JBCS

INTRODUÇAO

O ácido acetilsalicílico (AAS), quimicamente conhecido como ácido 2-acetiloxibenzóico e comumente conhecido com Aspirina^® (Figura 1), é um fármaco anti-inflamatório nao-esteroide utilizado para o alívio de cefaleia, inflamaçoes e febre, apresentando propriedades antipiréticas, antirreumáticas, analgésicas e anticoagulantes. O AAS age inibindo as enzimas ciclooxigenases (COX 1 e 2), diminuindo assim, a produçao de prostaglandinas, que sao importantes mediadores endógenos de diversos processos fisiológicos. O AAS também é utilizado em distúrbios cardiovasculares e diabetes.^1-3

Figura 1. Estrutura química do ácido acetilsalicílico

Diferentes métodos analíticos como espectrofotométrico,^4-6 espectrofluorimétrico,⁷,⁸ cromatográfico,^9,10 potenciométrico¹¹ e voltamétrico,^12-14 sao descritos na literatura para a quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas. No entanto, para o doseamento de AAS em comprimidos a farmacopeia brasileira¹⁵ descreve o método titulométrico de retorno ácido-base como oficial.

Na detecçao e quantificaçao de fármacos em formulaçoes farmacêutica a técnica espectrofotométrica na regiao do ultravioleta (UV) é amplamente aplicada, sendo utilizada principalmente no controle de qualidade de indústrias farmacêuticas, pois cumpre requisitos essenciais (rapidez, baixo custo operacional e confiabilidade de resultados) para as análises de rotina.^16,17 Sao encontrados na literatura alguns exemplos do emprego da espectrofotometria na regiao do UV na quantificaçao de fármacos como carvedilol,¹⁶ efavirenz,¹⁷ sinvastatina,¹⁸ aciclovir,¹⁹ olanzapina,²⁰ fluoxetina²¹ e paracetamol.²²

A necessidade de proporcionar a qualidade às mediçoes analíticas, ou seja, a confiabilidade de resultados, está sendo cada vez mais necessária e exigida.¹⁷ Portanto, métodos analíticos sao constantemente validados com o objetivo de gerar resultados confiáveis. Nesse contexto, o controle de qualidade tornou-se uma ferramenta importante na indústria farmacêutica, garantindo assim um produto seguro e eficaz.¹⁹ A validaçao de um método analítico, para a quantificaçao de uma espécie química, deve assegurar por meio de estudos experimentais, que esse atenda às exigências das aplicaçoes analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para a validaçao do método analítico os seguintes parâmetros devem ser avaliados: seletividade; linearidade; intervalo, precisao, limite de detecçao; limite de quantificaçao; exatidao; e robustez.²³

Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo validar um método empregando a espectrofotometria na regiao do UV para a quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas, como uma sugestao de atividade prática para a disciplina de Análise Instrumental em cursos de graduaçao. Ressalta-se que a aula prática constitui uma importante ferramenta metodológica que favorece o processo de ensino-aprendizagem nas disciplinas de química. Por meio da experimentaçao, alia-se prática à teoria, possibilitando o desenvolvimento de habilidade manuais e intelectuais, a argumentaçao, a resoluçao de problemas, a compreensao de conceitos, podendo despertar o interesse do estudante.^24-26 Na literatura sao encontrados alguns exemplos de propostas de atividades práticas para a disciplina de Análise Instrumental dos cursos de Química e/ou Farmácia, como a construçao artesanal de um eletrodo íon seletivo a chumbo(II) enquanto alternativa para disciplinas experimentais,²⁷ a utilizaçao de bomba de aquário em titulaçoes espectrofotométricas²⁸ e a quantificaçao de ácido acetilsalicílico (AAS) em Aspirina^® por titulaçoes potenciométrica e condutométrica.²⁹

PARTE EXPERIMENTAL

Equipamentos

As medidas espectrofotométricas no UV foram realizadas em triplicata, utilizando-se o espectrofotômetro UV-Vis Cary 50 (Varian^®) de duplo feixe, detector de 190 a 1100 nm, cubetas de quartzo de 1 cm e acoplado a um microcomputador. Todas as medidas de massa foram realizadas em balança analítica semi-micro (σ ≤ 0,05 mg) AUW220D (Shimadzu^®). A solubilizaçao do AAS em formulaçoes farmacêuticas foi realizada com o auxilio de Ultrassom USC-1400 A (UNIQUE). A bureta de 25,00 mL utilizada na titulaçao de retorno ácido-base foi previamente calibrada empregando-se o método gravimétrico.

