JBCS

INTRODUÇAO

A própolis é uma mistura complexa produzida pela abelhas a partir de diversas substâncias coletadas de diversas partes das plantas como botoes florais, exsudatos e brotos.¹ As abelhas utilizam a própolis para proteger a colmeia contra agente invasores, embalsamar animais, manter a temperatura agradável e para o preparo de locais assépticos para a postura da abelha rainha.² Sua coloraçao é variável e depende da regiao que foi coletada, seu odor é característico e variável, entretanto algumas amostras nao possuem odor, apresenta ponto de fusao na faixa de 60-70 ºC, sendo que alguns casos seu ponto de fusao pode chegar até 100 ºC.²

Há relatos da utilizaçao da própolis na medicina popular desde a antiguidade. Na Idade Média era comum utilizar o própolis no umbigo dos bebês para fins de cicatrizaçao.³ Durante a Segunda Guerra Mundial era utilizada em clínicas russas no tratamento de ferimentos e, foi amplamente utilizada na antiga URSS tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária no tratamento da tuberculose.⁴ Diversas atividades biológicas já foram relatadas à própolis tais como antioxidante, antitumoral, anti-inflamatória, antibacteriana, antiviral e antifúngica.⁵ Comercialmente é encontrada em várias preparaçoes como comprimidos, pastilhas, dentifrícios, loçoes, cremes faciais, tinturas, pomadas.⁶

A composiçao química da própolis é variável e depende da variedade genética da abelha que a produziu⁷ e da biodiversidade da regiao visitada pelas abelhas.⁸ Os compostos fenólicos, com a predominância dos flavonoides, sao os compostos que sao isolados com mais frequência em amostras de própolis,⁹ entretanto já foram relatados triterpenoides, benzofenonas, esteroides, ácidos graxos, hidrocarbonetos, cetonas, aminoácidos, vitaminas A, B₁, B₂, B₆, C e E e minerais como Mg, Cu, Ca, Al, V, Ni, Zn, Cr.¹⁰ Este trabalho descreve a avaliaçao da atividade antioxidantes e citotóxica da própolis produzida na Bahia bem como a composiçao química do extrato hexânico.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os solventes utilizados no preparo dos extratos e nas eluiçoes cromatográficas (hexano, acetato de etila, diclorometano, clorofórmio, metanol) foram de grau analítico marca Qhemis. Nos procedimentos de purificaçao por cromatografia em coluna (CC) os adsorventes utilizados como fase estacionária foram gel de sílica 60 da Merck e Acros com diâmetro de partículas entre 0,063-0,200 mm e 0,040-0,063 mm. Para a cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), foram utilizadas placas de 20x20 cm de gel de sílica 60 F₂₅₄ da Merck para reunir as fraçoes oriundas da cromatografia em coluna. Para o isolamento de substâncias por cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram utilizadas placas de gel de sílica 60 F₂₅₄ de 1 mm de espessura da Merck. As placas foram reveladas por radiaçao com luz UV (254 e 336 nm) e vapores de iodo. Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C foram registrados em espectrometro da Varian, modelo GEMINI 2000 operando a 300 MHz para hidrogênio e 75,5 MHz para ¹³C, utilizando-se CDCl₃ como solvente e o sinal do resíduo de cloroformio em relaçao ao tetrametilsilano (TMS) como referência. Os cromatogramas foram obtidos em um cromatógrafo à gás acoplado à espectometria de massas de baixa resoluçao da Shimadzu, com detector seletivo de massas, modelo QP 2010. Para a realizaçao das análises utilizou-se o método onde a temperatura do injetor foi 290 ºC com temperatura inicial de 50 ºC por 1 min, aumentando de 50 ºC a 180 ºC na razao de 15 ºC/min, e de 180 ºC a 230 ºC na razao de 7 ºC/min, e de 230 ºC a 250 ºC na razao de 15 ºC/min, permanecendo nessa temperatura por 10 min. Em seguida, a temperatura passou de 250 ºC para 285 ºC na razao de 4 ºC/min. A temperatura final permaneceu em 285 ºC por 40 min. A temperatura do detector foi de 290 ºC e a temperatura na interface do sistema CG-EM foi de 290 ºC. O detector de massas operou com ionizaçao por impacto de elétrons (70 eV) e varredura de massas entre o intervalo de 35 a 1000 Da.

