JBCS

INTRODUÇAO

Tradicionalmente os processos enzimáticos têm sido empregados em meio aquoso, principalmente devido à ideia preconcebida de que este é um bom ambiente para manutençao da conformaçao estrutural da enzima cataliticamente ativa. Esse conceito nao é, entretanto, completamente verdadeiro, dado que muitas enzimas (ou complexos enzimáticos) sao cataliticamente ativas em ambientes hidrofóbicos naturais com eficiência similar àquela em soluçoes aquosas, ou em certos casos, até superior.^1,2 Acredita-se que as enzimas sejam cataliticamente ativas em meio orgânico porque elas permanecem na sua conformaçao original. A incapacidade da proteína de se desdobrar em meio nao aquoso deve-se em parte ao fato das interaçoes eletrostáticas entre os grupos integrantes da enzima serem aumentadas em solventes orgânicos, devido à baixa constante dielétrica da maioria dos solventes e também ao aumento do número de ligaçoes de hidrogênio intramoleculares.

Em sentido estrito, podem ser considerados como ambientes nao aquosos os solventes orgânicos, os fluidos supercríticos, os gases, os substratos líquidos ou misturas eutéticas de substratos livres de solventes.^1-4

Um grande número de trabalhos na área de biocatálise em meios nao convencionais pode ser encontrado na literatura especializada, tendo em vista o interesse científico demonstrado por diversos grupos de pesquisa, no sentido de elucidar as propriedades e o comportamento de enzimas em meios nao aquosos.^2,4-6 Consequentemente, o número de rotas de síntese que incorporam um passo enzimático torna-se cada vez mais crescente. Bem ilustrativos sao os trabalhos de revisao de literatura publicados,^1,2,7-12 que reúnem exemplos importantes, sob o ponto de vista de síntese orgânica, de reaçoes catalisadas por diferentes classes de enzimas.

Igualmente, avanços têm sido registrados na catálise enzimática heterogênea, especificamente em sistemas sólido-gás, nos quais substratos gasosos sao transformados por açao de um biocatalisador em fase sólida em produtos também em fase gasosa.^6,13,14 O tipo de biocatalisador pode ser uma célula microbiana íntegra (whole cells) ou uma enzima purificada, ambas na forma livre ou imobilizada. Segundo Bárzana,¹⁵ o estudo pioneiro neste campo foi realizado por Yagi et al.¹⁶ em 1969 o qual mostrou que enzimas secas possuíam atividade catalítica para substratos em fase gasosa. No entanto, apenas a partir da década de 90 este tema foi revisitado vislumbrando-se uma gama de aplicaçoes baseadas nas seguintes vantagens do ponto de vista comparativo, principalmente, com os sistemas biocatalíticos em fase aquosa e em solventes orgânicos:^17,18

a) a imobilizaçao covalente da enzima nao é necessária, uma vez que esta nao tem condiçoes de desprender do suporte dissolvendo-se na fase que a envolve;

b) a presença do biocatalisador em fase sólida favorece sua recuperaçao, permitindo a conduçao de reaçoes em regime descontínuo com reutilizaçao do biocatalisador ou em fluxo contínuo;

c) como os substratos sao voláteis, a presença de solventes também é desnecessária, evitando geraçao de subprodutos por eventuais reaçoes envolvendo solventes;

d) substratos e produtos sendo gasosos apresentam viscosidades baixas e altos valores de coeficientes de difusao, tornando estas reaçoes menos susceptíveis a limitaçoes por transferência de massa;

e) a volatilidade dos substratos e produtos simplifica a etapa de purificaçao, tendo em vista que os produtos podem ser separados por simples condensaçao fracionada por meio de ajuste das temperaturas de condensaçao;

f) enzimas secas (com atividade de água controlada) têm maior estabilidade térmica.

Em contrapartida, a maior desvantagem da biocatálise em fase gasosa pode ser relacionada ao fato de que muitos dos substratos requeridos para este tipo de sistema reacional apresentam pontos de ebuliçao muito elevados à pressao normal,¹⁹ dificultando, portanto, a seleçao de substratos adequados para diversificar as aplicaçoes desta tecnologia.

