JBCS

INTRODUÇÃO

A presença de poluentes orgânicos emergentes em águas superficiais, esgoto municipal e, inclusive, em água potável clorada destinada ao abastecimento público tem sido relatada pela comunidade científica.^1-3 Poluentes emergentes são definidos como compostos que não são usualmente monitorados ou que ainda não possuem legislação regulatória específica, mas que apresentam potencial risco à saúde humana e ao meio ambiente.⁴

Dentre os principais riscos da presença de poluentes emergentes no ambiente destaca-se a preocupação com o desenvolvimento de bactérias resistentes. Bactérias expostas a resíduos de agentes antimicrobianos podem sofrer modificações em sua carga genética, elevando a resistência das mesmas em relação ao antimicrobiano as quais foram expostas.⁵ Esses compostos oferecem, inclusive, riscos para espécies não-alvo, por sua toxicidade, pela possibilidade de bioacumulação e por possíveis efeitos ecotoxicológicos ainda pouco conhecidos.

Resíduos de fluoroquinolonas já foram detectados em efluentes hospitalares (44 µg L^-1).⁵ A flumequina, que pertence à classe das fluoroquinolonas, tem sido utilizada na medicina veterinária para combater principalmente bactérias Gram-negativas, como por exemplo E. coli. Poucos são os trabalhos de monitoramento ambiental e estudos de degradação desse composto.

Os processos oxidativos avançados (POA) têm sido reportados como métodos alternativos para a degradação de poluentes emergentes, dentre eles a flumequina.^6-10 Os POA podem ser definidos como processos baseados na formação do radical hidroxila (^•OH), o qual possui um elevado potencial de redução (E = 2,8 V).¹¹ Os POA eletroquímico (POAE) e fotoeletroquímico (POAFE) são eficientes na degradação de compostos orgânicos recalcitrantes,^12-15 e já foram empregados na degradação de outras quinolonas, como ofloxacina e enrofloxacina.^12,14 No entanto, não são encontrados dados sobre a degradação de flumequina pelos referidos processos.

Jara et al.¹⁴ avaliaram a degradação da ofloxacina (25 mg L^-1) pelo processo fotoeletroquímico (Ti/Pt, DSA^®, 40 mmol L^-1 de Na₂SO₄ como eletrólito suporte) e comprovaram que, ao aplicar uma densidade de corrente elétrica de 200 A m^-2, 60% da fluoroquinolona foi degradada após 100 min de ensaio.

Guinea et al.¹² avaliaram a degradação da enrofloxacina (158 mg L^-1) em solução aquosa, empregando como anodo Pt ou diamante dopado com boro BDD ("boron-doped diamond") e uma densidade de corrente de 33 mA cm^-2. Aproximadamente 23% e 37% da fluoroquinolona foi degradada em 60 min utilizando-se eletrodos de Pt e BDD, respectivamente, atingindo 90% e 97% em 360 min.

Dos processos eletroquímicos, aqueles que empregam oxidação anódica são os mais comumente usados para a remoção de compostos orgânicos em baixas concentrações. Durante o processo, pode ocorrer a troca direta de elétrons entre o composto orgânico e a superfície do eletrodo e, também, a troca indireta, pela intermediação de espécies eletroativas oxidantes formadas no anodo.¹³ Pinhedo et al.¹⁶ e Fukunaga et al.¹⁷ destacaram a eficiência dos eletrodos metálicos de Ti revestidos com óxidos nobres, conhecidos como DSA^® (Dimensionally Stable Anode), para a degradação de ácidos húmicos e formaldeído, respectivamente.

Os principais objetivos do presente trabalho são a avaliação da degradação da flumequina, o monitoramento da atividade antimicrobiana das soluções submetidas aos processos eletroquímico e fotoeletroquímico e a identificação dos produtos de degradação.