Reagentes, soluçoes e amostras

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico e as soluçoes foram preparadas em água ultrapura (Direct-Q^® 8 UV Smart, Millipore, 18,2 Ω). O padrao de AAS 99% foi adquirido da Sigma-Aldrich (China) e utilizado sem purificaçao adicional. A soluçao estoque de AAS 1 mg mL^-1 foi preparada dissolvendo-se 10 mg de AAS, em etanol absoluto, em balao volumétrico de 10 mL. O hidróxido de sódio (NaOH) 97%, o ácido clorídrico (HCl) 37% e o etanol absoluto 99,8% foram adquiridos da Vetec (Brasil). O biftalato de potássio (HK(C₈H₄O₄)) 99,5% e o carbonato de sódio (Na₂CO₃) 99,5% foram adquiridos da Merck (Alemanha) e Synth (Brasil), respectivamente. As soluçoes de NaOH foram preparadas dissolvendo-se massas adequadas desse composto em água ultrapura. As soluçoes de HCl foram preparadas por diluiçao em água ultrapura. Os comprimidos contendo AAS foram adquiridos em comércio local.

Validaçao do método analítico

O método proposto foi validado conforme a RDC nº 166 de 24/07/2017 da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária),²³ que estabelece critérios para a validaçao de métodos analíticos empregados em insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos biológicos em todas as suas fases de produçao, e recomendaçoes da ICH (The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use).³⁰ Os parâmetros avaliados foram: seletividade; linearidade; intervalo, precisao, limite de detecçao; limite de quantificaçao; exatidao; e robustez. O método foi comparado estatisticamente com o método de titulaçao de retorno ácido-base da Farmacopeia Brasileira.¹⁵

Seletividade

A seletividade do método foi avaliada por meio de análises dos espectros UV obtidos para o AAS e os excipientes sacarina sódica e vanilina. Foram preparadas para a sacarina sódica e vanilina soluçoes estoque 1 mg mL^-1, dissolvendo-se 10 mg da sacarina sódica ou vanilina em NaOH 0,100 mol L^-1, em balao volumétrico de 10 mL. As medidas espectrofotométricas foram realizadas nas soluçoes de sacarina sódica 3 µg mL^-1 e vanilina 3 µg mL^-1 e de uma mistura (AAS 30 µg mL^-1 + sacarina sódica 3 µg mL^-1 + vanilina 3 µg mL^-1), preparadas por diluiçao das soluçoes estoque. O perfil dos espectros obtidos foram avaliados e comparados com o espectro de uma soluçao de AAS 30 µg mL^-1.

Linearidade e intervalo

A linearidade foi determinada por meio da obtençao de três curvas analíticas no intervalo de AAS de 24 a 36 µg mL^-1 (de 80-120% da concentraçao teórica do teste).²³ A equaçao da reta (inclinaçao e intercepto com o eixo y) foi obtida pelo método dos mínimos quadrados e calculou-se o coeficiente de correlaçao linear. Os dados de cada nível de concentraçao foram avaliados por meio de análise de variância (ANOVA).