Neste contexto, a proposta desta revisao é descrever os principais aspectos tecnológicos envolvidos na biocatálise em fase sólido/gás, abordando de forma geral as questoes referentes aos efeitos dos diferentes parâmetros e variáveis do processo que caracterizam este sistema.

CATALISE ENZIMATICA EM FASE GASOSA

Dentre as enzimas usadas nestes sistemas encontram-se as hidrolases, entre as quais podem ser destacadas lipases de diversas fontes, cutinases e esterases; as oxidorredutases como álcool desidrogenase e álcool oxidase; e as liases como benzaldeido liase e benzoilformato descarboxilase. As principais reaçoes estudadas sao basicamente: esterificaçoes, transesterificaçoes e oxidaçao de álcoois a aldeídos conduzidas em regime descontínuo e contínuo em faixas de temperatura variando desde 300 até 345 K, havendo inclusive relatos de estudos efetuados a 370 K.

A maioria dos trabalhos publicados tem centrado o enfoque no mecanismo de interaçao água-enzima, bem como na influencia da atividade de água (aw) exercida na atividade e estabilidade da enzima. Estudos visando determinar como as interaçoes entre o suporte e o substrato afetam o grau de hidrataçao das enzimas e influenciam a atividade catalítica sao também descritos na literatura.^6,20-24

A Tabela 1 apresenta de forma resumida alguns destes sistemas enzimáticos abordando tipos de enzimas e características principais do sistema reacional. As enzimas e reaçoes utilizadas nestes estudos foram na maioria selecionadas como modelos, havendo pouca preocupaçao de se realizar trabalhos de modelagem matemática e simulaçao destes sistemas, bem como de desenvolvimento de processos industriais específicos.

Hidaka e Matsumoto³⁵ efetuaram um estudo cinético usando modelos fenomenológicos a partir dos balanços de massa na reaçao de oxidaçao de etanol a acetaldeído em fase gasosa conduzida em reator de leito fixo. De acordo com o modelo proposto, a formaçao de acetaldeído aumentou com o incremento da temperatura de reaçao e reduçao do teor de água no suporte, porem, diminuiu com o incremento da vazao do substrato, sendo constatada uma aproximaçao satisfatória entre os resultados experimentais e aqueles obtidos pela simulaçao.

Anteriormente, HWANG e colaboradores³⁸ propuseram um modelo matemático da reaçao de oxidaçao do etanol a acetaldeído em fase gasosa, a partir da derivaçao da equaçao de fluxo em pistao. O modelo da taxa de reaçao foi representado por uma equaçao derivada de um mecanismo Bi-Bi sequencial ordenado.

Destaque pode ser também dado às reaçoes em fase gasosa que utilizam enzimas combinadas, tal como no caso da oxidaçao do etanol a acetaldeído catalisada por álcool oxidase de Pichia pastoris.^35,39 Ao reagir etanol com O₂ sao formados acetaldeído e peróxido de hidrogênio (Figura 1), mas sendo este último um inibidor da enzima álcool oxidase a utilizaçao de uma segunda enzima como peroxidase (catalase) é uma estratégia adequada para promover a decomposiçao irreversível do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.

Figura 1. Esquema reacional da oxidaçao em fase gasosa de etanol a acetaldeído usando uma enzima álcool oxidase

Nas reaçoes em fase gasosa contínua que utilizam enzimas dependentes de cofatores, recomenda-se a alimentaçao contínua de um co-substrato no sistema, possibilitando a regeneraçao do cofator pela açao da mesma enzima da reaçao principal, como ilustrado na Figura 2. Na reduçao enantiosseletiva de 4-metil-2-pentanona em fase gasosa utilizando 2-propanol como co-substrato ocorre a formaçao do quiral (R)-4-metil-2-pentanol com concomitante regeneraçao do cofator NADH usando a mesma enzima álcool desidrogenase imobilizada.²⁶