MATERIAL E MÉTODOS

Reagentes e soluções

Flumequina (99%) foi adquirida da empresa Sigma-Aldrich, metanol (grau HPLC) e BaCl₂.2H₂O (99%) da J. T. Baker, ácido oxálico (99.5%) da Merck, H₃PO₄ (85%) e KH₂PO₄ (98%) da Nuclear e KOH (85%) da Ecibra. H₂SO₄ concentrado, NaOH (97%) e K₂SO₄ foram adquiridos da Synth. Caldo de cultura Mueller-Hinton e Mueller-Hinton/Agar foram obtidos da Himidia. A água ultrapura utilizada no estudo foi obtida por um sistema Millipore (Milli-Q Academic water purification system). As soluções aquosas de flumequina (500 µg L^-1) utilizadas nos ensaios foram preparadas a partir da diluição da solução estoque (250 mg L^-1) em água ultrapura (Milli-Q).

Sistema experimental

Os ensaios de degradação foram realizados em um reator fotoeletroquímico similar ao descrito por Pinhedo et al.¹⁶ O sistema experimental utilizado para a degradação da flumequina era constituído de um reator de vidro (capacidade de 1,2 L) e de uma bomba peristáltica para manter a solução em constante recirculação e agitação. O anodo possuía a composição de óxidos na proporção 70TiO₂/30RuO₂ (DSA^®, comercial de titânio revestido) com área de 200 cm², fornecido por De Nora do Brasil. Uma tela de TiO₂ na forma metálica (catodo) foi fixada no interior do cilindro do anodo, mantendo-se um espaçamento de 3,0 mm. Por fim, um tubo de quartzo foi inserido concentricamente ao catodo, para servir de suporte para a lâmpada utilizada nos experimentos (UV-C germicida de 11 W e 80 W). Na Figura 1 é apresentado o esquema do sistema fotoeletroquímico.

Figura 1. Sistema operacional do reator foto-eletroquímico: 1 - tubo de quartzo; 2 - catodo; 3 - anodo; 4 - reservatório; 5 - bomba peristáltica

A degradação da flumequina foi avaliada em diferentes tempos de reação (0 a 60 min). As densidades da corrente foram 7,5, 15, 22,5, 30, 37,5 e 45 mA cm^-2. Como eletrólito suporte foi utilizado K₂SO₄ em duas concentrações diferentes, 25 e 50 mmol L^-1.

Método analítico

O método analítico utilizado para determinação da flumequina consistiu na concentração do analito por extração em fase sólida (EFS) e quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com detecção por UV. Para a EFS, foi utilizado o cartucho C₁₈ (500 mg/6 mL) da Varian, o qual foi condicionado com 6 mL de metanol e 6 mL de água ultrapura. Após a percolação da solução (1000 mL) pelo cartucho, a flumequina e os produtos de degradação foram eluídos com 4 mL de metanol. Foi realizada a extração em fase sólida para permitir a quantificação de baixas concentrações da flumequina pela técnica analítica empregada, ou seja, a cromatografia líquida de alta eficiência. Destaca-se que é importante desenvolver trabalhos utilizando-se baixos teores iniciais do fármaco de interesse, aproximando-se daqueles encontrados em matrizes aquosas reais.⁵

O cromatógrafo a líquido de alta eficiência utilizado no desenvolvimento deste trabalho é composto por um sistema de bombeamento unitário modelo Waters 510 (Waters, EUA), injetor modelo 7725 (Rheodyne, EUA), amostrador de 20 µL e detector UV modelo 486 (Waters, EUA). A quantificação foi realizada em 236 nm. Para a aquisição dos dados foi utilizado um integrador modelo 746 (Waters, EUA). A coluna analítica utilizada para a separação foi a XBridge^TM RP18 da Waters (250 mm x 4,6 mm DI, 5 µm). A fase móvel era constituída por metanol e 0,01 mol L^-1 ácido oxálico (60:40, v/v). A vazão foi de 1 mL min^-1.

Atividade antimicrobiana

O monitoramento da atividade antimicrobiana foi realizado utilizando-se a bactéria E. coli K12 (ATCC 23716) como organismo-teste, conforme metodologia descrita por da Silva et al.⁸ e Rodrigues-Silva et al.^9-10 Esses ensaios são baseados na avaliação da inibição do crescimento da cultura das bactérias por meio do monitoramento da turbidez da suspensão microbiana.