Coleta da própolis

A própolis marrom foi cedida pelo Prof. Ednildo Andrade Torres da Universidade Federal da Bahia diretamente na colmeia das abelhas Apis melifera, em janeiro de 2008, na apícola localizada na fazenda experimental Naturapi no município de Entre Rios, Bahia.

Extraçao e isolamento dos constituintes

A amostra de própolis (141,18 g) foi submetida à extraçao através de maceraçao por 48 horas utilizando 2 L de hexano como líquido extrator. O procedimento foi realizado por três vezes consecutivas, e o filtrado obtido em cada etapa foi reunido e concentrado sob pressao reduzida, obtendo-se assim o extrato hexânico da própolis (34,91 g). As tortas obtida após extraçao com hexano foram posteriormente submetidas à maceraçao com 2 L de MeOH, três vezes consecutivas, com cerca de 48 h cada, e o filtrado obtido em cada etapa foi reunido e concentrado sob pressao reduzida, originando o extrato metanólico da própolis que foi dissolvido em MeOH/H₂O (7/3) e particionado com clorofórmio, dando origem a fases clorofórmica (53,22 g) e hidrometanólica (2,2 g).

O extrato hexânico foi submetido a fracionamento por CC sob sílica gel 60 utilizando-se inicialmente hexano como fase móvel e em seguida misturas de hex/AcOEt em gradiente de polaridade. Foram obtidas 38 fraçoes que foram agrupadas após análise em CCDC. A fraçao 1, foi submetida à análise por CG-EM para identificaçao dos componetes da mistura. A fraçao reunida 6 (64 mg) coletada em hex/AcOEt (8:2) submetida submetido à fracionamento por CC de sílica gel 60, utilizando a misturas de hex/AcOEt em gradiente de polaridade como fase móvel foi possível isolar o composto 5 (15 mg). A fraçao reunida 7, coletada em hex/AcOEt (7:3), forneceu composto 6 (13 mg) após separaçao por cromatografia em camada delgada preparativa CCDP, utilizando-se hex/AcOEt (8:2) como fase móvel.

A fase clorofórmica, 53,22 g, até o presente momento, submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 como fase estacionária e fase móvel mistura de hex/AcOEt em gradiente crescente de polaridade forneceu 37 fraçoes de 200 mL cada, que foram reunidas em 20 fraçoes após serem analisadas por CCDC. A partir da fraçao reunida 5 foi possível isolar 7 (18 mg) após separaçao por CCDP utilizando-se a mistura de hex/AcOEt (9:1) como fase móvel.

Ensaio de sequestro de radicais DPPH

Os extratos metanólico e hexânico da própolis foram submetidos a teste de atividade antioxidante in vitro, utilizando-se a metodologia do sequestro de radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila).¹¹

Preparou-se 50 mL de uma soluçao metanólica de DPPH (45 µg mL^-1) em seguida preparou-se soluçoes metanólicas dos extratos em 5 concentraçoes (20, 50, 100,150, 200 µg mL^-1), sendo que o ácido gálico foi utilizado como padrao. Para realizaçao dos testes foram utilizados 3 mL de soluçao de DPPH com 1 mL da amostra, após 15 minutos de incubaçao as absorvâncias foram medidas a 517 nm em um espectrofotômetro de microplacas (Biotek, USA). Para zerar o equipamento preparou-se o branco com 3 mL de DPPH e 1 mL de metanol. Todas as reaçoes foram realizadas a temperatura ambiente e em local protegido da luz. Todas as análises foram realizadas em triplicatas. O IC₅₀ foi calculado utilizando software ED50v10 para Microsoft Excel Add Ins fornecido pelo espectrofotômetro.

Bioensaio de letalidade dos extratos sobre Artemia salina

O ensaio de toxicidade sobre Artemia salina Leach foi realizado de acordo com a metodologia descrista na literatura.¹² Foram preparadas 5 soluçoes de (50, 75, 100, 150 e 200 µg mL^-1) dos extratos hexânico, metanólico e clorofórmico da própolis.

Os ovos de Artemia salina foram eclodidos em um aquário retangular, utilizando-se soluçao salina 3,8 g L^-1 obtida de acordo com as especificaçoes do fabricante. O sistema foi aerado com bomba específica. O aquário foi construído com uma divisao interna de acrílico contendo vários orifícios, produzindo dois compartimentos nao equivalentes em tamanho. Os ovos foram adicionados no compartimento menor, previamente escurecido utilizando-se papel alumínio. O compartimento maior foi externamente iluminado com lâmpada 60 W, de modo a atrair os náuplios de Artemia para este compartimento, após a eclosao.