Figura 2. Esquema reacional da reduçao enantiosseletiva em fase gasosa de 4-metil-2-pentanona para o quiral (R)-4-metil-2-pentanol usando a enzima álcool desidrogenase (ADH). Nomenclatura: ADH - enzima álcool desidrogenase; NAD⁺ - nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada); NADH - nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)

Alternativamente ao uso de enzimas purificadas, a regeneraçao de cofatores⁴² pode ser alcançada explorando a capacidade de células microbianas integras (sistemas multi-enzimáticos) tipo whole cells de catalisar reaçoes em fase gasosa. Desta forma, na Tabela 2 sao apresentados alguns exemplos de biocatálise em fase gás que utilizam whole cells como biocatalizadores. Particularmente, este tipo de processo pode ser atrativo economicamente em virtude do seu menor custo comparativamente com aqueles observados para enzimas purificadas, além de prover às enzimas um ambiente natural que favorece sua conformaçao estrutural de modo a evitar mudanças que resultem em perdas de atividades em meios nao convencionais.

A Figura 3 apresenta um esquema genérico³¹ de um sistema experimental para o desenvolvimento das reaçoes enzimáticas em fase sólido/gás em escala de laboratório. De uma forma geral, este sistema experimental é constituído por um reator volumétrico de vidro cuja operaçao se baseia basicamente em princípios da termodinâmica uma vez que a preparaçao dos substratos ocorre pela saturaçao da corrente gasosa com seus respectivos vapores quando o gás de arraste, depois de sair do borbulhador e passar pelo saturador, entra em equilíbrio com a fase líquida. Neste caso, a pressao parcial dos reagentes é igual à pressao de vapor correspondente à pressao acima do ponto de orvalho dos compostos puros, na temperatura do saturador (temperatura de saturaçao). A pressao de vapor em cada caso é medida pela variaçao da vazao volumétrica e a temperatura de saturaçao correspondente, determinando-se desta forma a concentraçao (pressao parcial) dos substratos/produtos. Pode-se entao obter diferentes pressoes de vapor para cada substância. Neste contexto, para o estudo e operaçao destes sistemas em fase gasosa a razao de pressoes de vapor P/P₁ pode ser calculada a partir da equaçao de Clausius-Clapeyron⁵² como ilustrada na Equaçao 1:

Figura 3. Sistema experimental para reaçoes em fase gasosa o qual opera à pressao atmosférica e se baseia na saturaçao do gás de arraste pelos substratos em linhas separadas antes de se juntarem na câmara de mistura para seguir até a etapa de reaçao²¹: (1) sistema de suprimento de gás de arraste e de referência; (2) válvula de ajuste fino; sistemas para a preparaçao dos substratos: (3) borbulhador e (4) saturador operando na temperatura de saturaçao (Tsaturaçao); (5) banho termostático; (6) câmara de mistura dos gases; (7) biorreator de leito fixo operando na temperatura de reaçao (Treaçao); (8) cromatógrafo a gás para monitoramento on-line das reaçoes; (9) computador para aquisiçao de dados

em que: T é a temperatura do saturador, T_e é a temperatura de ebuliçao, ΔH_V é a entalpia de vaporizaçao e R é a constante dos gases ideais.

Até o momento, nao foram encontrados relatos na literatura sobre a implantaçao desta tecnologia em escala industrial. Entretanto, dados de produçao de ésteres aromáticos de interesse da indústria de alimentos em sistema de biocatálise sólido/gás foi validado em escala piloto.⁵³ Trata-se de um sistema fechado no qual o N₂ usado como gás de arraste é reciclado reduzindo seu consumo. Este sistema opera basicamente com três diferentes blocos de pressurizaçao, isto é, um bloco de pressao reduzida incluindo essencialmente uma unidade flash, trocador de calor e o biorreator; um segundo bloco que opera com pressoes moderadas incluindo essencialmente a unidade de separaçao líquido/gás e finalmente um bloco de alta pressao que corresponde à etapa de condensaçao final.