A concentração de flumequina necessária para inibir o crescimento de 50% das bactérias E. coli (CE₅₀) foi avaliada e utilizada como um parâmetro de controle. A cultura de E. coli foi exposta a concentrações de flumequina variando entre 21,7 µg L^-1 e 1,25 mg L^-1. O valor de CE₅₀ assumido para a flumequina foi de 14,65 x 10^-5 g L^-1, baseado na média de 10 ensaios realizados em duplicata e em 10 diferentes dias.

Os resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana foram comparados aos das curvas de dose resposta para o padrão da flumequina (controle) e para a solução inicial não degradada (t = 0 min) e foram avaliados usando o software Graph-Pad Prism 5.0. As atividades antimicrobianas residuais das soluções submetidas aos processos eletroquímico e fotoeletroquímico foram avaliadas em três condições diferentes: aplicando 15, 30 e 45 mA cm^-2 de densidade de corrente e utilizando 25 mmol L^-1 de eletrólito suporte (K₂SO₄).

Identificação de intermediários

Os intermediários de degradação formados foram avaliados utilizando-se espectrometria de massas, massas em tandem (MS/MS) e pela avaliação do perfil isotópico dos intermediários propostos. As estruturas dos possíveis produtos formados foram propostas baseadas nos espectros de massas, composição elementar do fármaco e mecanismos de reações apresentados na literatura especializada.^9-10,18-20 A estrutura e composição química dos intermediários propostos foram obtidas utilizando o software ChemDoodle v.4.1.1.

Os produtos de degradação formados foram avaliados após a submissão de soluções aquosas de flumequina (10 mg L^-1) aos processos de degradação. Essa maior concentração do fármaco foi utilizada para intensificar o sinal dos produtos de degradação e para evitar a perda dos analitos na etapa de EFS.

Foi utilizado um espectrômetro de massas UHPLC-MS/MS Waters UPLC Acquity - TQD Quattro Micro API. A condição típica de operação foi: fluxo de gás no cone (100 L h^-1), fluxo do gás de dessolvatação (800 L h^-1), polaridade (ES+), energia do capilar (3.000 V), energia do cone (25 V), energia do cone de extração (3 V), temperatura de dessolvatação (300 ºC) e energia de ionização (0,5 V). O espectro foi adquirido entre m/z 100 e 600.

RESULTADOS

Influência da fotólise

A degradação de flumequina (500 µg L^-1) pelos processos de fotólise e de fotocatálise heterogênea com TiO₂ imobilizado foi avaliada isoladamente para a melhor compreensão da contribuição desses processos nos ensaios nos quais foram aplicados os processos eletroquímico e foto-eletroquímico.

Para o processo de fotólise, utilizando uma lâmpada UV_254nm com 11 W de potência atingiu-se a degradação máxima da flumequina em solução aquosa de 26,2%, em 60 min de ensaio; em 15 min de iluminação, 3,3% do fármaco foi degradado. Ao aumentar a potência da lâmpada em aproximadamente 7 vezes (UV_254nm com 80 W), a eficiência do processo de fotólise foi de 10,3% após 15 min e aumentou para 38% após 60 min de ensaio.

A fotocatálise heterogênea foi avaliada utilizando o TiO₂ imobilizado na forma de um eletrodo. Quando empregado apenas o eletrodo (anodo-70TiO/30RuO ou catodo-Ti na forma metálica), não foi observada uma degradação do fármaco superior à obtida pela fotólise, independentemente da potência da lâmpada utilizada. Utilizando a lâmpada de menor potência, em 60 min de contato, 24,4% do fármaco foi degradado e, com a lâmpada de 80 W, atingiu-se 38,1% de degradação nesse mesmo período de ensaio.

