JBCS

INTRODUÇÃO

O Programa Nacional de Imunização (PNI) foi criado em 1973 e possui reconhecimento nacional e internacional, sendo considerado um dos maiores programas de vacinação do mundo. Este faz parte do Sistema Único de Saúde (SUS) que, devido ao seu caráter universal e gratuito, conseguiu por anos elevadas coberturas nacionais.^1-3 No ano de 2023, o PNI completou seus 50 anos de trajetória e cabe destacar que junto a este programa, as instituições de pesquisa, desenvolvimento e produção, assim como o papel da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) fazem parte dessa história relevante da política de imunização brasileira.

No que diz respeito ao controle da qualidade de vacinas utilizadas no PNI, é possível vislumbrar o processo evolutivo, uma vez que nessa época não se contava com o controle de qualidade oficial de vacinas. Segundo Ponte,⁴ o documento de criação do PNI faz referência sobre a necessidade do controle de qualidade dos antígenos para uso humano, desta forma, reconhecia-se a importância de contar com infraestrutura laboratorial no Brasil, para análise da qualidade de imunobiológicos a serem aplicadas na população.^4,5 Neste sentido, em 1979 o relatório elaborado por uma comissão formada principalmente para analisar os problemas enfrentados pelo PNI, apontava a relevância de priorizar às demandas relacionadas à produção e controle de qualidade de produtos, sobretudo as relacionadas à esterilidade e potência das vacinas ofertadas à população.⁵

Naquela época, entre os fatos que reforçaram a importância dessa avaliação prévia da qualidade das vacinas estão o aumento do número de doses de vacinas adquiridas pelo governo e distribuídas à população, somado a isso, a contaminação microbiológica identificada na vacina contra a poliomielite, que ocorreu durante os preparativos da campanha de vacinação infantil de 1981.⁵ Nesse contexto, ocorreu uma mobilização por parte do Ministério da Saúde para adotar mecanismos efetivos para o controle de vacinas a serem utilizadas nas campanhas. Assim, na esfera pública passou a ser discutido a implementação de um sistema nacional de controle de qualidade de vacinas.^4,5

No que tange ao controle de qualidade e a produção de vacinas e medicamentos àquela época, o Brasil apresentava um grau de defasagem institucional e tecnológica quando comparado com os países de primeiro mundo.⁴

Após dez anos da criação do PNI, em 1983, o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), na época considerado o maior laboratório de controle de qualidade de produtos da América Latina, passou a centralizar o controle de qualidade de vacinas empregadas pelo PNI, sendo essencial para o fortalecimento das Políticas Públicas de Imunização.^4,6

O INCQS, como laboratório oficial e de referência do Ministério de Saúde, desde então é responsável pelo controle de qualidade das vacinas do PNI, realizando, ensaios biológicos, microbiológicos e físico-químicos. O departamento de química do INCQS é responsável por onze ensaios, entre eles pH, aspecto, volume médio, umidade residual, teor de formaldeído, teor de alumínio e teor de timerosal. Entre os ensaios citados pode-se destacar as determinações de alumínio (Al) e timerosal, que são realizadas pelo Setor de Elementos Inorgânicos (SELIN) do DQ/INCQS/Fiocruz.

Presente em vacinas como adjuvante, o alumínio tem a função de aumentar o poder imunogênico de algumas vacinas, amplificando o estímulo provocado por esses agentes imunizantes, potencializando a resposta imunológica ao antígeno. Já o timerosal, um composto que contém mercúrio (Hg), possui ação conservante em vacinas.

Além desses, o pH e análise de aspecto são realizados no Setor de Produtos Biológicos do INCQS. A avaliação do aspecto a partir da inspeção visual das vacinas tem como objetivo minimizar a introdução de partículas não intencionais aos indivíduos durante a administração do produto. Os efeitos adversos provocados pela presença de material particulado dependem de muitos fatores, como o tamanho, a composição, o potencial patológico e o número de partículas, população alvo, método de administração e as condições clínicas do indivíduo.⁷ O pH é um parâmetro do controle de qualidade de muitos produtos, que avalia o potencial hidrogeniônico de uma amostra, que está associado à acidez e à basicidade. No caso das vacinas, o pH é propriedade de interesse pois, através desta medida, é possível evidenciar desvios no processo de fabricação.⁸ Todos os ensaios possuem limites especificados na Farmacopeia Brasileira,⁹ os quais devem ser atestados.

Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi analisar retrospectivamente os ensaios físico-químicos de pH, aspecto, teor de alumínio e timerosal nas vacinas provenientes do PNI, no período de 2000 a 2023.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Trata-se de um estudo observacional descritivo do tipo transversal retrospectivo, no qual os dados foram retirados do sistema de gerenciamento de amostra Harpya, período de 2000-2023. Os dados foram obtidos mantendo procedimento de segurança e sigilo do sistema, assegurando a preservação e confidencialidade dos dados empregados nesta pesquisa. Isto inclui, um cuidado especial nos dados relativos à identificação das amostras e características que pudessem informar os fabricantes, com a implementação de medidas abrangentes de segurança e conformidade com regulamentos de proteção de dados.

O ensaio de aspecto da vacina é realizado de forma visual a partir de, pelo menos, 20 unidades amostrais. No caso de lotes com evidências de desvios, o ensaio é realizado com, no mínimo, 20 unidades amostrais. As análises de pH e aspecto são feitas seguindo a Farmacopeia Brasileira.⁹ As determinações de timerosal e Al foram realizados por espectrometria de emissão óptica com plasmas indutivamente acoplado (ICP OES) e o método foi validado segundo critérios descritos na RDC No. 166 de 24 de julho de 2017.^8-10

Amostras

As vacinas são encaminhas lote a lote ao Laboratório de Produtos Biológicos e Artigos de Saúde do INCQS (LBAS/INCQS) para controle de qualidade e somente após o controle são liberadas para uso, garantindo segurança, potência e estabilidade. O LBAS é responsável por conferir número de registro, lote, data de fabricação, data de validade, identificar o tipo de produto, cadastrar os ensaios e distribuir aos laboratórios que irão realizar as análises. As amostras selecionadas nesses estudos foram aquelas distribuídas ao departamento de química para ensaios físico-químicos nos últimos 23 anos (2000-2023).

Determinação de alumínio e timerosal

A quantificação de alumínio, o volume correspondente à dose da vacina foi submetido à digestão em meio ácido e aquecido a 100 ºC por 15 min, sendo, ao final, avolumado para 50 mL. Na análise de timerosal, um composto orgânico contendo mercúrio, 1 mL de amostra foi pipetado em tubos tipo Falcon e avolumado para 10 mL com água deionizada. Esses procedimentos garantem que as amostras estejam adequadamente preparadas para as análises por ICP OES, modelo Optima 8300 (Perkin Elmer).

As metodologias adotadas foram validadas abordando parâmetros analíticos essenciais, como especificidade, seletividade, faixa de trabalho, linearidade, sensibilidade, limites de detecção e quantificação, exatidão e precisão.

A curva de calibração para alumínio foi preparada a partir de um padrão monoelementar com concentração de 1000 mg L^-1 (Merck), variando de 2 a 15 mg L^-1. Para o timerosal, a curva de calibração variou de 0,2 a 2 mg L^-1, utilizando um padrão estoque de 1000 mg L^-1 (Merck). Embora o padrão utilizado seja de timerosal, o equipamento detecta a concentração de mercúrio presente, e optamos por usar o padrão de timerosal para minimizar possíveis efeitos de matriz.

Para assegurar a qualidade dos resultados, foi utilizado um pool de diferentes lotes da mesma vacina, homogeneizados em conjunto. Esse pool foi submetido a testes rigorosos para garantir a precisão e exatidão das análises, com critérios de aceitação estabelecidos para recuperação entre 80-120% e um desvio padrão relativo (RSD) inferior a 10% para cada elemento estudado, conforme as diretrizes do INMETRO.¹⁰ Esses parâmetros são cruciais para garantir a confiabilidade dos resultados e a segurança no processo de controle de qualidade das vacinas.

