JBCS

INTRODUÇÃO

A família Euphorbiaceae, representada por 317 gêneros e aproximadamente 8000 espécies, encontra-se distribuída nos mais variados tipos de vegetações e habitats, em especial, nas regiões tropicais.¹ Um dos gêneros mais importantes e conhecidos desta família é Jatropha L. (subfamília Crotonoideae, tribo Jatropheae), o qual abrange cerca de 170 espécies distribuídas nas regiões semi-áridas da África e das Américas.² Jatropha constitui um grupo de vegetais de importância econômica, especialmente devido aos seus usos medicinais e ornamentais e, mais recentemente, como fonte de biodiesel natural.^2-4 Devido à fácil propagação de suas sementes, espécies tais como J. gossypiifolia, J. curcas e J. multifida, têm sido cultivadas em várias partes do mundo, principalmente na África, com fins ornamentais e/ou como cercas vivas. Plantas do gênero Jatropha são produtoras em potencial de metabólitos secundários bioativos como terpenos, esteróides,^5,6 alcalóides,^3,7 saponinas, taninos,^3,6 lignanas,^2,5 flavonoides^5-7 e peptídeos.³ De fato, compostos com atividades anticâncer, anti-inflamatória, anticoagulante, antibacteriana, moluscicida, antidiarreica e antiviral^2,3,8 têm sido isolados de Jatropha, corroborando com suas propriedades medicinais. No Nordeste do Brasil, espécies como J. curcas, J. mollissima e J. ribifolia são comercializadas em feiras livres com fins terapêuticos. Vale salientar que, na medicina veterinária, espécies de Jatropha têm sido investigadas, in vivo, quanto às propriedades venenosas sobre ratos e cabras.³

Motivados pelo exposto, deu-se início à investigação química de J. ribifolia, resultando no isolamento e identificação de vários metabólitos secundários. O único estudo químico realizado sobre esta espécie mostrou apenas o isolamento dos compostos jatrofona e ácido ciperanóico.⁹

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo químico das raízes e do caule de J. ribifolia, utilizando métodos convencionais de cromatografia em gel de sílica e cromatografia líquida de alta eficiência, culminou no isolamento e identificação de cinco terpenoides e três cumarinas (Figura 1). A estrutura das substâncias obtidas foi determinada através da interpretação de seus dados espectrais de RMN de ¹H e de ¹³C, incluindo experimentos bidimensionais como COSY, HSQC e HMBC, além de EM. A confirmação final de suas estruturas foi realizada por comparação com dados de RMN e dados físicos disponíveis na literatura.

 

 

O composto 1, p.f. 160-162 ºC, obtido como um sólido amarelo, teve sua fórmula molecular C₂₀H₂₄O₃ determinada por espectrometria de massa de alta resolução através do pico m/z 335,1626 [M+Na]⁺ (massa calculada 335,1623). No espectro de RMN de ¹³C do composto 1 verificou-se a presença de vinte sinais de carbono, dentre eles os sinais em δc 204,0 e 202,1, referentes a carbonilas conjugadas de cetonas, além de 8 sinais para átomos de carbono olefínico, compreendidos entre δc 112,5 e 183,4. No espectro de RMN de ¹H foram observados sinais de átomos de hidrogênio metílico em δ_H 1,83 (d, J = 1,5 Hz), 1,70 (d, J = 0,5 Hz), 1,31 (s), 1,19 (s) e 1,05 (d, J = 7,1 Hz), além de sinais para átomos de hidrogênio olefínico em δ_H 6,40 (d, J = 16,2 Hz), 5,95 (d, J = 16,2 Hz), 5,76 (dd, J = 8,2 e 1,6 Hz) e 5,74 (d, J = 1,6 Hz). A análise dos dados espectroscópicos (Tabelas 1 e 2), em adição à comparação com a literatura, permitiu constatar que o composto 1 tratava-se do diterpeno macrocíclico conhecido como jatrofona, isolado anteriormente de J. ribifolia,⁹ J. gossypiifolia,¹⁰ J. curcas¹¹ e J. elliptica.¹² A literatura relata para jatrofona diversas atividades biológicas tais como antitumoral, moluscicida, leishmanicida e gastroprotetora.¹³

 

 

 

 