Influência da concentração de eletrólito suporte

A influência da concentração do eletrólito suporte durante os ensaios com processos eletroquímico e fotoeletroquímico foi avaliada utilizando-se duas concentrações de sulfato de potássio: 25 e 50 mmol L^-1. Conforme apresentado na Figura 2, para o processo eletroquímico (15 mA cm^-2), quando utilizada a menor concentração de eletrólito suporte (25 mmol L^-1), a degradação máxima da flumequina foi de 19,4% em 60 min de reação. Dobrando-se a concentração do K₂SO₄, atingiu-se 26,1% de degradação.

Figura 2. Degradação de flumequina pelo processo eletroquímico e foto-eletroquímico utilizando duas concentrações de eletrólito suporte (25 e 50 mmol L^-1)

Com relação ao processo foto-eletroquímico, quando aplicada uma densidade de corrente de 7,5 mA cm^-2, a degradação máxima atingida foi de aproximadamente 40%, independentemente da concentração do eletrólito suporte.

É importante destacar que, devido ao baixo incremento na eficiência de degradação obtido com a utilização da maior concentração de eletrólito suporte, optou-se em dar continuidade aos experimentos de degradação utilizando a menor concentração do sulfato de potássio, ou seja, 25 mmol L^-1.

Degradação da flumequina pelos processos eletroquímico e fotoeletroquímico

Para o processo POAE, utilizando-se 25 mmol L^-1 de K₂SO₄ como eletrólito suporte, foi observado que a elevação gradual da densidade de corrente de 15 até 45 mA cm^-2 promoveu um aumento na degradação de flumequina. Nos primeiros 15 min de ensaio, a degradação máxima atingida foi de 43,3% quando empregada densidade de corrente de 45 mA cm^-2. Em 60 min, 19,4%, 49,3%, 68,2%, 74,9% e 82,9% do fármaco foi degradado quando aplicados 15, 22,5, 30, 37,5 e 45 mA cm^-2, respectivamente.

O emprego da radiação UV_254nm (11 W) (processo POAFE) resultou no aumento da eficiência da degradação da flumequina quando comparado ao processo POAE, para densidades de corrente de até 22,5 mA cm^-2. Após 45 min de ensaio, quando empregada densidade de corrente de 15 mA cm^-2, as degradações atingidas pelo processo POAE e POAFE foram de 3,2% e 50,3%, respectivamente, conforme apresentado nas Figuras 3A e 3B. A combinação do processo eletroquímico com a fotólise resultou em efeito sinérgico na eficiência de degradação apenas quando empregada a densidade de corrente de 15 mA cm^-2.

Figura 3. Degradação de flumequina pelos processos (A) eletroquímico e (B) foto-eletroquímico (25 mmol L^-1 de K₂SO₄, UV_254nm, 11 W, densidade de corrente variando entre 7,5 e 45 mA cm^-2)

Subsequentes aumentos na densidade da corrente (30 a 45 mA cm^-2) não promoveram significativo ganho de eficiência em relação ao processo POAE isoladamente. Em 60 min de ensaio, o processo POAFE promoveu a degradação máxima de 85% da flumequina, quando aplicada uma densidade de corrente de 45 mA cm^-2.

Comparando-se os resultados obtidos pelos processos POAE e POAFE com trabalho prévio,¹⁰ no qual foi empregado reagente de Fenton, observou-se uma maior degradação da flumequina pelos processos eletroquímicos. Quando utilizado 0,5 mmol L^-1 de Fe(II) e 2,0 mmol L^-1 de H₂O₂, aproximadamente 40% da flumequina foi degradada em 30 min.¹⁰ Nesse mesmo tempo de ensaio, utilizando a maior densidade de corrente avaliada (45 mA cm^-2), os processos eletroquímico e fotoeletroquímico foram capazes de degradar 55,1% e 69,4%, respectivamente. Salienta-se ainda que, para o processo Fenton, não foi verificado um aumento da degradação ao longo do tempo de ensaio,¹⁰ o qual foi observado para os experimentos utilizando o eletrodo DSA.