Determinação de pH

A determinação do pH nas vacinas foi realizada pelo método potenciométrico, que mede o potencial de uma célula eletroquímica sem correntes significativas, conforme a Farmacopeia Brasileira.⁹ A medição do pH baseia-se na diferença de potencial entre dois eletrodos imersos na solução em análise: um eletrodo sensível aos íons hidrogênio e um eletrodo de referência de potencial constante.

No Setor de Produtos Biológicos, utilizou-se o pHmetro Mettler Toledo, modelo SevenCompactTM S220, seguindo as orientações do fabricante. Antes das medições, o equipamento foi calibrado a 25 ºC com soluções tampão certificadas, com valores de pH 4,00; 7,00 e 9,21, abrangendo a faixa típica de pH das vacinas. A calibração foi realizada para garantir a linearidade das respostas às variações de potencial. A adequação do equipamento foi verificada pelo slope obtido, que indica a resposta do eletrodo, devendo situar-se entre 95-105% (conforme critério do fabricante), o que assegura a precisão nas medições das amostras.

Após verificar que o equipamento atendia às condições de uso, foi realizada a medição de um material de referência certificado com pH 7,00 de lote diferente do utilizado na calibração do instrumento. Essa medição foi incluída no gráfico de controle, onde são estabelecidos critérios para garantir a validade dos resultados. O gráfico de controle é um mecanismo interno do laboratório para monitorar o desempenho na execução dos ensaios.

Análises estatísticas

A estatística descritiva foi realizada no programa Microsoft Excel^®, software 2010,¹² incluindo média aritmética, mediana, desvio padrão (SD), teste t de Student com nível de confiança de 95% e análise de variância (ANOVA). Além disso, a incerteza de medição para determinação foi estimada pelo modo bottom-up, onde foram consideradas as incertezas combinadas final de todas as etapas do procedimento analítico: preparação da amostra, preparação de padrões, curva analítica e a incerteza associada a repetibilidade da metodologia que está associada a efeitos aleatórios e foi medida a partir de experimentos repetidos e quantificada pelo desvio padrão da resposta.¹¹

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Determinação de alumínio e timerosal

Foram realizados 9009 ensaios no período de janeiro de 2001 até julho de 2023, sendo realizadas as análises de Al, timerosal, pH e aspecto em 3000, 1926, 3151 e 932 amostras, respectivamente. A Figura 1 mostra o quantitativo dos ensaios de Al e timerosal durante o período estudado.

 

 

Observa-se um aumento do quantitativo de análise em função de campanhas de vacinação específicas. Em 2002, a observação do alto número de ensaios realizados pode ser justificada pela realização da campanha de vacinação contra a rubéola para mulheres na idade fértil e, que também, passou a ser aplicada em crianças de 12 meses.

O aumento do quantitativo de ensaios de timerosal usado como conservante nas vacinas multidoses observados em março de 2010 foi causado pelo início da campanha de vacinação contra a gripe A causado pelo vírus H1N1 que chegou ao Brasil em maio 2009. Nesse período, iniciou, também uma campanha para desmentir boatos sobre a presença de níveis tóxicos de mercúrio na vacina devido a falsa alegação de que o imunizante causava a Síndrome de Guillain-Barré.¹³ Outro destaque da Figura 1 está no ano de 2011 quando teve a segunda etapa da vacinação contra sarampo para crianças e a campanha para poliomielite.

Em 2012, novas vacinas foram introduzidas no PNI como a pentavalente e a póliomelite inativada. A vacina pentavalente foi substituída pela heptavalente no final de 2014 com a inclusão das vacinas inativadas contra poliomielite, reunindo, em apenas uma injeção, vários componentes imunobiológicos. Entre 2019 e 2022, o Ministério da Saúde investiu em campanhas de vacinação contra febre amarela, influenza e sarampo.¹⁴

A queda nas análises de timerosal entre 2016 e 2019 se justifica pelo fato da interrupção das análises em função da troca de metodologia analítica e problemas em equipamentos no setor responsável. Já em março de 2020, foi decretado a pandemia pela COVID-19, promovendo a redução das determinações de timerosal e alumínio, uma vez que as vacinas para COVID-19 não possuem em sua composição esses componentes.