CALCULO DA VELOCIDADE DE REAÇAO

A taxa (r_A) de reaçao (Equaçao 2) para estes sistemas pode ser expressa em moles do substrato limitante consumido por hora e por massa de biocatalisador empregado (mol h^-1 mg^-1), cujo procedimento de cálculo para reatores sólido/gás tem sido descrito de forma simples na literatura.⁵⁴

em que: P_Ao é a pressao parcial do substrato A na entrada do reator, atm; Q é a vazao volumétrica, L/h; R é a constante dos gases, 0,082 atm L /mol K; T é a temperatura, K; W é a massa de biocatalisador, mg; e x é a conversao da reaçao, %.

Entretanto, alguns autores^6,17,55 sugerem trabalhar com atividade termodinâmica (a_i), a despeito de pressoes parciais para expressar as concentraçoes de substratos e produtos, ou seja, com a razao entre a pressao parcial (P_i) de cada substrato no sistema e a correspondente pressao de saturaçao da substância pura (P_sat) numa dada temperatura (Equaçao 3).

Desta forma, é possível corrigir e quantificar melhor a disponibilidade dos substratos para a enzima, principalmente quando ocorrem fenômenos de solvataçao e dessolvataçao que modificam a disponibilidade de substratos e produtos para a enzima.⁵⁶

EFEITO DA ATIVIDADE DA AGUA SOBRE A ESTABILIDADE E ATIVIDADE ENZIMATICA

A água tem um efeito duplo nas reaçoes catalisadas por enzimas: se por um lado ajuda a preservar a conformaçao catalítica da enzima, por outro lado participa do seu processo de inativaçao, especificamente na termoinativaçao.⁴⁰ Geralmente, tem sido considerado que a atividade das enzimas é dependente do nível de hidrataçao e que uma enzima requer um nível mínimo de hidrataçao ao redor de 0,2 g H₂O/g para exibir atividade. Entretanto, algumas enzimas podem apresentar atividade em fase gasosa em níveis mais baixos de hidrataçao.^57,58

Halling²¹ descreveu os aspectos necessários para estudar a influência da água em meios nao convencionais, enfatizando a necessidade de se caracterizar a disponibilidade da água nestes sistemas através do parâmetro termodinâmico atividade da água (a_w), como a seguir definido:

em que: UR é a umidade relativa do ar, em % e P_v; P_{v ref} sao as pressoes de vapor da água em equilíbrio com o sistema usado (na temperatura de saturaçao) e a pressao de vapor da água à temperatura de referência (temperatura de reaçao), respectivamente.

Este critério foi também adotado por Lamare e Legoy,¹⁷ que demonstraram que a atividade de água é o parâmetro mais relevante em tais sistemas a despeito do teor de água livre na fase gasosa, uma vez que a ligaçao das moléculas de água com sítios específicos na proteína depende deste parâmetro termodinâmico.

A síntese de acetato de etila em fase gasosa usando lipase foi estudada por Hwang e Park,^37,59 sendo observada reduçao da taxa de formaçao do éster com o incremento do teor de água na enzima. Resultados similares foram descritos na reaçao de transesterificaçao⁴⁰ catalisada por lipase pancreática para atividades de água superiores a 0,29, bem como na oxidaçao de etanol a acetaldeído, sendo verificado aumento da concentraçao de acetaldeído em funçao do aumento da temperatura de reaçao e reduçao do teor de água no biocatalisador.³⁵ Contudo, estes resultados sao discordantes daqueles obtidos por Barzana et al.,⁶⁰ que sugerem um efeito contrário da água durante a reaçao de oxidaçao de etanol a acetaldeído. No mesmo sistema, usando álcool desidrogenase, a atividade da água afetou favoravelmente a taxa de reaçao uma vez que a energia de ativaçao diminuiu com o incremento de a_w, efeito esse justificado em funçao da rigidez da enzima para baixos níveis de hidrataçao. Entretanto, a atividade da água também afetou fortemente a estabilidade da enzima em fase gasosa,⁴¹ isto é, um incremento na a_w resultou no aumento da atividade catalítica da enzima, enquanto a estabilidade diminuiu consideravelmente. Por outro lado, desde que a reaçao aconteça pela interaçao direta do etanol gasoso com a enzima, os autores concluíram que a formaçao de uma fase de etanol pré-adsorvida na superfície do suporte nao era um pré-requisito para o desenvolvimento da reaçao.