O composto 2 foi isolado como uma resina branca. Seu espectro de massas, obtido por ionização por electrospray, mostra o íon quasi molecular em m/z 219,1759 [M-H]^- (massa calculada 219,1749), correspondendo com a fórmula molecular C₁₅H₂₄O. O espectro de RMN de ¹H de 2 exibe um sinal em δ_H 4,67 (d, J = 4,7 Hz), compatível com um hidrogênio oximetínico. Os sinais em δ_H 1,79 (s), 0,96 (s), 0,83 (d, J = 6,5 Hz) e 0,77 (s) correspondem a quatro grupos metilas, sendo o sinal em δ_H 1,79 compatível com um grupo metila ligado a um carbono olefínico, além de uma série de multipletos compreendidos entre δ_H 2,67-1,15, referentes a átomos de hidrogênio metínico e metilênico. O espectro de RMN de ¹³C apresenta sinais correspondentes a quinze átomos de carbono, incluindo dois átomos de carbono olefínico em δc 143,7 (C-5) e 136,0 (C-4), um carbono oxigenado em δc 68,9 (C-6) e quatro átomos de carbono metílico em δc 26,3 (C-12), 20,6 (C-13), 18,3 (C-15) e 14,4 (C-14) (Tabelas 1 e 2). No experimento HMBC, a correlação do sinal em δ_H 1,79 (3H-14) com os sinais de carbono em δc 143,7 (C-5) e 42,5 (C-3) foi determinante para a localização da dupla ligação entre os átomos de carbono C-4 e C-5. A correlação do sinal em δ_H 4,67 (H-6) com os átomos de carbono em δc 22,0 (C-8) e 65,2 (C-1) comprova a localização do grupo hidroxila em C-6. A estereoquímica relativa de 2 foi determinada com base em compostos semelhantes descritos na literatura, como a do ácido ciperanóico, previamente isolado de J. ribifolia,⁹ 6α-metoxi-cipereno, isolado de Croton muscicarpa¹⁴ (Euphorbiaceae), sugebiol e seu derivado peracetilado (triacetato de sugetriol), ambos isolados de Cyperus rotundos¹⁵ (Cyperaceae). Todos esses compostos mostram uma orientação α tanto para a hidroxila ligada a C-6 quanto para a metila em C-10, bem como orientação β para o biciclo entre C-1 e C-7. Estas análises permitiram identificar o composto 2 como sendo um sesquiterpeno de esqueleto patchoulano, nomeado como (6S)-patchoulan-4-en-6-ol, previamente isolado de Cyperus rotundus.¹⁶

O composto 3 foi isolado como um sólido amarelo com ponto de fusão entre 200-203 ºC. Seus espectros de RMN de ¹H e de ¹³C apresentam sinais compatíveis com a estrutura do cabraleadiol (Tabelas 1 e 2). Este composto está sendo relatado pela primeira vez na família Euphorbiaceae e, de acordo com a literatura, ele apresenta atividades antiinflamatória e anticâncer.¹⁷

O composto 4, resina amarela, teve sua fórmula molecular C₂₀H₂₄O₄ determinada por espectrometria de massa de alta resolução através do pico m/z 351,1591 [M+Na]⁺ (massa calculada 351,1572). O seu espectro de RMN de ¹³C apresenta-se bastante semelhante ao do composto 1. A principal diferença é a presença de um sinal para carbono oxigenado em δc 80,8, ausente no espectro de RMN de ¹³C de 1, condizente com a presença de uma hidroxila. O composto 4, após análise de seus dados espectrais (Tabelas 1 e 2), foi identificado como sendo 2β-hidroxijatrofona, isolado anteriormente de J. gossypiifolia.⁸ Este composto exibe atividade citotóxica anticâncer.¹³

O composto 5 foi obtido como sólido branco com ponto de fusão entre 100-103 ºC. Seus espectros de RMN de ¹H e de ¹³C mostraram-se semelhantes aos do cabraleadiol, sendo a principal diferença um sinal adicional em δ_H 2,05 (s) no espectro de RMN de ¹H e de dois sinais em δc 170,4 e 15,5 no espectro de RMN de ¹³C (Tabelas 1 e 2). A comparação com a literatura permitiu identificá-lo como sendo o derivado monoacetilado do triterpeno cabraleadiol,¹⁸ isolado pela primeira vez no gênero Jatropha e previamente de Euphorbia neriifolia.¹⁹ Para este composto foi descrito atividade larvicida.²⁰