A Tabela 1 apresenta as figuras de mérito para determinação de Al e timerosal em vacina.

 

 

Os limites de quantificação estão adequados para faixa de trabalho. Quanto a avaliação da recuperação e da precisão os valores estão dentro do critério de aceitação de acordo com o INMETRO,¹⁰ para recuperação de 80-110% e o desvio padrão relativo (RSD) < 10%. O resultado da incerteza de medição expandida para determinação da concentração de timerosal variou de 5-12%, essa variação é em função da concentração de Hg nos diferentes tipos de vacina. A incerteza que mais contribuiu foi a precisão 52%, preparo dos padrões 40,5% e a curva de calibração 7,5%. Para teor de alumínio a incerteza expandida foi de 3%, sendo a incerteza que mais contribuiu foi o preparo da amostra (44%), seguida da curva de calibração (27%), precisão (15%) e preparo dos padrões (14%).

A Tabela 2 apresenta os resultados de Al e timerosal nas vacinas analisadas durante o período de janeiro de 2002 a julho de 2023.

 

 

Dentre as vacinas analisadas neste estudo, a vacina que apresentou uma maior concentração de Al foi a heptavalente. De acordo com a Farmacopeia Brasileira,⁹ o limite máximo de Al é de 1,25 mg dose^-1, sendo assim a concentração determinada nos diferentes tipos de vacina está muito abaixo do permitido. Os valores do desvio padrão relativo (RSD, %) foram considerados baixos, com o maior valor de 13% na vacina pentavalente. Segundo o INMETRO,¹⁰ o RSD aceitável para repetibilidade varia de 11-15%, mas é importante destacar que esses valores se aplicam a medições repetidas de uma mesma amostra. No estudo, o RSD foi calculado entre lotes diferentes e fabricantes diferentes da mesma vacina, o que pode justificar o aumento no RSD observado.

O timerosal, substância que contém mercúrio, é adicionado em frascos multidoses não só para impedir o risco de contaminação por bactérias e/ou fungos nas principalmente em casos de contaminação acidental, por repetidas punções no mesmo frasco. Em 2008, a Organização Mundial de Saúde defendeu o uso do timerosal em vacinas multidose uma vez que estudos comprovavam que possível risco de intoxicação por Hg foi mínimo quando comparado ao risco proveniente de contaminação acidentais.¹⁵

As vacinas que apresentam maior concentração de timerosal foram hepatite B, DT e DTP, sendo que a média das concentrações é estatisticamente igual através do teste da variância (ANOVA). De acordo com a Farmacopeia Brasileira, a concentração de timerosal nas vacinas deve ser menor ou igual a 200 mg L^-1, sendo assim a concentração nessas vacinas foi 50% menor que o valor permitido. Quanto a vacina influenza, foi observado que o teor de timerosal é 95% (2,9-6,4 mg L^-1) menor que o valor permitido, sendo necessária técnicas analíticas modernas, sensíveis e exatas para o controle do timerosal nesse produto. Os valores do desvio padrão relativo (RSD, %) são aceitáveis, variando de 27% para a vacina pentavalente, e 20% da vacina da influenza. Esses dados mostram uma variação entre os fabricantes, uma vez que os resultados foram analisados juntos não levando em consideração o fabricante do produto.

Análise de aspecto e pH

No período compreendido entre janeiro de 2001 e julho de 2023 foram realizados ensaios de aspecto por inspeção visual, em 513 lotes de vacinas, dos quais 473 foram liberados como satisfatórios e 40 considerados insatisfatórios. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

 

 

As amostras insatisfatórias, foram de quatro fabricantes e ocorreram nos anos de 2013, 2014, 2018, 2019 e 2020, não havendo registro em outros anos. O quantitativo de amostras insatisfatórias e o ano das ocorrências estão ilustrados, conforme a Figura 2.

 

 

Entre os anos de 2013 e 2014, três lotes das vacinas de difteria e tétano adultos, poliomielite 1, 2 e 3 (atenuada) e hepatite B foram consideradas insatisfatórias. Naquela ocasião, o ensaio de aspecto por inspeção visual não era estabelecido na rotina do controle de qualidade dos produtos destinados à análise laboratorial.

