 37% (Qhemis, Brasil) sao reagentes de grau analítico. A água utilizada em todas as soluçoes foi obtida através de um sistema de purificaçao Milli-Q Plus (Millipore, Belford, MA, EUA).

As soluçoes-padrao estoque foram preparadas separadamente dissolvendo os padroes em metanol para obter a concentraçao de 14 mg mL^-1 de AFG e AM e 20 mg mL^-1 de AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH. O padrao interno fenacetina foi preparado na concentraçao de 2 mg mL^-1 em metanol. Os padroes de calibraçao foram preparados diluindo as soluçoes-padrao estoque em metanol para obter concentraçoes variando de 400 a 2000 µg mL^-1 para AFG e AM (400, 800, 1200, 1400 e 2000 µg mL^-1) e de 600 a 2800 µg mL^-1 para AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH (600, 1000, 1400, 1960, 2800 µg mL^-1).

Instrumentaçao

A análise dos metabólitos foi realizada por CLAE-UV utilizando um cromatógrafo líquido de alta eficiência Perkin Elmer, composto de um sistema binário de bombas Flexar LC Pump, degaseificador e detector Flexar UV/VIS. A coluna utilizada foi Brownlee C18 SSP (100 × 3,0 mm; 2,7 µm) da Perkin Elmer. O sistema de cromatografia foi controlado pelo programa Chromera UV/Vis (Perkin Elmer). A mistura de tampao fosfato 5 mM (pH 2,6):acetonitrila (92:8 v/v) foi utilizada como fase móvel, em fluxo de 0,6 mL min^-1. A detecçao por ultravioleta foi realizada a 254 nm nos primeiros 3,0 min e a 225 nm até o final da análise para todos os metabólitos.

Preparo das amostras

Alíquotas de 200 µL de urina e 20 µL de soluçao de fenacetina 2 mg mL^-1 (padrao interno) foram adicionadas em um microtubo de 2 mL. A amostra foi acidificada com 20 µL de ácido clorídrico 1 M e submetida à extraçao líquido-líquido com 1 mL da mistura de diclorometano:acetato de etila (70:30, v/v). As amostras foram agitadas por 30 min e posteriormente centrifugadas a 10.600 × g por 10 min, a 4 ºC. Seiscentos microlitros da fase orgânica foram evaporados a secura em banho seco a 70 ºC. O resíduo foi reconstituído com 600 µL de fase móvel, filtrado em membrana de 0,45 µm (Analítica, Sao Paulo, Brasil) e uma alíquota de 20 µL do filtrado foi injetada no sistema CLAE-UV.

Curvas de calibraçao e linearidade

Três curvas de calibraçao para análise de AFG, AM, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH foram preparadas em alíquotas de 200 µL de urina branco coletada de indivíduos nao expostos aos solventes precursores dos metabólitos em estudo enriquecidas com 50 µL de cada padrao de calibraçao. As curvas de calibraçao incluíram a análise de amostra branco e amostras com as seguintes concentraçoes finais de 100, 200, 300, 350 e 500 µg mL^-1 para AFG e AM; 150, 250, 350, 490 e 700 µg mL^-1 para AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH em urina. As amostras da curva de calibraçao foram processadas e analisadas conforme descrito previamente.

Controles de qualidade foram preparados enriquecendo amostras de urina branco com três diferentes níveis de concentraçao (100, 200 e 420 µg mL^-1 para AFG e AM; 140, 250 e 588 µg mL^-1 para AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH).

Limites de detecçao (LD) e quantificaçao (LQ)

Os limites de detecçao e de quantificaçao foram obtidos como recomenda o National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH).¹¹ Em resumo, foram preparados padroes de calibraçao de baixa concentraçao em metanol variando de 100 a 2000 µg mL^-1 para AFG, 6 a 120 µg mL^-1 para AM, 4 a 80 µg mL^-1 para AH e 30 a 600 µg mL^-1 para o-AMH, m-AMH e p-AMH. Três curvas de calibraçao foram preparadas em alíquotas de 200 µL de urina branco coletada de indivíduos nao expostos enriquecidas com 50 µL de cada padrao de calibraçao de baixa concentraçao. A triplicata da curva de calibraçao de baixa concentraçao foi utilizada para obter a equaçao de regressao linear (Equaçao 1) e o erro padrao da regressao (Sy) (Equaçao 2). O erro padrao da regressao e o coeficiente angular da equaçao de regressao linear foram usados para o cálculo do limite de detecçao (Equaçao 3). O limite de quantificaçao foi calculado como 3,33 vezes o limite de detecçao (Equaçao 4).

