JBCS

INTRODUÇAO

Durante as últimas décadas, o monitoramento de resíduos de agrotóxicos em alimentos no Brasil foi marcado por uma série de esforços isolados de órgaos estaduais de saúde, agricultura e instituiçoes de pesquisas. Esse fato sempre impediu que o país tivesse uma noçao clara dos níveis de agrotóxicos encontrados em seus produtos agrícolas. Em 2001, com o intuito de resolver esse tipo de problema, foi criado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) o Programa de Análises de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA), que busca avaliar os níveis de resíduos de agrotóxicos em alimentos de origem vegetal.

De acordo com o relatório complementar de pesquisas desenvolvidas pelo PARA no ano de 2012, divulgado em 2014, foram analisadas 1.397 amostras, sendo que 347 (25%) foram consideradas insatisfatórias, com pelo menos um dos fatores indesejáveis: Presença de agrotóxicos acima do Limite Máximo de Resíduo (LMR); Constataçao de agrotóxicos nao autorizados para determinadas culturas, ou as duas irregularidades. Das 229 amostras de abobrinha analisadas, 48% (110 amostras) foram consideradas insatisfatórias, em decorrência, exclusivamente, do uso de carbofurano, agrotóxico nao registrado para a cultura de abobrinha.¹ No ano de 2016, foram divulgadas as análises dos anos de 2013 a 2015, sendo constatado que, das 216 amostras analisadas, em 168 foi identificada a presença de resíduos de agrotóxicos nao autorizados para o uso na cultura de abobrinha, sendo encontrado dentre outros agrotóxicos o carbofurano.²

A mosca-branca (Bemisia spp) é uma praga que ataca as culturas de abobrinhas. De acordo com Schmalstig e Mcauslane,³ a praga prejudica a espécie por meio de sua alimentaçao, induzindo o prateamento das folhas. Summers e Stapleton⁴ ressaltam que essa praga ataca as culturas das espécies de C. pepo, C. moschata e C. máxima. Os carbamatos sao muito eficientes para controle dessa praga em outras culturas, tais como a cultura do feijao, entretanto, nao sao autorizados para uso em culturas de abobrinha, e o uso ilegal do carbofurano nessa cultura é devido a essa eficiência no combate dessa praga.⁵

O carbofurano (2,3-dihidro-2,2dimethylbenzenofuran-7-ylmethylcarbamate) (Figura 1) pertence à classe química dos carbamatos, classificado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) como inseticida, cupinicida, acaricida e nematicida. É classificado toxicologicamente como extremamente tóxico. É empregado no solo, principalmente em culturas de algodao, amendoim, arroz, banana, batata, café, cana-de-açúcar, cenoura, feijao, fumo, milho, repolho, tomate e trigo e nas sementes de algodao e arroz.⁶

Figura 1. Estrutura química do carbofurano

Pela alta toxicidade dos carbamatos, muitos desses produtos químicos foram proibidos em diversos países, como na Uniao Europeia, Estados Unidos e Canadá.⁷ No ano de 2015, a ANVISA abriu uma consulta pública para Reavaliar a Toxicidade do Ingrediente Ativo de Agrotóxico Carbofurano no Brasil, resultando em aprovaçao da proposta por 81,67% das respostas.⁸

O método QuEChERS é o recomendado pela ANVISA para determinaçao de carbofurano em abobrinha por cromatografia.⁹ Embora seja um método multirresíduo, o QuEChERS é um método bastante laborioso, se comparado a outros métodos de extraçao. Outro método que foi desenvolvido e que tem sido utilizado com sucesso para determinaçao de agrotóxicos em alimentos e demais matrizes por cromatografia é a Extraçao Sólido-Líquido com Partiçao em Baixa Temperatura (ESL/PBT). Este método já foi aplicado em várias matrizes como abacaxi,¹⁰ alface,¹¹ alho,¹² batata,^13,14 cenoura,¹⁵ manteiga,¹⁶ milho,¹⁷ morango,¹⁸ solos¹⁹ e tomates.²⁰ De acordo com Goulart et al.,²¹ a técnica apresenta vantagens em relaçao às demais técnicas de extraçao, como praticidade, número reduzido de etapas e baixo consumo de solvente orgânicos.