Foi no ano de 2018, que o teste foi inserido para todos os produtos na forma líquida, quando 12 lotes da vacina conjugada (adsorvida) difteria, tétano, pertussis (célula completa), hepatite B (rDNA) e haemophilus tipo B, produzidas pelo fabricante C, apresentaram grumos de coloração leitosa aderidos às paredes do frasco, sendo consideradas insatisfatórias para aplicação na população.

Tendo em vista essas ocorrências e as reclamações enviadas pela Coordenação Geral do Programa Nacional de Imunizações (CGPNI), foi implementada a análise de aspecto por inspeção visual como medida preventiva no controle de qualidade, dado o risco da administração do produto com desvios de qualidade na população. É importante ressaltar que, segundo a Farmacopeia Brasileira¹⁶ vigente naquela ocasião, não era obrigatória a realização do ensaio de aspecto por inspeção visual pelo Laboratório Nacional de Controle, sendo de total responsabilidade do fabricante a execução deste teste no produto final.

No mesmo período, 04 lotes da vacina conjugada (adsorvida) difteria, tétano, pertussis (DTP), também fabricadas por C, foram reprovadas pela mesma razão. Assim, foram totalizados 36 lotes insatisfatórios fornecidos pelo mesmo produtor no período compreendido de 2018 a 2019, dos quais 32 eram da vacina conjugada (adsorvida) difteria, tétano, pertussis (célula completa), hepatite B (rDNA) e haemophilus tipo B, sendo 20 lotes recebidos em 2019, provocando o desabastecimento do produto nos postos de saúde.

Em relação aos ensaios de pH realizados de janeiro 2001 a julho de 2023, o INCQS realizou a análise de pH em 2212 lotes de vacinas. Todas apresentaram resultados satisfatórios, conforme o critério de aceitação estabelecido no registro do produto. Esses ensaios foram realizados conforme Farmacopeia Brasileira,⁹ utilizando o método potenciométrico.

No ano de 2021, o Setor de Produtos Biológicos adquiriu um eletrodo específico para a realização das medidas de pH que utilizam pequenos volumes de amostra, mais apropriado para análises de vacinas, fornecidas em frascos contendo 2,5 mL do produto. Isso porque, ao contrário do que ocorre com os fabricantes, o INCQS recebe um número restrito de unidades amostrais para a realização dos ensaios do controle de qualidade. Assim, a utilização do novo dispositivo permitiu que as medidas de pH fossem feitas diretamente nos frascos contendo a amostra, sem a necessidade de preparar um pool com vários frascos para compor um volume mínimo para a análise. Dessa forma, as determinações individuais de pH contribuem para melhoria do processo de medição no controle de qualidade, pois possibilita o maior número de medições e, consequentemente, maior significância estatística dos resultados, no que diz respeito ao valor aceito como verdadeiro de pH para os lotes analisados. Além de evitar que o produto ficasse mais exposto e sujeito à contaminação, aumentando a probabilidade de realização de reteste.

A Tabela 4 apresenta os resultados obtidos no ensaio de pH em 197 lotes de vacinas, utilizando o eletrodo adequado para leitura direta da amostra, sem necessidade de realização do pool.

 

 

Os resultados da média e a da mediana são estatisticamente iguais, para todas as vacinas avaliadas individualmente, que apresentam apenas um fabricante. Os RSD foram considerados relativamente baixos, com o maior valor de 7% observado na vacina pneumocócica adsorvida, difteria, tétano, pertussis, hepatite B. Um RSD de 7% indica baixa variabilidade no pH e consistência entre os lotes analisados, sugerindo uma homogeneidade aceitável. No entanto, como o número de amostras foi limitado, é recomendável realizar uma avaliação estatística com mais lotes para confirmar essa homogeneidade.