A adsorçao de água em álcool desidrogenase na presença de substratos em fase gasosa com hidrofobicidades diferentes foi estudada por Yang e Russell.^22,23 Segundo os autores, foi constatada a presença de histerese nas isotermas de adsorçao e os dados experimentais foram mais bem ajustados pelo modelo de multicamadas de Huttig, ao invés do modelo de Langmuir, tradicionalmente utilizado.

A conversao de etanol em acetaldeído em um biorreator gás-sólido contínuo foi estudada utilizando células íntegras de Hansenula polymorpha e comparou-se os resultados com a reaçao conduzida por álcool oxidase purificada e catalase como uma segunda enzima para degradar peroxido de hidrogênio formado.³⁹ Estes autores observaram que a estabilidade da enzima álcool oxidase no reator aumentava com a reduçao do teor de água. A estabilidade das células íntegras foi maior do que a das enzimas purificadas, sendo que o sistema se manteve estável por mais de um mês à temperatura de 308 K com conversao completa de etanol a acetaldeído, enquanto o teor de umidade da enzima era mantido aproximadamente em 8%.

Robert et al.²⁰ publicaram um trabalho sobre o papel da água na biocatálise em fase gasosa, estudando o desempenho da álcool desidrogenase e de enzimas lipolíticas em um reator gás-sólido contínuo. Em relaçao às enzimas lipolíticas concluíram que a água tinha um efeito positivo na atividade inicial da enzima, mas comprometia sua estabilidade, ou seja, tanto a atividade quanto a estabilidade da enzima eram altamente dependentes de seu nível de hidrataçao inicial. Determinaram a isoterma de adsorçao de água para uma enzima cutinase termoestável de Fusarium solani clonada em E. coli e consideraram que valores de atividade de água menores que 0,2 correspondem à água ligada à estrutura da enzima, entre 0,2 e 0,7 correspondem à água na primeira camada de hidrataçao e acima de 0,7 correspondem à água livre que se envolve no processo de desnaturaçao da enzima.

Por outro lado, Condor et al.⁶¹ reportaram uma isoterma de atividade de água para a Lipozyme IM, uma lipase de Mucor miehie imobilizada em resina de troca aniônica, à temperatura de 303 e 313 K e ajustaram uma equaçao polinomial de quarta ordem para o teor de água no sólido em funçao da atividade de água (a_W) a qual é válida para a_W < 0,88.

Graber et al.²⁴ compararam o papel da água nos parâmetros de ativaçao termodinâmica na reaçao de alcoólise de metil propionato e n-propanol catalisada pela lipase B de Candida antarctica (CALB) em um biorreator sólido-gás continuo e em um sistema em meio orgânico. Os autores concluíram que as variaçoes de entalpia e entropia foram diferentes e opostas nestes sistemas. Em fase gasosa, com o aumento da a_w foi observado um decréscimo na barreira energética da reaçao e predominaram modificaçoes na flexibilidade da enzima. No sistema em meio orgânico o fenômeno predominante que afetou os parâmetros termodinâmicos foi o aumento da polaridade do solvente para altos níveis de a_w, resultando em incrementos da energia de ativaçao da reaçao e um decréscimo da entropia do sistema. Em ambos os casos a energia livre de Gibbs foi negativa.

EFEITO DO SUPORTE SOBRE A ATIVIDADE ENZIMATICA

As enzimas podem ser usadas tanto em soluçao (sistemas homogêneos) como em forma sólida. As enzimas na forma sólida podem ser usadas como precipitados (sólidos liofilizados), ligadas quimicamente a matrizes ou imobilizadas.⁶² Nos sistemas que contém enzimas imobilizadas em suportes sólidos, o suporte tem uma influência significativa na atividade enzimática, podendo deslocar o equilíbrio da reaçao devido a sua interaçao com as moléculas de água.