Limites de detecçao (LD) e de quantificaçao (LQ)

Os limites de detecçao e quantificaçao foram calculados a partir do desvio padrao do intercepto com o eixo y (σ) e da inclinaçao da curva analítica (IC), Equaçoes 1 e 2.²³

O desvio padrao do intercepto com o eixo y foi calculado pelas seguintes Equaçoes:³¹

Precisao

A repetibilidade (precisao intradia) foi avaliada por meio de medidas espectrofotométricas de soluçoes contendo AAS em três níveis de concentraçao diferentes (24, 30 e 36 µg mL^-1), contemplando o intervalo linear do método, e com três réplicas cada. A precisao intermediária (precisao interdia) foi avaliada de forma semelhante à precisao intradia, no entanto, as mediçoes espectrofotométricas foram realizadas em dois dias com analistas diferentes. Calculou-se o coeficiente de variaçao (CV), por meio da equaçao (5).

em que: CV é o coeficiente de variaçao; DPR é o desvio padrao relativo; DP é o desvio padrao das medidas espectrofotométricas; e CMD é a concentraçao média de AAS determinada.

Exatidao

A exatidao foi avaliada por meio do teste de adiçao de padrao de AAS, nas amostras de formulaçoes farmacêuticas (referência e genérico), e sua recuperaçao em três níveis diferentes (20 mg, 50 mg e 70 mg), com concentraçoes finais dentro da faixa de linearidade do método. Os valores de recuperaçao, expressos em porcentagem, foram obtidos por meio das medidas espectrofotométricas das soluçoes finais em funçao da quantidade teórica de padrao adicionado. As concentraçoes de AAS foram obtidas por meio da curva analítica.

Robustez

A robustez foi avaliada por meio das mediçoes espectrofotométricas, variando-se a marca do NaOH 97% (Vetec, Reagen e Synth) e a temperatura da sala de análise (27 e 24 °C). As análises foram realizadas em triplicata e as concentraçoes de AAS foram obtidas por meio da curva analítica.

Quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas utilizando-se o método espectrofotométrico

Vinte comprimidos de cada amostra comercial tiveram o seu conteúdo pesado, pulverizado e homogeneizado. Transferiu-se quantidade do pó equivalente a 0,250 g de AAS para béquer de 100 mL e em seguida adicionou-se 25 mL de NaOH 0,100 mol L^-1. A solubilizaçao do AAS nas amostras comerciais foi realizada com auxilio de Ultrassom por 15 minutos. Após a filtraçao transferiu-se 1000 µL da soluçao resultante para balao volumétrico de 10 mL e completou-se o volume com NaOH 0,100 mol L^-1. Em seguida transferiu-se 300 µL da soluçao resultante para balao volumétrico de 10 mL e completou-se o volume com NaOH 0,100 mol L^-1. As análises foram realizadas em triplicata e as concentraçoes de AAS foram obtidas por meio da curva analítica.

Quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas utilizando-se a titulaçao de retorno ácido-base

A titulaçao de retorno ácido-base recomendada pela Farmacopeia Brasileira¹⁵ foi aplicada como método de comparaçao ao método proposto utilizando-se a espectrofotometria. Pesou-se, pulverizou-se e homogeneizou-se vinte comprimidos da amostra comercial. Transferiu-se quantidade do pó equivalente a 0,250 g de AAS para Erlenmeyer de 125 mL e adicionou-se 15 mL da soluçao de NaOH 0,500 mol L^-1 (previamente padronizada com HK(C₈H₄O₄)). A soluçao contendo AAS e NaOH foi fervida cuidadosamente por 10 minutos e titulou-se o excesso de NaOH com a soluçao de HCl 0,500 mol L^-1 (previamente padronizada com Na₂CO₃), utilizando-se vermelho de fenol como indicador. Realizou-se ensaio em branco e efetuou-se as correçoes necessárias. Cada mL de NaOH 0,500 mol L^-1 equivale a 45,040 mg de AAS. A quantificaçao de AAS em amostras comerciais utilizando-se a titulaçao de retorno ácido-base foi realizada em triplicata. O procedimento descrito na Farmacopeia Brasileira foi adaptado com o objetivo de gerar uma quantidade menor de resíduo químico.