O composto 6, isolado como uma resina, apresenta em seu espectro de massa um pico referente ao aduto de sódio em m/z 245,0417 [M+Na]⁺ (massa calculada 245,0426), indicando a fórmula molecular C₁₁H₁₀O_5. Os espectros de RMN de ¹H e de ¹³C exibiram sinais típicos de cumarinas (Tabela 3). A interpretação dos dados espectrais de 6 conduziu a estrutura da isofraxidina.²¹ Este composto está sendo relatado pela primeira vez no gênero Jatropha, tendo sido isolado das espécies E. helioscopia,²² Phyllanthus sellowianus²³ e Micrandra elata,²⁴ todas pertencentes à família Euphorbiaceae. São relatadas, para o composto 6, atividades antifadiga, antibacteriana, antitumoral, antioxidante, analgésica e anti-inflamatória.²⁵

 

 

O composto 7, isolado como resina, mostra um pico referente à molécula sodiada em m/z 245,0417 [M+Na]⁺ (massa calculada 245,0426), correspondendo à fórmula molecular C₁₁H₁₀O_5. Seu espectro de RMN de ¹H mostrou-se semelhante ao de 6. A análise dos dados espectroscópicos de 7 (Tabela 3) e a comparação com a literatura permitiram identificá-la como sendo a cumarina fraxidina.²¹ Este composto foi isolado anteriormente de J. podagrica, sendo relatadas as atividades antimicrobiana e antileishimaniose.²⁶

O composto 8 foi obtido como uma resina amarela. Seu espectro de massa de alta resolução mostra o pico m/z 231,0263 [M+Na]⁺ (massa calculada 231,0269), indicando a fórmula molecular C₁₀H₈O₅Na_. A análise de seu espectro de RMN de ¹H permitiu inferir sua estrutura como sendo a fraxetina²¹ (Tabela 3), isolada previamente de J. podagrica,²⁷ J. elliptica,²⁸ J. unicostata,²⁹ J. gossypiifolia,³⁰ J. cilliata³¹ e J. glandulifera.³² Para o composto 8 são relatadas atividades antioxidante e anti-inflamatória, antibacteriana e hepatoprotetora.³³

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os pontos de fusão (não corrigidos) foram determinados em aparelho Marconi, modelo MA 381, utilizando capilar de vidro em placa aquecedora e uma central de processamento N4800. As medidas de rotação óptica foram determinadas em polarímetro JASCO modelo P-2000. Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em espectrômetro SHIMADZU, modelo LCMS-IT-TOF, equipado com uma fonte de ionização por electrospray (IES), sendo os scans adquiridos no modo positivo ou negativo. Condições gerais das análises: voltagens do capilar 3500 V; temperatura e fluxo do gás secante: 150 ºC e 150 µL/h. Nitrogênio foi utilizado como gás de nebulização e solução de NaTFA foi usada como padrão para calibração do IT-TOF. Os espectros de RMN de ¹H e de ¹³C, uni- e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro Bruker, modelo Avance DRX-500 (500 MHz para ¹H e 125 MHz para ¹³C) ou Avance DRX-300 (300 MHz para ¹H e 75 MHz para ¹³C). Para a separação e purificação dos compostos foram empregadas cromatografias de adsorção em gel de sílica 60 da Vetec (Ø µm 70-230 mesh, cromatografias em coluna) ou Merck (Ø µm 230-400 mesh, cromatografias sob pressão, "flash") e cromatografia líquida de alta eficiência utilizando cromatógrafo com detector UV-Vis com arranjo de diodos modelo FTD-M20A (Shimadzu-UFLC) empregando coluna semi-preparativa Phenomenex (250 × 10 mm), com partículas de 5 µm. As cromatografias em camada delgada analítica foram realizadas com gel de sílica 60, (Ø µm 5-40, Merck) com indicador de fluorescência na faixa de 254 ηm (F₂₅₄), sobre cromatofolha de alumínio. As substâncias foram reveladas pela aspersão de uma solução de vanilina/ácido perclórico/EtOH, seguida por aquecimento em estufa (≈ 100 ºC).

Material vegetal

Jatropha ribifolia foi coletada em dezembro de 2009, no município de Salgueiro - Pernambuco. A identificação da planta foi realizada pela Profª. Dra. Maria Iracema Bezerra Loiola (UFC) e está representada pela exsicata Nº 46398, a qual se encontra depositada no Herbário Prisco Bezerra, do Departamento de Biologia- UFC.