Após 48 horas foram transferidos 10 náuplios para cada frasco, utilizando pipeta Pasteur esterilizada e, o volume dos frascos completados até 5 mL com água do mar artificial. As amostras bem como os controles foram mantidos sob iluminaçao por 24 horas e o número de organismos sobreviventes foram determinados com auxílio de uma lupa. Todos os experimentos, inclusive os de controle foram realizados em triplicata. Os dados obtidos foram processados e os valores de CL₅₀ foram calculados usando o método de Probit.

Cinamato de sitosterila, 5

RMN ¹³C [75 MHz, CDCl₃ δ (ppm)]: 166,41 (C-9'), 144,41 (C-7') 139,69 (C-5), 134,54 (C-1'), 130,15 (C-4'), 128,85 (C-3' e C-5'), 128,03 (C-2' e C-6'), 122,72 (C-6), 118,71 (C-8'), 74,10 (C-3), 56,70 (C-14), 56,03 (C-17), 50,05 (C-9), 45,84 (C-24), 42,32 (C-4 e C-13), 39,73 (C-12), 37,03 (C-1), 36,63 (C-10), 36,15 (C-20), 33,94 (C-22), 33,70 (C-23), 31,92 (C-7 e C-8), 31,88 (C-2), 28,25 (C-16), 26,01 (C-25), 24,29 (C-15), 23,06 (C-28), 21,04 (C-11), 19,81 (C-27), 19,35 (C-19), 19,03 (C-21 e C-26), 11,86 (C-18 e C-29)

Cinamato de metila, 6

RMN ¹H (300 MHz) CDCl₃ δ (ppm)]: 7,77 (1H, d, J=15,7 Hz, H-3), 7,62 (1H, m, H-7), 7,50 (2H, m, H-6 e H-8), 7,36 (2H, m, H-5 e H-9), 6,52 (1H, d, J=15,7 Hz, H-2), 3,80 (3H, s, O-CH₃). RMN ¹³C (75 MHz) CDCl₃ δ (ppm)]: 167,39 (C-1), 144,84 (C-3), 134,32 (C-4), 130,25 (C-7), 128,84 (C-6 e C-8), 128,02 (C-5 e C-9), 117,75 (C-2), 51,68 (C-10).

Ananixantona, 7

RMN ¹H (300 MHz) CDCl₃ δ (ppm)]: 13,20 (1H, s, C-1, OH), 7,80 (1H, dd, J=7,5 e 1,8 Hz, H-8), 7,32 (1H, dd, J= 6,3 e 1,8, H-6), 7,26 (1H, t, J=7,5 Hz, H-7), 6,82( 1H, d, J=10, H-11), 5,66(1H, d, J=10, H-12), 5,26( 1H, t, J= 2,0, H-17), 3,38 (2H, d, J=6,9, H-16), 1,80( 3H, s, H-19), 1,69 (3H,s, H-20), 1,50 (3H, s, H-14 ou H-15), 1,25 (3H, s, H-14 ou H-15). RMN ¹³C (75 MHz) CDCl₃ δ (ppm)]: 180,96 (C-9), 160,74 (C-1), 159.00 (C-3), 149,85 (C-4a), 144,34 (C-5 ou C-10a), 132,10 (C-18), 127,30 (C-12), 123,89 (C-7), 122,15 (C-2), 121,88 (C-17), 121,15 (C-8a), 120,17 (C-6), 117,02 (C-8a), 115,03 (C-11) 103,60 (C-9a), 100,67 (C-4), 78,05 (C-13), 28,15 (C-14 e C-15), 25,80 (C-19), 21,21 (C-16), 17,90 (C-20).

RESULTADOS E DISCUSSAO

No cromatograma de íons totais obtido por CG (Figura 1) da fraçao 5 foram registrados quatro picos majoritários com diferentes tempos de retençao, e cada um deles originou um espectro de massas. O pico em 18,5 min. originou um íon molecular m/z 212, o pico em 20,7 min. originou um íon molecular m/z 226, o pico em 24 min. originou um íon molecular m/z 240 e o pico em 34,5 min. originou um íon molecular m/z 324, esses íons moleculares correspondem ao pentadecano 1, hexadecano 2, heptadecano 3 e ao tricosano 4.