Análises estatísticas

A análise estatística dos dados foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA fator único), testes t e f com nível de confiança de 95% (probabilidade inferior a 5% - p < 0,05). A avaliaçao estatística dos resultados foi realizada por meio do Software MS Excel^®.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Para verificar a possibilidade de desenvolvimento de um método espectrofotométrico, para a quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas, foram obtidos os espectros UV (200-400 nm) da Figura 2 a partir de uma soluçao de AAS 10 µg mL^-1 em NaOH 0,100 mol L^-1, HCl 0,100 mol L^-1 e etanol absoluto. Foram observadas duas bandas de absorçao máxima em 217 e 297 nm em meio alcalino, em 230 e 276 em meio ácido e 227 e 275 nm em meio neutro. Com base nos espectros UV obtidos, analisando a altura e forma da banda de absorçao, optou-se para o desenvolvimento de método analítico realizar as medidas espectrofotométricas em meio alcalino (NaOH 0,100 mol L^-1) no comprimento de onda no máximo de absorçao (λ_max) de 297 nm.

Figura 2. Espectros de absorçao no UV do ácido acetilsalicílico

Na validaçao do método analítico para a quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas, foi realizado o estudo de seletividade por meio de análises dos espectros UV (Figura 3) obtidos para o AAS e os excipientes sacarina sódica e vanilina, solúveis em NaOH 0,100 mol L^-1. Observa-se nos espectros UV que a sacarina nao apresenta banda de absorçao na faixa de comprimento de onda estudada. No entanto, a vanilina apresentou bandas de absorçao com máximos em 250 e 347 nm, sem sobreposiçao em relaçao ao comprimento de onda máximo do AAS (297 nm). Observando-se o espectro UV para a mistura (AAS + vanilina + sacarina) notam-se dois máximos de absorçao para o AAS e vanilina em 299 e 348 nm, respectivamente. Como base nas medidas espectrofotométricas, realizadas com os excipientes, acredita-se que em baixas contraçoes a vanilina nao é um potencial interferente na análise das formulaçoes farmacêuticas. Os demais excipientes, encontrados nas formulaçoes farmacêuticas contendo AAS, como o fosfato de cálcio dibásico, a celulose e o amido, sao insolúveis em NaOH 0,100 mol L^-1 nao interferindo na análise das formulaçoes farmacêuticas.

Figura 3. Espectro de absorçao no UV do ácido acetilsalicílico e dos excipientes em NaOH 0,100 mol L^-1

Após o estudo de seletividade foram obtidos os espectros de absorçao no UV para AAS, com a concentraçao variando de 24 a 36 µg mL^-1 (de 80 - 120% da concentraçao teórica do teste), em NaOH 0,100 mol L^-1 (Figura 4).

Figura 4. Espectros de absorçao no UV obtidos para o AAS em NaOH 0,100 mol L^-1 variando a concentraçao de 24 a 36 µg mL^-1. Inserido: Curva analítica

A curva analítica, obtida por meio do método dos mínimos quadrados, apresentou a equaçao y = 0,0188x + 0,0069 e um coeficiente de correlaçao de 0,9994, indicando a linearidade do método dentro dos limites de concentraçoes estudadas, além de estar de acordo com o critério mínimo aceitável do coeficiente de correlaçao (r = 0,990) descrito na Resoluçao para Validaçao de Métodos Analíticos da ANVISA (RDC nº 166 de 24/07/2017).²³ Por meio da análise de variância, testou-se a significância estatística da curva ajustada e a linearidade do método (Tabela 1). No teste do ajuste da curva obteve-se um valor de f_calculado (1,926) menor que o f_tabelado (3,710), comprovando-se que nao houve falta de ajuste na faixa de concentraçao estudada, a um nível de confiança de 95%. Em seguida, a validade da regressao (linearidade) foi analisada por meio da comparaçao dos valores de f tabelado e calculado. O valor de f_calculado (3376,2) muito maior que o f_tabelado (4,670) indica que o método é linear, a um nível de confiança de 95%.