Extração e isolamento

As raízes de J. ribifolia (1,6 kg) foram trituradas e secas a temperatura ambiente e, em seguida, extraídas através de maceração contínua com etanol a temperatura ambiente. A solução resultante foi filtrada e destilada sob pressão reduzida em evaporador rotatório, resultando em 66,0 g de extrato, o qual foi solubilizado em uma mistura de MeOH/H₂O 6:4 e extraído com hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt. A fração hexânica (17,9 g) foi fracionada sobre gel de sílica empregando os eluentes Hex/AcOEt 9:1, 8,5:1,5, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, AcOEt, AcOEt/MeOH 1:1 e MeOH, resultando em 94 frações de cerca de 8,0 mL cada, as quais após monitoramento por CCDA, foram reunidas em seis frações (F1A - F6A). Durante a evaporação do solvente da fração codificada como F4A, obtida por eluição com Hex/AcOEt 8,5:1,5 e Hex/AcOEt 8:2, houve a formação de um precipitado (753,8 mg), que foi purificado por recristalização em metanol (1, 508,5 mg).

A fração diclorometano (27,7 g) foi submetida a cromatografia em gel de sílica utilizando como eluentes Hex/AcOEt 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, AcOEt e MeOH, resultando em 90 frações de cerca de 8,0 mL cada, as quais após monitoramento por CCDA, foram reunidas em oito frações (FB1-FB8). A fração FB1, obtida por eluição com Hex/AcOEt 8:2, após cromatografia flash usando como eluente Hex/AcOEt 9,5:0,5, culminou no isolamento de uma resina branca (2, 15,5 mg).

O lenho do caule (2,0 kg), após triturado e seco, foi extraído através de maceração contínua com hexano e, posteriormente, com etanol a temperatura ambiente, e após concentração sob pressão reduzida, resultou na obtenção dos extratos hexânico (14,9 g) e etanólico (37,0 g). O extrato hexânico foi submetido a fracionamento em gel de sílica e eluido com Hexano; Hex/AcOEt 9:1, 7:3, 1:1, 3:7, AcOEt e AcOEt/MeOH 1:1, resultando em sete frações (FC1-FC7). A fração FC3, obtida por eluição com Hex/AcOEt 7:3, foi submetida à cromatografia sobre gel de sílica, utilizando CH₂Cl₂/AcOEt em gradiente crescente de polaridade (9,5:0,5, 9:1, 8,5:1,5, 8:2 e MeOH), resultando no isolamento do composto 3 (25,9 mg). As frações FC4 e FC5, obtidas por eluição com Hex/AcOEt 1:1 e 3:7, respectivamente, foram reunidas e cromatografadas em coluna de gel sílica utilizando os eluentes CH₂Cl₂, CH₂Cl₂/AcOEt 9,5:0,5, 9:1, 8,5:1,5, 8:2, 1:1, 3:7, AcOEt e, por fim, MeOH, fornecendo 52 frações. As frações F9-14, obtidas por eluição com CH₂Cl₂/AcOEt 9,5:0,5, foram reunidas e purificadas por CLAE utilizando o sistema de eluição isocrático consistido de Hex/isopropanol (88:12) por 12 min, fornecendo o composto 4(t_R 9,8 min; 5,0 mg). As frações F20-29, resultantes da eluição com CH₂Cl₂/AcOEt 8,5:1,5 e CH₂Cl₂ 8:2 foram reunidas e submetidas à cromatografia flash utilizando um sistema isocrático composto de CH₂Cl₂/AcOEt 8,5:1,5, resultando no isolamento do metabólito 5 (6,0 mg).

O extrato etanólico do lenho do caule (37, 0 g) foi solubilizado em MeOH/H₂O 7:3 e, posteriormente, particionado com CH₂Cl₂, AcOEt e n-BuOH. A fração CH₂Cl₂ (20,1 g) foi fracionada sobre gel de sílica utilizando como eluentes Hex/AcOEt 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, AcOEt e MeOH, resultando em seis frações (FD1-FD6). A fração FD4 (1,7 g), resultante da eluição com Hex/AcOEt 8:2, foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel utilizando misturas binárias de CH₂Cl₂ e AcOEt, e por fim MeOH, resultando em 77 frações de 8,0 mL cada. As frações F1-6 (329,7 mg) e CH₂Cl₂ 100% foram reunidas após análise por CCDA e submetidas a fracionamento cromatográfico por CLAE, usando um sistema gradiente ACN:H₂O 5-95%, em 30 min. Os picos com t_R 14,7 e 15,4 min resultaram no isolamento dos metabólitos 6 (6,9 mg) e 7 (3,7 mg), respectivamente. As frações F13-20 resultaram no isolamento de um sólido amarelo (8, 277,7 mg).