No caso das vacinas adsorvida difteria e tétano adulto (DT)/vacina adsorvida difteria e tétano adulto e adolescente (DT)/DT infantil e da vacina adsorvida difteria, tétano, pertussis, hepatite B (recombinante) e haemophilus influenzae B (conjugada) - vacina pentavalente, que possuem número de fabricante igual a três, foi necessário a realização do teste de ANOVA para comparação das médias. Entretanto, na vacina DT, um dos fabricantes enviou apenas 1 lote do imunizante, impossibilitando a aplicação do teste de ANOVA, que deve ser feito com pelo menos 3 conjuntos de dados e o mínimo de 2 resultados em cada conjunto. Consequentemente, não foi possível fazer a avaliação estatística para esse produto.

Já a vacina pentavalente, quando aplicado o teste ANOVA, o valor p obtido foi de 0,010 para o nível de significância de 5%, com n amostral de 28. Neste caso, rejeita-se a hipótese nula, e admite-se que a média dos lotes, de pelo menos um dos fabricantes, é diferente das médias dos lotes dos outros dois fabricantes. Assim, a avaliação das médias deve ser feita separadamente para cada fabricante, não sendo possível fazer inferências sobre o pH do produto.

No caso da vacina adsorvida difteria, tétano e pertussis (DTPa) e da vacina adsorvida difteria, tétano, pertussis (acelular), hepatite B (recombinante), poliomielite 1, 2 e 3 (inativada) e haemophilus influenzae B (conjugada), a quantidade de lotes recebidos foi muito pequena para que fosse feita qualquer avaliação do pH no produto, que não fosse em relação ao critério de aceitação estabelecido pelo fabricante.

 

CONCLUSÕES

No período avaliado no presente estudo foi possível observar que as metodologias utilizadas para as análises de controle de qualidade referentes as vacinas foram adequadas. A realização desses ensaios permite garantir a segurança desses imunobiológicos, uma vez que podem representar risco para saúde e por isso possuem limites especificados na Farmacopeia Brasileira.

Ao longo da história do PNI e a complexidade do programa, entre as conquistas sem dúvida a segurança das vacinas foi fundamental. Com isto, a atuação dos laboratórios públicos como o INCQS desempenha um papel crucial o monitoramento da qualidade das vacinas visto que a sua utilização é realizada em toda população brasileira, inclusive em crianças e idosos.

Sendo assim, pode-se destacar que um dos grandes desafios para os laboratórios públicos que realizam o controle de qualidade de produtos de interesse sanitário, como as vacinas, é acompanhar o avanço das novas tecnologias empregadas no desenvolvimento das novas vacinas que consequentemente necessitam de técnicas e metodologias mais sensíveis para garantirem a segurança do produto aplicado na população do Brasil.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem às seguintes agências brasileiras: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES), código financeiro 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Ministério da Saúde.

 

REFERÊNCIAS

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3. Homma, A.; Maia, M. D. L. D. S.; Azevedo, I. C. A. D.; Figueiredo, I. L.; Gomes, L. B.; Pereira, C. V. D. C.; Paulo, E. F.; Cardoso, D. B.; Cadernos de Saúde Pública 2023, 39, e00240022. [Link] acessado em Novembro 2024

4. Ponte, C. F.; História, Ciência e Saúde-Manguinhos 2003, 10, 619. [Link] acessado em Novembro 2024

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6. Gadelha, C. A. G.; História, Ciência e Saúde-Manguinhos 1996, 3, 111. [Link] acessado em Novembro 2024

7. Bukofzer, S.; Ayres, J.; Chavez, A.; Devera, M.; Miller, J.; Ross, D.; Shabushnig, J.; Vargo, S.; Watson, H.; Watson, R.; PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2015, 69, 123. [Link] acessado em Novembro 2024

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9. Farmacopeia Brasileira, 6ª ed.; Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA): Brasília, 2019. [Link] acessado em Novembro de 2024

10. DOQ-CGCRE-008: Orientação sobre Validação de Métodos Analíticos, Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO): Rio de Janeiro, 2020. [Link] acessado em Novembro de 2024

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16. Farmacopeia Brasileira, 5ª ed.; Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA): Brasília, 2010. [Link] acessado em Novembro 2024

 

Editor Associado responsável pelo artigo: Eduardo M. Richter