Figura 1. Cromatograma de íons totais da fraçao obtida do extrato hexânico da própolis da Bahia

A identificaçao dos hidrocarbonetos foi realizada através da avaliaçao dos íons moleculares, indice de retençao e fragmentaçoes e com a comparaçao dos espectros de massas obtidos com os da biblioteca NIST 147 e WILEY 8 com similaridade acima de 95%. Esses compostos sao comumente encontrados em ceras de abelhas, além disso, já foram identificados em diversos tipos de própolis. Desta forma, pode-se admitir que a provável composiçao de compostos alifáticos presentes no extrato hexânico seja a mistura desses hidrocarbonetos.

O espectro de RMN ¹H do composto 5 apresentou sinais na regiao entre δ 0,70 a 1,26 característicos aos grupos metílicos do sistema esteroidal (CH₃-18, CH₃-19, CH₃-21, CH₃-26, CH₃-27, CH₃-29). A presença de um multipleto em δ 4.75 indica a presença de um hidrogênio oximetínico que, pelo deslocamento indica que a hidroxília encontra-se esterificada, pois o valor de H-3 no sitosterol é em campo mais baixo (δ ~3,3). O dubleto em δ 5,41 (J=4,5 Hz) é característico de hidrogênio olefínico H-6 do sistosterol. Os dubletos em δ 6,40 e 7,65 apresentando J=15,9 Hz sao indicativos de sistema olefínico com configuraçao trans e os sinais na regiao entre δ 7,37 e 7,70, integrando para 5H indicam a presença de um anel aromático monossubstituido.

O espectro de RMN de ¹³C corrobora a existência de um carbono oximetínico em δ 74,10, que também encontra-se mais desblindado quando comparado com o C-3 do β-sitosterol devido esterificaçao com o grupo cinamoila. Os carbonos olefínicos em δ 139,41 e 122,71 referentes à (C-5 e C-6), respectivamente, corroboram com a estrutura esteroidal da substância. O registro de um sinal em δ 166,41 referente à carbono acila, confirma que a substância é um derivado esterificado do ácido cinâmico com sitosterol. Além disso, estes dados comparados a valores descritos na literatura¹³ do β-sitosterol permitiram a identificaçao inequívoca da substância como sendo o cinamato de sitosterila (Figura 2).

Figura 2. Trans-cinamato de sitosterila (5), cinamato de metila (6) e ananixantona (7) isoladas da própolis da Bahia

A literatura registra que o cinamato de sitosterila possui atividade alelopática. Este composto foi isolado anteriormente de Lafoensia glyptocarpa (Lytraceae),¹⁴ porém esse é o primeiro relato dessa substância na própolis. Apesar de ser uma substância já conhecida seus dados de RMN, ainda nao estavam descritos na literatura.

O espectro de RMN de ¹H do trans cinamato de metila 6, apresentou um sinal para um grupo metoxila em δ 3,80 e um par de dubletos em 6,50 (J=15,7) e 7,80 (J=15,7) equivalentes a uma dupla ligaçao de configuaraçao trans. Os sinais em δ 7,36, 7,50 e 7,62, multiplicidade e constantes de acoplamento indicam a presença de uma anel aromático monossubstituído. O espectro de ¹³C exibe um sinal em δ 51,68 característico de grupo metoxílico ligado a carbono acila. A presença de um carbono acila foi corfimada através do sinal em δ 167,39 típico de ésteres conjugados. A natureza aromática foi confirmada através dos sinais δ 128,02 (C-5 e C-9), 128,84 (C-6 e C-8), 130,25 (C-7) e 134,32 (C-4), desta forma foi possível identificar a substância como sendo o trans cinamato de metila (Figura 2) cujo os dados espectroscópicos estao de acordo com os dados descristos na literatura.¹⁵ O trans cinamato de metila já havia sido identificado utilizando-se a técnica CG-MS em própolis tipo 1 oriunda da regiao do sul do Brasil,¹⁶ porém este é o primeiro relato de isolamento dessa substância na própolis da Bahia.