Jatrofona (1): Sólido amarelo, p.f. 160-162 ºC; [α]_D²⁵ = + 132,57 (c 0,001, CHCl₃); HRESIMS, m/z 335,1626 [M+Na]⁺, C₂₀H₂₄O₃Na (massa calc. 335,1623, erro = 0,89 ppm). Os dados de RMN de ¹H e RMN de ¹³C (500 e 125 MHz, CDCl₃) estão de acordo com os descritos na literatura.⁸

(6S)-Patchoulan-4-en-6-ol (2): Resina branca, [α]_D²⁵ = - 10,07 (c 0,020, CHCl₃); HRESIMS, m/z 219,1759 [M-H]^-, C₁₅H₂₃O (massa calc. 219,1749; erro = 4,56 ppm). Os dados de RMN de ¹H e de ¹³C (500 e 125 MHz, CDCl₃) concordam com os descritos na literatura.¹⁵

Cabraleadiol (3): Sólido amarelo, P.f 200-203 ºC; [α]_D²⁵ = + 101,20 (c 0,033, CHCl₃); HRESIMS, m/z 483.3814 [M+Na]⁺, C₃₀H₅₂O₃Na (massa calc. 483.3814; erro = 0,00 ppm). Os dados de RMN de ¹H e de ¹³C (500 e 125 MHz, CDCl₃) concordam com os descritos na literatura.¹⁶

2β-Hidroxijatrofona (4): Resina amarela, [α]_D²⁵ = + 30,23 (c 0,001 CHCl₃); HRESIMS, m/z 351,1591, [M+Na]⁺, C₂₀H₂₄O₄Na (massa calc. 351,1572; erro = 5,41 ppm). Os dados de RMN de ¹H e RMN de ¹³C (500 e 125 MHz, CDCl₃) estão em acordo com a literatura.⁹

Cabraleadiol monoacetilado (5): Sólido branco, pf 100-103ºC; [α]_D²⁵ = + 22,40 (c 0.066, CHCl₃); HRESIMS, m/z 541,3654, [M+K]⁺, C₃₂H₅₄O₄K (massa calc. 541,3659; erro = - 0,92 ppm). Os dados de RMN de ¹H e de ¹³C (500 e 125 MHz, CDCl₃) concordam com os descritos na literatura.¹⁷

Isofraxidina (6): resina verde, HRESIMS, m/z 245,0417 [M+Na]⁺, C₁₁H₁₀O₅Na (massa calc. 245,0426; erro = -3,67 ppm). Os dados de RMN de ¹H e de ¹³C (300 e 75 MHz, CD₃OD) concordam com os descritos na literatura.^18,20

Fraxidina (7): resina amarela, HRESIMS, m/z 245,0421 [M+Na]⁺, C₁₁H₁₀O₅Na (massa calc. 245,0426; erro = - 2,04 ppm). RMN de ¹H (300 MHz, CD₃OD) concorda com descrito na literatura.²⁰

Fraxetina (8): resina amarela, HRESIMS, m/z 231,0263 [M+Na]⁺, C₁₀H₈O₅Na (massa calc. 231,0269; erro = -2,60 ppm). Os dados de RMN de ¹H e de ¹³C (300 e 75 MHz, CD₃OD) concordam com os descritos na literatura.²⁰

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros de RMN e EM, bem como os dados de RMN das substâncias isoladas encontram-se disponíveis na forma de arquivo pdf, com acesso livre, no link http://quimicanova.sbq.org.br.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem aos órgãos de fomento à pesquisa CNPq/CAPES/PRONEX e INCT-BioSis pelo aporte financeiro dispensado para o desenvolvimento do projeto, e em especial ao CNPq pelas bolsas de iniciação científica sem as quais não teria sido possível a realização deste trabalho.

 

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