O objetivo deste trabalho foi otimizar o método ESL/PBT para determinaçao de carbofurano em abobrinha por cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta (HPLC-UV) e verificar a presença de carbofurano em amostras de abobrinhas comercializadas no município de Itumbiara - Goiás, Brasil.

PARTE EXPERIMENTAL

A otimizaçao do ensaio experimental consistiu na utilizaçao da técnica ESL-PBT, seguida de análise por HPLC-UV conforme metodologia proposta por Goulart et al.²¹

Reagentes e soluçoes

Os reagentes e solventes utilizados foram acetato de etila (99,5% v/v - Mallinckrodt/HPLC) e acetonitrila (99,5% v/v - J.T. Baker/HPLC) e cloreto de sódio (99,5% m/m - Synth).

A soluçao padrao estoque na concentraçao de 100,0 mg L ^-1 de carbofurano (99,9% m/m - Sigma Aldrich) foi preparada em acetonitrila e armazenada em freezer. A partir de diluiçao da soluçao estoque, foi preparada uma soluçao padrao de trabalho contendo o carbofurano na concentraçao de 5,0 mg L ^-1.

Obtençao de amostras

Para a otimizaçao da técnica de extraçao sólido-líquido com partiçao em baixa temperatura (ESL/PBT) e análise por HPLC-UV foram utilizadas abobrinhas cultivadas sem adiçao de agrotóxicos (Branco) na zona rural do município de Itumbiara-GO, Brasil. Após coleta, as amostras de abobrinha foram refrigeradas e analisadas no Laboratório de Análise Química Instrumental do Instituto Federal de Goiás - Campus Itumbiara (IFG - Itumbiara), onde foram preparadas.

Otimizaçao da técnica ESL/PBT

Amostras de abobrinhas isentas de agrotóxicos foram picadas e trituradas em mixer até total homogeneizaçao. Em seguida, 1,0000 g de polpa da amostra foram colocadas em frascos de vidro transparente (22 mL) e fortificadas com 2 µL de soluçao-padrao de carbofurano a 5,0 mg L ^-1 e homogeneizadas. As amostras fortificadas (na presença e ausência de adiçao de sal) foram acrescentadas água (2 mL) e solventes extrator na proporçao (1:2). O sistema foi agitado em vórtex e as amostras foram levadas ao freezer a -20 ºC por no mínimo 3 horas para separaçao das fases. Após este intervalo, foi retirado 1 mL da fase orgânica e colocado em vial para análise cromatográfica.

Para a otimizaçao do método foi empregado um planejamento fatorial completo, 2³, para avaliaçao do comportamento simultâneo de três fatores: tempo de agitaçao em vórtex (30 ou 60 s), adiçao de sal (sem ou com 1,5% (m/m) de NaCl) e solvente extrator (acetonitrila- ACN ou acetonitrila:acetato de etila - ACN/ACE 81,25:18,75). Os três fatores foram analisados em dois níveis e as análises foram realizadas em triplicatas. As melhores condiçoes do planejamento foram avaliadas em funçao das porcentagens de extraçao obtidas em cada ensaio. A precisao do método otimizado foi determinada por meio do coeficiente de variaçao (CV) para nove extraçoes idênticas de brancos fortificados a 5 mg L ^-1.

Esses dados foram tratados empregando o programa Excel ^r. Os dados do planejamento sao apresentados na Tabela 1.

Condiçoes cromatográficas

As seguintes condiçoes cromatográficas foram ajustadas para determinaçao de carbofurano por HPLC: Coluna Kinetex 5 µm EVO C 18 - 150 X 4,6 mm; fase móvel (modo isocrático): acetonitrila:água purificada 35:65 v:v; vazao da fase móvel: 0,8 mL min ^-1; temperatura da coluna: 35 ºC; volume de injeçao 20µL e pressao: 67 kgf. Detector ultravioleta (UV) (λ: 195 nm).

A quantificaçao do carbofurano nas amostras de abobrinha foi realizada pelo método da padronizaçao externa utilizando padrao analítico de carbofurano no extrato do branco da matriz. A partir de diluiçoes da soluçao de carbofurano a 5 mg L ^-1 foram obtidas as soluçoes padrao nas concentraçoes de 0,1 mg L ^-1, 0,5 mg L ^-1, 1 mg L ^-1, 2 mg L ^-1, 3 mg L ^-1, 4 mg L ^-1 e 5 mg L ^-1.