onde: Ŷ_i é a resposta predita de cada concentraçao do analito (X); Y_i é a resposta obtida (Y); N é o número de padroes de calibraçao de baixa concentraçao (N=5)

Recuperaçao

A recuperaçao foi determinada enriquecendo alíquotas de 200 µL de urina branco com concentraçoes finais na urina de 200 e 350 µg mL^-1 de AFG e AM, 250 e 490 µg mL^-1 de AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH, e 20 µL de soluçao de fenacetina (2 mg mL^-1). As amostras (n=5) foram extraídas como descrito anteriormente. A recuperaçao foi calculada comparando a área dos picos das amostras extraídas conforme o protocolo analítico com a área obtida a partir das soluçoes-padrao de mesma concentraçao nao submetidas ao processo de extraçao, sendo esta última considerada 100%.

Precisao e exatidao

A precisao e exatidao intra e interensaios foram investigadas utilizando os controles de qualidade de baixa (CQB), média (CQM) e alta (CQA) concentraçao analisados em quintuplicata em 3 dias diferentes. A precisao foi expressa como desvio padrao relativo (coeficiente de variaçao, CV) (Equaçao 5) e a exatidao como erro padrao relativo (EPR) (Equaçao 6).

RESULTADOS E DISCUSSAO

No presente estudo, foi desenvolvido e validado um método utilizando CLAE-UV capaz de analisar simultaneamente os indicadores biológicos de exposiçao aos solventes etilbenzeno, estireno, tolueno e xileno. Vários métodos para analisar AFG, AM, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH na urina foram descritos na literatura, porém poucos sao capazes de analisar todos os metabólitos simultaneamente.^4,6,12-14 Os métodos que utilizam cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas têm sido amplamente utilizados. Entretanto, tais métodos exigem um processo de derivatizaçao durante o preparo da amostra.^4,13 Entre os métodos que utilizam a cromatografia líquida para a análise simultânea dos mesmos analitos, há aquele em que a separaçao dos analitos foi observada apenas após 50 minutos,¹² aquele que utiliza grande volume de amostra (2 mL) e solventes orgânicos ou nao utilizam padrao interno.^6,12,14

A Figura 1 apresenta os cromatogramas obtidos com o presente método. Os metabólitos foram completamente separados em menos de 30 minutos, com exceçao do m-AMH e p- AMH, os quais coeluem (Figura 1A). No entanto, a separaçao completa desses isômeros nao se faz necessária para a presente aplicaçao, uma vez que é recomendado o uso da soma dos isômeros do AMH como indicador biológico para a exposiçao a xilenos.^5,9 O método mostrou-se seletivo, uma vez que nao foram observados picos interferentes no tempo de retençao dos metabólitos, como pode ser observado ao comparar o cromatograma de uma urina branco (Figura 1C) com o cromatograma da soluçao-padrao (Figura 1B). Para que um método seja considerado seletivo, as respostas de picos interferentes próximo ao tempo de retençao do analito devem ser inferiores a 20% da resposta do analito nas amostras de LIQ.

Figura 1. Cromatogramas dos seis metabólitos obtidos com o presente método (a) Urina nao exposta enriquecida com soluçao-padrao (300 µg mL^-1 de AFG e AM e 350 µg mL^-1 de AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH), (b) Soluçao-padrao (300 µg mL^-1 de AFG e AM e 350 µg mL^-1 de AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH) e (c) Urina branco [1. AFG, 2. AM, 3. AH, 4. o-AMH, 5. m-AMH, 6. p-AMH, 7. Fenacetina (P.I.)]