O espectro de RMN ¹H do composto 7 exibiu sinais que indicam a presença de uma unidade isoprênica devido a presença de um multipleto em δ 5,26 (1H), característico de hidrogênio vinílico; um dubleto em δ 3,38 (2H, J=6,9) atribuído aos hidrogênios alílicos e dois singletos em δ 1,87 (3H) e δ 1,70 (3H) compatíveis com as metilas vinílicas. Os sinais referentes a três hidrogênios adjacentes em δ 7,80, δ 7,32 e δ 7,26 corroboram com a presença de um anel aromático 1,2,3 trisubstituído. Os sinais em δ 6,82 (1H, J=10Hz) e 5,66 (1H, J=10Hz) sao característicos de hidrogênios olefínicos e singleto em δ 13,20 indica a presença de um grupo hidroxila quelado com um grupo carbonila sao conclusivos da estrutura da xantona. O espectro de RMN de ¹³C coincide com o padrao de sinais do esqueleto básico das xantonas. Através comparaçao direta dos dados de ¹³C com os presentes na literatura¹⁷ foi possível identificar a xantona em questao como sendo a ananixantona (Figura 2), que tem seu primeiro relato de isolamento na própolis. A ananixantona foi anteriormente isolada de Symphonia globulifera uma espécie típica do norte do Brasil que é utilizada como laxante para mulheres grávidas.¹⁷

Ensaio de sequestro de radicais livres DPPH

Os antioxidantes sao capazes de estabilizar ou desativar os radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células. De forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em baixas concentraçoes, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou inibem a oxidaçao do substrato.¹⁸ O ensaio utilizando radical estável DPPH mede a capacidade das substancias testadas em doar hidrogênio radicalar a este radical. Desta forma, quanto o maior número de hidroxilas presentes na estrutura do composto maior será sua atividade antioxidante.

Os extratos hexânicos e metanólicos nao apresentaram atividade oxidante superior a 20%. O extrato hexânico apresentou IC₅₀ = 1,192 x 10^-3 µg mL^-1 enquanto que o extrato metanólico apresentou IC₅₀=5,26 x 10^-2 µg mL^-1. O IC₅₀ expressa a quantidade de antioxidante necessária para reduzir em 50% a concentraçao inicial de DPPH. Este resultado pode ser atribuído da ausência de compostos fenólicos na própolis, visto que o fracionamento inicial dos extratos nao levou a identificaçao ou isolamento de compostos de natureza fenólica e sim de compostos com natureza mais apolar.

Bioensaio de letalidade dos extratos sobre Artemia salina

O ensaio sobre Artemia salina Leach é um método simples, barato e eficiente para determinaçao de toxicidade aguda de extratos e substâncias. A Tabela 1 apresenta os resultados de toxicidade para os extratos hexânico (PHC), metanólico (PMC) e para o clorofórmico (PCC). A análise dos resultados obtidos indica que o extrato hexânico apresentou uma baixa toxicidade uma vez que apresentou DL₅₀ > 10^-3 µg mL^-1. Todavia, os extratos clorofórmico e metanólico apresentaram uma alta toxicidade no teste. O teste de letalidade de A. salina apresenta uma correlaçao com atividade antitumoral e atividade inseticida, podendo ser utilizado como triagem para busca de novos compostos bioativos.¹² Como a composiçao química desses extratos ativos ainda nao foi estudada, torna-se pertinente uma investigaçao na composiçao química buscando isolamento das substâncias responsáveis por essa atividade.

CONCLUSAO

O estudo químico do extrato hexânico levou a identificaçao de quatro hidrocarbonetos o pentadecano, hexadecano, heptadecano e tricosano identificados por CG-EM, o fracionamento cromatográfico do extrato hexânico levou o isolamento dos compostos cinamato de sitosterila e trans cinamato de metila. Até o presente momento do extrato clorofórmico foi isolada a xantona denominada ananixantona. Estas substâncias ainda nao haviam sido isoladas deste tipo de própolis. Os extratos testados nao apresentaram uma atividade antioxidante considerável, quando comparado com ácido gálico e/ou quercetina, o que pode ser explicado pela a ausência de compostos fenólicos na própolis do tipo 6. Entretanto, no teste de letalidade de A. salina, os extratos metanólico e clorofórmico apresentaram uma excelente atividade citotóxica que tem boa correlaçao com atividade tumoral e insesticida.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Algumas imagens dos sistemas e espectros registrados, utilizados neste trabalho estao disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

A CAPES, CNPq, FABESP/PRONEM e PRONEX/NQAA/FAPESB pelas bolsas e auxílio financeiro.

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^#This paper is part of the PubliSBQ Special Issue in honor of the late Prof. Angelo da Cunha Pinto.