Limite de detecçao e limite de quantificaçao

Os limites de detecçao (LOD) e os limites de quantificaçao (LOQ) do método proposto foram determinados pela fortificaçao dos extratos de abobrinha nas concentraçoes mais baixas aceitáveis. LOD e LOQ foram considerados como três e dez vezes, respectivamente, o sinal de ruído de linha de base obtido para as amostras livres de carbofurano (em branco). Os extratos de abobrinha foram obtidos submetendo-se o branco (abobrinha livre de carbofurano) ao método ESL-PBT otimizado nesse trabalho. Foram realizadas várias injeçoes dos extratos, fortificados em concentraçoes decrescentes.²²

Aplicaçao do método otimizado em amostras de abobrinha no comércio

Após a otimizaçao do método, este foi aplicado em 5 (cinco) amostras de abobrinha coletadas em cinco estabelecimentos comerciais da cidade de Itumbiara-GO, Brasil. As amostras foram refrigeradas e analisadas após 24 h.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Curva analítica

Foram realizadas injeçoes de soluçoes padrao de carbofurano no extrato do branco da matriz abobrinha, com o objetivo de verificar a resposta do detector frente às diferentes concentraçoes do analito (0,1 mg L ^-1 a 5,0 mg L ^-1). A partir dos dados obtidos foi construída a curva analítica y = 308605x-10475 com coeficiente de correlaçao igual a 0,9975.

Como a mediçao nos ensaios químicos é indireta, a transformaçao da medida do equipamento na unidade de interesse do mensurando é feita utilizando uma comparaçao direta de uma série de soluçoes padrao de concentraçoes conhecidas contra os valores medidos, seguida de transformaçoes matemáticas até a obtençao do resultado final.²³

Observa-se que a equaçao da reta apresentou coeficiente de correlaçao igual a 0,9975, considerada uma Correlaçao Altíssima (0,91 < r < 0,99) de acordo com Brito et al.,²⁴ que também afirmam que este parâmetro se refere à capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais à concentraçao do analito, enquadrados em faixa analítica especificada.

Análise cromatográfica

As condiçoes cromatográficas otimizadas para análise de carbofurano em abobrinha possibilitaram a identificaçao do pesticida no tempo de retençao de 5,34 min, conforme apresentado no cromatograma da Figura 2.

Figura 2. Cromatograma de uma soluçao padrao a 5,0 mg L ^-1 de carbofuran (t_R= 5,34 min) em acetonitrila.

Otimizaçao da técnica ESL/PBT

No processo de otimizaçao do método foi empregado um planejamento fatorial completo, 2³, para avaliaçao do comportamento simultâneo de três fatores: tempo de agitaçao em vórtex (30 ou 60 s), adiçao de sal (sem ou com 1,5% (m/m) de NaCl) e solvente extrator (acetonitrila- ACN ou acetonitrila:acetato de etila - ACN/ACE 81,25:18,75). Os resultados das combinaçoes dos fatores foram registrados para análise e interpretaçao em planilhas eletrônicas, conforme Teófilo e Ferreira.²⁵ A escolha das melhores condiçoes para aplicaçao da técnica ESL/PBT favorece melhores resultados, levando a maior frequência analítica (agilidade nas análises por unidade de tempo) e menor custo. Os resultados da análise estatística sao apresentados na Tabela 2.

Para verificaçao da significância dos dados apresentados na Tabela 2, foi aplicado o teste t de t-student ao nível de 95% de confiança e 5% significância. Para 8 graus de liberdade com 95% de probabilidade o valor t correspondente é 2,306, dessa forma serao significativos os fatores com valores excedentes a (0 + 2,306 x 1,74) = 4,01, análogo a dizer que serao significativos todos os efeitos cujo valor de p < 0,05.²⁵ Verifica-se na Tabela 2 que estatisticamente, nos níveis estabelecidos, os fatores nao sao significativos ao ponto de interferir no aumento ou diminuiçao das porcentagens de recuperaçao do carbofurano na matriz abobrinha. Entretanto, a fim de selecionar o melhor ensaio para determinaçao e quantificaçao de carbofurano na matriz investigada, é de fundamental importância entender a atuaçao de cada fator no processo.