A análise de uma urina branco proveniente de indivíduo nao exposto ao tolueno apresenta um pico de AH (Figura 1C), que foi encontrado na urina humana provavelmente devido ao consumo de alimentos que contêm ácido benzoico ou benzoato como conservador.^5,15-16 Esse conservador está presente em refrigerantes, sucos de frutas, margarina, molho de tomate, enlatados.^17-19 Um estudo identificou os refrigerantes como a principal fonte de benzoato no Brasil, representando mais de 80% da ingestao diária do conservador.¹⁷ O ácido benzoico ou benzoato é metabolizado no fígado e nos rins formando o AH.²⁰ A alimentaçao e a variaçao interindividual no metabolismo do ácido benzoico influenciam diretamente na quantidade basal de AH presente na urina. A ACGIH, atualmente, nao recomenda o uso do AH como indicador biológico para a exposiçao a tolueno, pois a elevada quantidade basal de AH pode dificultar a interpretaçao no limite de exposiçao atualmente recomendado para o tolueno, de 75 mg m^-3. No entanto, no Brasil a legislaçao ainda prevê o uso do AH como indicador biológico de exposiçao ao tolueno.⁹ Vale ressaltar que a legislaçao brasileira referente aos indicadores biológicos de exposiçao ao tolueno nao é atualizada desde 1994.⁹

Trabalhos anteriores sugerem realizar a análise de AFG a 254 nm, pois o metabólito apresenta uma resposta melhor do que a 225 nm.^12,21 Nos cromatogramas apresentados na Figura 2 é possível observar a diferença na resposta do AFG quando analisado a 225 nm (Figura 2A) e a 254 nm (Figura 2B). Portanto, o presente método propoe a análise do AFG a 254 nm e os demais metabólitos a 225 nm.

Figura 2. Cromatogramas utilizando diferentes comprimentos de onda (a) Análise utilizando apenas λ = 225 nm e (b) Análise utilizando λ = 254 nm nos primeiros 3 min e λ = 225 nm a partir dos 3 min até o final da corrida [1. AFG, 2. AM, 3. AH, 4. o-AMH, 5. m-AMH, 6. p-AMH, 7. Fenacetina (P.I.)]

A curva de calibraçao foi gerada através do gráfico da razao entre área do analito/área do padrao interno vs. a concentraçao do analito. As curvas de calibraçao para o AFG, AM, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH em urina enriquecida foram lineares nos intervalos de concentraçao estudados (Tabela 2).

O ensaio de recuperaçao está relacionado a eficiência da extraçao e foi superior a 65% para todos os metabólitos e o padrao interno e nao variou em funçao da concentraçao (Tabela 3). Embora a porcentagem de recuperaçao próxima a 100% tanto para o analito como para o padrao interno seja desejável, porcentagens inferiores sao admitidas desde que a recuperaçao seja reprodutível entre diferentes concentraçoes do analito. Os limites de detecçao e quantificaçao foram calculados a partir da equaçao de regressao linear e do erro padrao da regressao. Os limites de detecçao obtidos para AFG, AM, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH foram de 19,83 µg mL^-1, 1,73 µg mL^-1, 4,12 µg mL^-1, 3,93 µg mL^-1, 3,29 µg mL^-1 e 7,29 µg mL^-1, respectivamente (Tabela 2) e sao compatíveis com a aplicaçao do método para avaliaçao biológica da exposiçao ocupacional aos solventes estireno, etilbenzeno, xilenos e tolueno.

Alíquotas de urina coletada de indivíduo nao exposto foram enriquecidas com AFG, AM, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH e analisadas em quintuplicata para determinar a precisao e exatidao intra e interensaio. Todos os metabólitos apresentaram coeficiente de variaçao menor que 15%. A exatidao, expressa como erro padrao relativo, apresentou variaçao menor que 12,3% para os três níveis de concentraçao testados (Tabela 4).

CONCLUSAO

Foi desenvolvido e validado um método utilizando CLAE-UV capaz de analisar simultaneamente os indicadores biológicos AM, AFG, AH, o-AMH, m-AMH e p-AMH em urina. A sensibilidade, precisao e exatidao do método mostraram-se compatíveis com a sua aplicaçao na monitorizaçao biológica da exposiçao ocupacional aos solventes etilbenzeno, estireno, tolueno e xileno conforme recomendado pela NR-7 e ACGIH.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Pró-Reitoria de Extensao Universitária da UNESP (PROEX) e a Coordenadoria de Saúde e Segurança do Trabalhador e Sustentabilidade Ambiental (COSTSA).

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10. Esta Nota Técnica foi apresentada no 8º Congresso de Extensao Universitária da UNESP e seu resumo expandido encontra-se disponível no endereço http://200.145.6.205/index.php/congressoextensao/8congressoextensao/paper/viewFile/322./182

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