A imobilizaçao de enzimas minimiza sua desnaturaçao durante os processos de preparaçao e aplicaçao subsequente,⁶³ e ainda minimiza a agregaçao de enzimas, que pode levar a uma perda de atividade e estabilidade reduzida.¹⁸ Em contrapartida, sabe-se que enzima adsorvida nos poros de um suporte pode apresentar menor atividade catalítica comparada à enzima livre, devido a uma ruptura da conformaçao da proteína.¹⁸

Nos estudos de biocatálise, em geral se tem observado certa preferência pelo uso de matrizes orgânicas como suporte de enzimas. Porém alguns tipos de suportes inorgânicos têm sido utilizados tanto em pesquisa básica como industrialmente. Esta preferência deve-se fundamentalmente ao fato que suportes orgânicos apresentam alta reatividade, facilitando a ligaçao com as enzimas e permitindo a sua modificaçao estrutural e química. Contudo, suportes inorgânicos, devido às suas propriedades físicas, sao preferidos para aplicaçoes industriais.⁶⁴ Alta resistência mecânica, estabilidade térmica, resistência a solventes orgânicos e ao ataque microbiano sao algumas das vantagens que apresentam os suportes inorgânicos quando comparados aos orgânicos. Além disso, os materiais inorgânicos nao apresentam mudanças na sua estrutura pela influência de amplas faixas de pH, temperatura e pressao e podem ser facilmente regenerados por pirólise.

Nas pesquisas de biocatálise em fase gasosa matrizes orgânicas e inorgânicas têm sido utilizadas (Tabela 3), mas geralmente o efeito do suporte e algumas de suas propriedades (caráter acido/básico, estrutura, etc.) sobre o comportamento deste sistema nao têm sido exaustivamente discutido. Contudo, desde que a imobilizaçao covalente possa ser evitada nestes sistemas em fase gasosa, há uma clara preferência pela adoçao da adsorçao física como método de imobilizaçao, como pode ser verificado na Tabela 3.

Muito embora a atividade de água venha a ser a melhor maneira de se definir a disponibilidade de moléculas de água para interaçao com a proteína, deve-se levar também em consideraçao a influência do suporte na distribuiçao destas moléculas.¹⁷ Lamare e Leogy¹⁷ observaram um aumento da atividade enzimática em funçao do aumento da atividade de água (de 0,1 a 0,8%) no sistema para cutinase imobilizada em uma resina trocadora de íons tipo IV, enquanto observaram um máximo para a atividade enzimática da mesma enzima suportada por adsorçao em matriz apolar (Chromosorp P) para uma atividade de água de 0,6%. A retençao de água pelo primeiro suporte, por ser este hidrofílico, seria bem superior à retençao pelo segundo que, sendo hidrofóbico, nao competiria pela água, permitindo que para menores atividades de água a enzima tivesse hidrataçao suficiente para, com alta mobilidade, alcançar desnaturaçao.

Debeche et al.¹⁸ reportaram que suportes hidrofóbicos sao os preferidos em bioprocessos sólido/gás, pois sua interaçao com a água é muito baixa mesmo em atividades de água elevadas. Contudo, tratando-se de imobilizaçao de lipases, os suportes hidrofóbicos têm sido utilizados com frequência, pois a bolsa hidrofóbica em torno do sítio catalítico de lipases facilmente interage com o suporte, sendo ele também hidrofóbico.¹⁸ Estes mesmos autores compararam duas diferentes estruturas de suporte, hidrofílica (suporte de tecido de fibra de vidro) e hidrofóbica (suporte de fibra de carbono) e concluíram que a lipase imobilizada no suporte hidrofóbico exibiu maior atividade provavelmente devido à hiperativaçao, ou seja, uma ativaçao interfacial promovida pela superfície hidrofóbica do suporte.