A partir da curva analítica foram calculados os limites de detecçao de 1,97 µg mL^-1 e de quantificaçao de 6,57 µg mL^-1, assegurando-se que o método proposto pode detectar e quantificar uma ampla faixa de concentraçao com segurança, podendo ser aplicado na detecçao e quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas.

Em seguida, foram avaliadas a repetibilidade e a precisao intermediária por meio de medidas espectrofotométricas de soluçoes contendo AAS, em três níveis de concentraçao diferentes, em dois dias e com analistas diferentes. Os resultados obtidos para a repetibilidade e precisao intermediária, apresentados na Tabela 2, demonstram que o método proposto apresenta boa precisao com valores de CV menores que 2%.

Com a confirmaçao da precisao do método proposto foram realizados ensaios para a determinaçao da exatidao, por meio do teste de adiçao de padrao de AAS, obtendo-se recuperaçoes médias para três níveis diferentes de AAS (20 mg, 50 mg e 70 mg) nas formulaçoes farmacêuticas de referência e genérica iguais a 99,42% ± 11,65 e 95,94% ± 5,46, respectivamente. Os valores de t_calculado (0,086 - referência; 1,288 - genérico) sao menores que o t_tabelado (4,303), indicando que os valores de recuperaçao encontrados sao estatisticamente iguais a 100%, a um nível de confiança de 95%, confirmando que nao há interferência significativa da matriz (excipientes) nas amostras de formulaçoes farmacêuticas analisadas (referência e genérico) e que o método proposto apresenta boa exatidao.

Com o objetivo de avaliar a robustez, capacidade do método proposto em resistir a pequenas variaçoes dos parâmetros analíticos, verificou-se o comportamento dos resultados em relaçao a duas variáveis: marca do reagente utilizado no preparo da soluçao de NaOH 0,100 mol L^-1 e a temperatura do laboratório onda as medidas espectrofotométricas foram realizadas. Os resultados experimentais obtidos para a robustez sao apresentados na Tabela 3.

A análise estatística dos dados obtidos, variando a marca do reagente utilizado no preparo da soluçao de NaOH 0,100 mol L^-1, realizada por meio da ANOVA, demonstrou que mudando a marca do reagente ocorre uma influência significativa nos resultados, a um nível de confiança de 95%, portanto, o método proposto nao foi robusto nesse parâmetro avaliado. No entanto, essa variaçao nao afeta nos resultados das análises em formulaçoes farmacêuticas e, segundo a orientaçao sobre validaçao de métodos analíticos (DOQ-CGCRE-008, 5^a revisao, INMETRO),³² a robustez é um parâmetro opcional dentro dos estudos de validaçao. O teste f foi aplicado para comparar as precisoes obtidas, empregando-se o método espectrofotométrico proposto em duas temperaturas diferentes do local da análise, resultando em um valor de f_calculado menor que o valor de f_tabelado para as temperaturas 24 °C e 27 °C, indicando que nao existe diferença significativa entre as precisoes das duas análises, a um nível de confiança de 95%, possibilitando a aplicaçao do teste t. O valor de t_calculado é menor que o t_tabelado, indicando que nao existem diferenças significativas, a um nível de confiança de 95%, entre as médias dos resultados obtidos nas duas temperaturas (24°C e 27°C) estudadas.

A Tabela 4 apresenta os resultados obtidos na quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas empregando-se os métodos titulométrico de retorno ácido-base, recomendado pela Farmacopeia Brasileira,¹⁵ e o espectrofotométrico.