Intermediários formados

A avaliação dos intermediários da degradação da flumequina já foi previamente discutida e analisada para os processos oxidativos avançados, tais como UV/H₂O₂, fotocatálise, reagente de Fenton e foto-Fenton.^9-10,18,19 Entretanto, não há relatos de investigações da degradação da flumequina e da avaliação dos intermediários formados durante a aplicação dos processos eletroquímico e foto-eletroquímico. Nas Figuras 4 e 5 são apresentados os espectros de massa obtidos para as soluções submetidas a esses processos.

Figura 4. Espectros de massa das soluções submetidas ao processo eletroquímico (30 mA cm^-2). (A) t = 0 min, (B) t = 15 min, (C) t = 30 min, (D) t = 45 min e (E) t = 60 min

Figura 5. Espectros de massa das soluções submetidas ao processo foto-eletroquímico (UV_254nm, 11W e 30 mA cm^-2). (A) t = 0 min, (B) t = 15 min, (C) t = 30 min, (D) t = 45 min e (E) t = 60 min

De acordo com Albini e Monti,²⁰ a perda do flúor é uma das principais rotas de degradação das quinolonas quando submetidas à radiação UV. Inclusive, o aumento da concentração de fluoreto em soluções de flumequina submetidas aos POA foi reportado por Klamerth et al.²¹ e por Sirtori et al.¹⁹ Dessa forma, é possível propor que o radical hidroxila gerado nesses processos possa ter promovido a formação do produto m/z 244 (5-metil-1-oxo-6,7-dihidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolina-2-ácido carboxílico), pelo processo de perda do flúor da molécula da flumequina, conforme apresentado na Figura 6. A identificação do produto de degradação com m/z 244 corrobora com os estudos de Rodrigues-Silva et al.^9-10

Figura 6. Produto de degradação da flumequina

A identificação dos demais produtos da degradação, apresentados nos espectros de massa das Figuras 4 e 5, é complexa, tendo em vista a possibilidade de formação de adutos entre os fragmentos e o K⁺, devido ao excesso de K₂SO₄ em relação à concentração de flumequina. Adutos são íons formados pela combinação direta entre a molécula ionizada e outro íon que não seja um próton (H⁺), e não se fragmentam quando empregada energia de ionização normalmente utilizada em análise de massa em tandem.²² Os produtos formados com m/z 245, 217, 213, 197 e 175, presentes com um sinal intenso nos espectros de massa das Figuras 4 e 5, não puderam ser identificados e propostos, pois não foi possível fragmentar esses analitos por análises de MS/MS. Presume-se que esse fato tenha ocorrido, provavelmente, por esses intermediários serem adutos dos intermediários de degradação formados durante a aplicação dos processos eletroquímicos.

Remoção da atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana da flumequina está relacionada com a formação de ligações de hidrogênio entre os grupos aceptores (-COOH, -C=O e -F) com o DNA-girase, resultando na inibição da duplicação da bactéria.²³ Caso ocorram alterações nos sítios ativos onde se formam as ligações de hidrogênio, espera-se que a atividade antimicrobiana do intermediário formado diminua. Porém, as reações entre os radicas hidroxila e as quinolonas não são totalmente identificáveis, uma vez que o radical hidroxila não é seletivo, podendo entrar em contato com qualquer região da molécula alvo. É imprescindível a utilização de ensaios biológicos capazes de avaliar a atividade antimicrobiana residual da solução, ou seja, do composto original e de seus intermediários de reação. Do ponto de vista ambiental essa avaliação é importante e permite verificar possíveis efeitos sinérgicos e antagônicos.

Foram realizados ensaios em branco com o eletrólito suporte e não foi observada inibição do crescimento da cultura de bactérias E. coli. Em nenhuma das condições avaliadas no processo eletroquímico (densidade de corrente de 15, 30 e 45 mA cm^-2) foi observada a total degradação do fármaco e a total remoção da atividade antimicrobiana. Observou-se uma redução gradativa da atividade antimicrobiana com o aumento do tempo de reação e da densidade de corrente. Após 45 min de reação, a atividade antimicrobiana da solução reduziu 44,7, 75,8 e 83,6% quando aplicadas densidades de corrente de 15, 30 e 45 mA cm^-2, respectivamente. A máxima redução da atividade antimicrobiana observada para o processo POAE foi de 92,7% em 60 min, quando empregada densidade de corrente de 45 mA cm^-2 (Figura 7).