EFEITO DO SUBSTRATO SOBRE A ATIVIDADE CATALITICA

A polaridade do substrato pode afetar a adsorçao de água pela enzima e assim modificar as propriedades catalíticas desta. Por exemplo, a adsorçao de água pela enzima álcool desidrogenasse foi estudada em presença de substratos orgânicos gasosos com reciclo do cofator NAD⁺, avaliando a interaçao da água com a enzima. Estes resultados foram comparados com a adsorçao de água pela enzima na presença de uma mistura de gases livres de substratos orgânicos (vapor de água e hélio). Os resultados mostraram que a presença do composto hidrofóbico 3-metil-2-buten-1-ol nao afetou a adsorçao de água pela enzima, enquanto que a maior hidrofilicidade da acetona propiciou menor adsorçao de água, indicando que moléculas orgânicas podem competir com a água durante o processo de hidrataçao da enzima em sistema gasoso.²²

Resultados similares foram obtidos por Carvalho et al.⁶⁶ no estudo sobre a influência da presença de gases (dióxido de carbono, propano e mistura destes) na reaçao de transesterificaçao por subtilisina Carlsberg. A composiçao da fase gasosa afetou a adsorçao de água pela enzima como reportado nos estudos de Yang e Russell.^22,23 Na presença do composto apolar, propano, a hidrataçao da enzima foi maior do que aquela encontrada na presença de fase gasosa polar, contendo dióxido de carbono, para a mesma concentraçao de água no sistema. Devido à baixa atividade da enzima na presença de dióxido de carbono, conclui-se que este gás, apesar de apresentar algumas conveniências, nao é um gás promissor para o arraste de substratos.

Durante as reaçoes de transesterificaçao em fase gasosa de metil e etil propionato com álcoois de cadeia lineares saturadas de tamanhos diferentes usando lipase pancreática e uma cutinase em reator de leito fixo contínuo observou-se que a atividade da enzima dependeu da natureza do éster e do comprimento da cadeia dos álcoois, isto é, um aumento do comprimento da cadeia e, consequentemente, da hidrofobicidade do álcool que resultou em taxas de reaçoes menores, mas conferiu à enzima uma maior estabilidade.^33,34

Lamare et al.⁶⁷ observaram que álcoois utilizados na reaçao de transesterificaçao com cutinase podem substituir as moléculas de água na solvataçao, com um efeito positivo sobre a taxa da reaçao, favorecendo a interaçao da enzima com os compostos nao polares, em baixos níveis de hidrataçao, ou seja, para baixos valores de atividade da água. Ao mesmo tempo esses autores observaram um incremento na afinidade da enzima pelo substrato à medida que aumentava a disponibilidade da água e a apolaridade do substrato. Assim, quando a disponibilidade da água no sítio ativo é limitada, a reatividade dos compostos nao polares diminui devido à ausência de moléculas polares necessárias para interagir com os resíduos polares, para que as interaçoes hidrofóbicas ocorram. Neste caso foi possível observar uma açao cooperativa, de um dos substratos com a enzima, em condiçoes tais que este tem um papel importante na solvataçao da proteína, interagindo com um grande número de resíduos e favorecendo a atividade catalítica.

EFEITO DA ADIÇAO DE SOLVENTES EM SISTEMAS SOLIDO/GAS

Como discutido até aqui, sabe-se que enzimas secas, ou quase secas, apresentam atividade catalítica para substratos gasosos e ainda possuem maior estabilidade.^18,33,68 Adicionando-se componentes orgânicos ao meio reacional, estes irao afetar o processo de interaçao entre o substrato e a enzima imobilizada.¹³ Sendo assim, Létisse et al., ¹³ investigando o efeito de componentes água, 2-metil-2-butanol e hexano na atividade da lipase B de Candida antarctica, para relacionar os efeitos desses componentes sobre os valores de Ki, constataram que o caráter inibitório do componente adicionado diminuiu conforme o composto era mais hidrofóbico, e ainda os valores de Ki para cada componente diminuíram com o aumento da hidrofobicidade do composto. Isto significa que componentes hidrofóbicos e apolares como o hexano aumentam a inibiçao por propanol. Entretanto, com a adiçao de componentes hidrofílicos e polares como a água, a inibiçao por propanol é menor, embora a inibiçao pelo próprio componente (água) seja maior. Estes efeitos têm de estar relacionados com o caráter inibitório dos compostos resultante de interaçoes com a regiao polar em torno do sítio ativo da enzima.