Observando-se o processo de agitaçao das amostras, foi verificado que elevando o tempo de agitaçao de 30 s para 60 s, o percentual de recuperaçao aumentou em média 0,235%. Esta etapa é de fundamental importância no processo analítico por representar o momento de maior interaçao entre o solvente extrator e o analito, proporcionando melhor precisao, praticidade, frequência analítica e alto rendimento.²⁶ Por esse motivo foi escolhido o tempo de agitaçao de 60 s.

A adiçao de NaCl ao sistema foi o fator que mais influenciou no aumento das porcentagens de recuperaçao. Com o aumento da força iônica do sistema, observou-se um aumento de 3,06% na eficiência da extraçao. Geralmente, a introduçao de sais, como NaCl, à fase aquosa do sistema permite obter maiores percentuais de recuperaçao para compostos orgânicos, pois diminui a solubilidade destes na fase aquosa, favorecendo a transferência destes para a fase orgânica.²⁶

Com relaçao à soluçao extratora, observou-se que nos ensaios utilizando apenas acetonitrila como solvente extrator, a recuperaçao média foi de 73,1%, enquanto que, empregando a mistura acetonitrila: acetato de etila (81,25: 18,75) obteve-se média de recuperaçao de 76,7%. A recuperaçao média de todos os ensaios foi 75,88%. A precisao do método foi determinada através do coeficiente de variaçao (CV) para nove extraçoes idênticas de brancos fortificados a 5 mg L ^-1 e os resultados foram 73,7% com coeficiente de variaçao de 5,3%. Resultados semelhantes foram obtidos na determinaçao de agrotóxicos em tomates realizada por Pinho et al.²⁰ quando empregaram a combinaçao de dois solventes. A mesma técnica foi aplicada por Costa et al.¹¹ para determinaçao de agrotóxicos em amostras de alface, obtendo percentuais de recuperaçao entre 72,3% e 103,2%. Atualmente a técnica ESL/PBT foi aplicada na análise de bifenilas policloradas em lodo de esgoto e os percentuais de extraçao foram superiores a 82%.²⁷

Além da eficiência de extraçao e compatibilidade com a técnica cromatográfica, outros fatores devem ser avaliados para escolha do melhor solvente extrator, entre eles a viabilidade econômica e o descarte dos resíduos dos solventes orgânicos.

Como as médias de recuperaçao estatisticamente nao diferem entre si, considerando que a acetonitrila é miscível em água e apresenta baixo ponto de fusao (-45 °C), propriedades essenciais para se empregar a ESL/PBT, este foi o solvente extrator escolhido.²⁸

Assim, o ensaio 4 (repetiçoes 10, 11 e 12) com tempo de agitaçao em vortex - 60 s; adiçao de NaCl e ACN como solvente extrator foram escolhidos para dar continuidade ao trabalho, em virtude da viabilidade prática e econômica do experimento.

Na Figura 3 está apresentado um cromatograma de um extrato do branco da abobrinha e cromatogramas obtidos de amostras de abobrinha livres de carbofurano, fortificadas e submetidas ao Ensaio 4. Observa-se que o tempo de retençao do carbofurano está entre 5 e 6 minutos. O extrato do branco nao apresenta picos no tempo de retençao dos carbofurano, o que permite afirmar que o método proposto apresenta seletividade.²⁹

Figura 3. (a) Cromatograma de um extrato obtido de abobrinha isenta dos princípios ativos e (b) Cromatograma de extratos de abobrinha contendo o carbofurano a 5,0 mg L ^-1.