Figura 7. Atividade antimicrobiana das soluções de flumequina submetidas aos processos eletroquímico (A) 15 mA cm^-2, (B) 30 mA cm^-2 e (C) 45 mA cm^-2, e foto-eletroquímico (D) 15 mA cm^-2, (E) 30 mA cm^-2 e (F) 45 mA cm^-2

No processo fotoeletroquímico, diferentemente do ocorrido no processo eletroquímico, foi observada a total remoção da atividade antimicrobiana das soluções; no entanto, essa total remoção foi observada somente quando aplicada densidade de corrente de 45 mA cm^-2 (Figura 7). Nessas condições, a atividade antimicrobiana foi reduzida em aproximadamente 95% e 100% após 45 e 60 min de ensaio, respectivamente.

O produto de degradação identificado neste trabalho (m/z 244) provavelmente apresenta atividade antimicrobiana inferior à da flumequina. Quando a molécula de flumequina perde o flúor ligante no C-6, a afinidade com o DNA-girase diminui,²³ ou seja, a atividade antimicrobiana do composto é reduzida.

Poucos são os trabalhos relativos à avaliação quantitativa da atividade antimicrobiana de soluções de flumequina submetidas a processos oxidativos avançados, ou seja, que envolvem a geração dos radicais hidroxila.^9,10 Os resultados de remoção da atividade antimicrobiana obtidos nesse trabalho corroboram com os trabalhos publicados por da Silva et al.⁸ e Rodrigues-Silva et al.,^9,10 ou seja, foi verificada uma diminuição da atividade antimicrobiana com o aumento da eficiência de degradação.

Da Silva e colaboradores constataram a total remoção da atividade antimicrobiana de soluções de flumequina (500 µg L^-1) submetidas ao processo UV/H₂O₂ (C_{H2O2 inicial} = 1 mmol L^-1 e 45 min de ensaio).⁸ Rodrigues-Silva et al.¹⁰ não observaram atividade antimicrobiana residual em soluções de flumequina submetidas ao processo foto-Fenton (C_H2O2-inicial = 10 mmol L^-1, C_{Fe(II)-inicial} = 0,25 mmol L^-1, C_{flumequina-inicial} = 500 µg L^-1) após 15 min de ensaio. Rodrigues-Silva et al.⁹ também reportaram a remoção da atividade antimicrobiana de soluções de flumequina (500 µg L^-1) submetidas ao processo fotocatálise com TiO₂ em suspensão. Observaram que, após 15 min de ensaio, aumentando a concentração do catalisador (entre 0,16 e 0,94 mmol L^-1), a atividade antimicrobiana da solução foi decaindo gradativamente. A total remoção da atividade antimicrobiana foi observada após 30 min de ensaio quando utilizado 0,31 mmol L^-1 de TiO₂.

CONCLUSÕES

Os processos POAE e POAFE atingiram eficiências de degradação máximas similares de 83% e 85%, respectivamente, após 60 min de ensaio, quando empregada densidade de corrente de 45 mA cm^-2 e 25 mmol L^-1 de K₂SO₄ como eletrólito suporte. O aumento da densidade de corrente aplicada promoveu um aumento na degradação de flumequina.

O processo POAFE foi mais eficaz do que o processo POAE para a remoção da atividade antimicrobiana. A máxima redução da atividade antimicrobiana foi observada em 60 min de ensaio quando aplicada a maior densidade de corrente avaliada nesse trabalho: 45 mA cm^-2.

A utilização de K₂SO₄ como eletrólito suporte dificultou a identificação dos produtos de degradação, devido à formação de adutos. O intermediário com m/z 244 foi identificado, o qual foi formado a partir da perda do flúor da molécula da flumequina.

AGRADECIMENTOS

À CAPES pelas bolsas concedidas a C. Rodrigues-Silva e M.G. Maniero (PNPD0233080) e à Fapesp pelo apoio financeiro (2008/06470-0).

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