A análise estatística de ANOVA demonstrou que nao há diferença significativa entre os resultados obtidos pelos dois métodos empregados para as duas formulaçoes farmacêuticas analisadas (f_calculado = 0,87; f_tabelado = 4,06; p < 0,05). O teste f foi aplicado para comparar as precisoes obtidas empregando-se os métodos titulométrico de retorno ácido-base e o espectrofotométrico, resultando em valores de f_calculado (3,06 - referência; 5,44 - genérico) menores que o valor de f_tabelado (19,0), para as duas amostras de formulaçoes farmacêuticas, indicando que nao existe diferença significativa entre as precisoes dos dois métodos empregados (p < 0,05) possibilitando a aplicaçao do teste t. Os valores de t_calculado (0,7894 - referência; 1,952 - genérico) comparados com o t_tabelado (4,303), indicaram que nao existe diferença significativa (p < 0,05) entre as médias dos resultados dos dois métodos para as duas formulaçoes farmacêuticas analisadas. O teste t também foi aplicado para comparar as médias obtidas, empregando-se os métodos titulométrico de retorno ácido-base e o espectrofotométrico, com os valores descritos nos rótulos das formulaçoes farmacêuticas analisadas. Os valores de t_calculado para o método titulométrico de retorno ácido-base (0,8660 - referência; 2,309 - genérico) sao menores que o t_tabelado (4,303), indicando que os valores das médias obtidas por esse método sao estatisticamente iguais a 500 mg comprimido^-1 (p < 0,05). Para o método espectrofotométrico proposto, os valores de t_calculado (0,2474 - referência; 0,7423 - genérico) também sao menores que o t_tabelado (4,303), indicando que os valores das médias obtidas por esse método sao estatisticamente iguais a 500 mg comprimido^-1, em um nível de confiança de 95%. Esses resultados demostraram que o método espectrofotométrico validado é uma excelente alternativa na quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas.

A prática sugerida para a disciplina de Análise Instrumental em cursos de graduaçao, utilizando-se o método espectrofotométrico no UV na quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas, realizada em cinco aulas práticas, mostrou-se simples, rápida, segura e de baixo custo e quando aplicada no laboratório de ensino proporcionou aos estudantes o contato com a técnica espectrofotométrica no UV, promovendo a discussao e a compreensao dessa técnica, de conceitos importantes envolvidos nos estudos de validaçao de métodos (seletividade, linearidade, intervalo, precisao, limite de detecçao, limite de quantificaçao, exatidao e robustez) e da aplicaçao de testes estatísticos.

CONCLUSAO

A prática proposta de validaçao de método espectrofotométrico de análise para a quantificaçao de AAS foi utilizada como ferramenta metodológica, favorecendo o processo de ensino-aprendizagem e ocasionando um ganho pedagógico para os estudantes da disciplina de Análise Instrumental. O método espectrofotométrico na regiao do UV validado mostrou-se específico, linear, preciso, exato, com baixos limites de detecçao e quantificaçao, viabilizando o seu emprego na quantificaçao de AAS em formulaçoes farmacêuticas, em análises de rotina de controle de qualidade de comprimidos e atividade prática em laboratórios de ensino, pois é um método simples, rápido, seguro e de baixo custo.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os testes estáticos, a explicaçao detalhada dos parâmetros de validaçao e os procedimentos das padronizaçoes das soluçoes de NaOH e HCl e da quantificaçao de AAS em comprimidos estao disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, em arquivo pdf, com livre acesso.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro da Universidade Católica de Brasília (UCB).