Limite de detecçao e quantificaçao

Os limites de detecçao e quantificaçao do método proposto foram 0,04 mg kg ^-1 e 0,13 mg kg ^-1, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos por Goulart et al.²⁴ na análise de carbofurano em matrizes de bebidas de interesse forense. Este método é conhecido como método do sinal-rúído. Na determinaçao da relaçao sinal-ruído, faz-se a comparaçao entre a mediçao dos sinais de amostras em baixas concentraçoes conhecidas do composto de interesse na matriz e um branco (matriz isenta do composto de interesse) destas amostras.²²

O carbofurano nao é registrado na ANVISA para utilizaçao em culturas de abobrinha, embora no último PARA tenha se verificado a presença desse agrotóxico nessa cultura. É importante ressaltar que estudos recentes realizados no município de Itumbiara-GO, alertam sobre a gama de agrotóxicos utilizados nos cultivos da regiao, em especial para a cana-de-açúcar e hortaliças. Em uma pesquisa realizada por Rodrigues et al.³⁰ na cidade de Itumbiara-GO, foi constatado que 100% dos produtores rurais entrevistados utilizam algum tipo de agrotóxico, incluindo os carbamatos, como o carbofurano. No que se refere ao fácil acesso destes produtos identificou-se o relato de suicídio devido ao uso do agrotóxico Furadanr, que apresenta o carbofurano como princípio ativo, além da verificaçao de problemas ambientais relacionados ao descarte inadequado de embalagens e mortes de animais decorrentes de aplicaçoes aéreas de agrotóxicos. Do ponto de vista da segurança alimentar, a ausência de resíduos de carbofurano nas amostras analisadas é de suma importância, porém a quantidade de agrotóxicos utilizados na regiao é grande e os tipos de vegetais comercializados sao inúmeros. Diante deste cenário torna-se evidente a necessidade de manutençao de pesquisas sobre resíduos de agrotóxicos em alimentos e os impactos ambientais decorrentes do uso indiscriminado nas culturas da regiao.

Aplicaçao do método de ESL/PBT-HPLC/UV em amostras de abobrinhas comerciais

As amostras de abobrinha comercializadas no munícipio de Itumbiara-GO, coletadas e processadas conforme descrito anteriormente foram submetidas, em triplicata, ao método otimizado de ESL/PBT-HPLC/UV.

As condiçoes do ensaio 4 (quatro) do planejamento (tempo de agitaçao em vortex - 60 s; adiçao de NaCl e ACN como solvente extrator) foram aplicados nas amostras reais para determinaçao de carbofurano. A 1,0000 g de polpa da amostra comercial de abobrinha, colocada em frascos de vidro transparente (22 mL) foi adicionado o sal NaCl (1,5% m/m). Após, foram acrescentados água (2 mL) e acetonitrila (4 mL) na proporçao (1:2). O sistema foi agitado em vórtex por 60 s e as amostras foram levadas ao freezer a -20 ºC por 3 horas para separaçao das fases. Após este intervalo, foi retirado 1 mL da fase orgânica e colocado em vial para análise cromatográfica.

Nao foi evidenciada a presença de carbofurano dentro da faixa de detecçao do aparelho em todas as cinco amostras avaliadas, o cromatograma das análises em triplicata, da amostra de abobrinha 1 é apresentado na Figura 4. Os cromatogramas das amostras 2 a 5 foram semelhantes ao cromatograma da amostra 1.

O carbofurano nao é autorizado pela ANVISA para aplicaçao em culturas de abobrinha. Para as culturas de cenoura, repolho e tomate os valores de LMR sao 0,5 mg kg ^-1, 1,0 mg kg ^-1 e 0,1 mg kg ^-1, respectivamente.⁶

Figura 4. Cromatograma de extratos obtidos de matrizes reais de abobrinha (amostra 1) (—) (—) (—) replicatas comparadas ao padrao do carbofurano 5,0 mg L ^-1 (—)

CONCLUSAO

A técnica ESL/PBT aplicada na determinaçao de carbofurano em matrizes de abobrinha é seletiva, simples e eficaz, consumindo pequenas quantidades de solventes e amostras, com porcentagem média de recuperaçao de 75,88%. Além disso, nao sao necessárias etapas posteriores de clean-up do extrato. Após a PBT os extratos sao analisados diretamente por HPLC-UV.

As análises de matrizes reais de abobrinhas comercializadas no município de Itumbiara-GO utilizando a técnica ESL-PBT nao apresentaram resíduos do agrotóxico carbofurano.

AGRADECIMENTOS

Ao Ministério da Educaçao (MEC) e a Fundaçao Nacional de Desenvolvimento da Educaçao (FNDE) pelo o apoio financeiro concedido ao Programa de Educaçao Tutorial (PET) do Instituto Federal de Goiás - Campus Itumbiara.

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