REFERENCIAS

1. Athota, R. V.; Jagarlapudi, S. K.; Singampalli, M. R.; J. Appl. Pharm. Sci. 2017, 7, 48.

2. Alfonso, L.; Ai, G.; Spitale, R. C.; Bhat, G. J.; Br. J. Cancer 2014, 111, 61.

3. Cadavid, A. P.; Front. Immunol. 2017, 8, 1.

4. Sena, M. M.; Fernandes, J. C. B.; Rover Jr., L.; Poppi, R. J.; Kubota, L. T.; Anal. Chim. Acta 2000, 409, 159.

5. Kokot, Z.; Burda, K.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1998, 18, 871.

6. Bouhsain, Z.; Garrigues, S.; de la Guardia, M.; Fresenius' J. Anal. Chem. 1997, 357, 973.

7. Karim, M. M.; Jeon, C. W.; Lee, H. S.; Alam, S. M.; Choi, J. H.; Jin, S. O.; Das, A. K.; J. Fluoresc. 2006, 16, 713.

8. Navalón, A.; Blanc, R.; del Olmo, M.; Vilchez, J. L.; Talanta 1999, 48, 469.

9. Shinde, S. S.; Kachave, R. N.; Chaudhari, S. R.; Int. J. Pharm. Res. 2013, 5, 19.

10. Franeta, J.T.; Agbaba, D.; Eric, S.; Pavkov, S.; Aleksic, M.; Vladimirov, S.; Il Farmaco 2002, 57, 709.

11. Rover Jr., L.; Garcia, C. A. B.; Neto, G. O.; Kubota, L. T.; Galembeck, F.; Anal. Chim. Acta 1998, 366, 103.

12. Torriero, A. A. J.; Luco, J. M.; Sereno, L.; Raba, J.; Talanta 2004, 62, 247.

13. Park, J.; Eun, C.; Electrochim. Acta 2016, 194, 346.

14. Iacob, A.; Manea, F.; Vaszilcsin, N.; Picken, S. J.; Schoonman, J.; Int. J. Electrochem. Sci. 2015, 10, 5661.

15. Farmacopeia Brasileira, 5ª ed., Agência Nacional de Vigilância Sanitária: Brasília, 2010, p. 863.

16. Borba, P. A. A.; Riekes, M. K.; Pereira, R. N.; Stulzer, H. K.; Dalla Vecchia, D.; Quim. Nova 2013, 36, 582.

17. Alves, L. D. S.; Rolim, L. A.; Fontes, D. A. F.; Rolim-Neto, P. J.; Soares, M. F. de L. R.; Sobrinho, J. L. S.; Quim. Nova 2010, 33, 1967.

18. Polonini, H. C.; dos Santos, F. C.; Vaz, U. P.; Brandao, M. A. F.; Raposo, N. R. B.; Quim. Nova 2011, 34, 516.

19. Barboza, F. M.; Dalla Vecchia, D.; Pereira, A. V.; Stulzer, H. K.; Silva, M. A. S.; Quim. Nova 2010, 33, 747.

20. do Rêgo, J. F.; de Moura, J. I.; Moita, G. C.; Quim. Nova 2010, 33, 471.

21. de Moura, J. I.; Moita, G. C.; Quim. Nova 2012, 35, 627.

22. Goes Junior, E. J. A.; Roeder, J. S.; Oliveira, K. B. L.; Ferreira, M. P.; Silva, J. G.; Rev. VirtualQuim. 2017, 9, 1747.

23. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); RDC Nº 166, de 24/07/2017.

24. Simoni, D. A.; Andrade, J. C.; Simoni, J. A.; Quim. Nova 2011, 34, 1818.

25. Galiazzi, M. C.; Gonçalves, F. P.; Quim. Nova 2004, 27, 326.

26. da Luz Júnior, G. E.; de Sousa, S. A. A.; Moita, G. C.; Moita Neto, J. M.; Quim. Nova 2004, 27, 164.

27. Silva, J. G.; Lehmkuhl, A.; Alcanfor, S. K. B.; Quim. Nova 2009, 32, 1055.

28. Alcanfor, S. K. B.; Zara, L. F.; Pinheiro, L. A.; Faria, J. M.; Silva, J. G.; Educ. Quim. 2010, 21, 202.

29. Sousa, A. G.; Chagas, F. W. M.; Gois, l. C.; Silva, J. G.; Rev. Virtual Quim. 2018, 10, 502.

30. ICH - The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; Q 2B- validation of Analytical procedure: methodology, 1996.

31. Mendham, J.; Denney, R. C.; Barnes, J. D.; Thomas, M. J. K.; Análise Química Quantitativa, 6ª ed., LTC: Rio de Janeiro, 2002.

32. Instituto Nacional de Metrologia, Normalizaçao e Qualidade Industrial (INMETRO); Orientaçao sobre Validaçao de Métodos Analíticos, DOQ-CGCRE-008, 5ª revisao, 2016.