Graber et al.,³⁰ analisando o efeito inibitório de solventes para lipase CalB de Candida antarctica, concluíram que havia uma inibiçao competitiva do solvente com o substrato. Para explicar os efeitos observados, esses autores sugerem inibiçao por solvente ao invés de mudança conformacional da enzima, devido à preferencia dos solventes inibitórios (cetona e álcool terciário) de fixar no sítio ativo da enzima durante as simulaçoes, enquanto o solvente nao inibitório (hidrocarboneto) nao tem possibilidade de ficar ligado por ligaçoes de hidrogênio. Além disso, nenhuma alteraçao significativa na conformaçao da enzima foi observada durante as simulaçoes. Confirmando o estudo anterior, Graber et al.⁵⁶ observaram que ao adicionar 2-metil-2-butanol em reaçao sólido/gás houve aumento da inibiçao por propanol, explicando a menor atividade da lipase CalB na presença de cetonas e álcool terciário no meio de reaçao. Entretanto, Leonard et al.⁶⁹ nao reportaram qualquer efeito real sobre a enantiosseletividade da lipase B de Candida antarctica quando componentes orgânicos foram adicionados em sistema sólido/gás na reaçao de alcoólise estudada.

USO DE ADITIVOS PARA MELHORAR O DESEMPENHO ENZIMATICO EM SISTEMAS SOLIDO/GAS

Recentemente, melhoramentos no desempenho das enzimas têm sido descrito por meio da induçao da estabilizaçao pela adiçao de aditivos aos suportes de imobilizaçao. Neste contexto, apenas alguns trabalhos têm sido publicados, entre os quais se encontram estudos de adiçao de sacarose^32,35 e glicerol⁷⁰ sobre a atividade e estabilidade de álcool desidrogenase imobilizada,^32,35 respectivamente. Ferloni et al., ³⁵ visando prolongar a vida útil da enzima, otimizando sua estabilidade, observaram que ao adicionar sacarose na reaçao de reduçao catalisada por álcool desidrogenase em sistema gás/sólido, houve um aumento na estabilidade operacional do catalisador, a meia-vida da enzima aumentou quarenta vezes e a degradaçao enzimática foi irrelevante até temperaturas de 323 K. Isto foi devido, provavelmente, à formaçao de ligaçoes de hidrogênio com a superfície da proteína, tornando-as mais compactas e termodinamicamente estáveis, sendo protegidas contra desnaturaçao térmica e maior umidade relativa.³⁵ Da mesma forma, Trivedi et al.³² obtiveram resultados semelhantes ao estudar o efeito de aditivos (sacarose) na catálise em fase gasosa usando uma álcool desidrogenase de Thermoanaerobacter (ADH T). Os resultados demonstraram que com a adiçao da quantidade ótima de sacarose (cinco vezes a quantidade da proteína) havia menos perda da atividade enzimática durante a imobilizaçao e um aumento da estabilidade térmica da preparaçao imobilizada de ADH T.

Nos estudos de Nagayama et al.,⁷⁰ utilizando glicerol como aditivo, a proposta foi baseada no fato do conhecido efeito estabilizante do glicerol sobre enzimas e desta forma a adiçao deste composto na imobilizaçao da álcool desidrogenase de Parvibaculum lavamentivorans em esferas de vidro nao porosas mudou significativamente o desempenho da enzima, em termos de atividade catalítica, estabilidade, enantiosseletividade assim como na produtividade do sistema reacional sólido/gás.

CONSIDERAÇOES FINAIS

A biocatálise em fase sólido/gás é um tema emergente e suas aplicaçoes no campo da biotecnologia moderna como nas indústrias, química, farmacêutica e de alimentos sao promissoras. Além disso, suas aplicaçoes se estendem ao desenvolvimento de biossensores como métodos de detecçao para aplicaçoes analíticas^1,15,71 e à detoxificaçao de correntes gasosas.^43-46 Com base nos trabalhos revisados pode-se concluir que nestes sistemas a hidrataçao da enzima constitui um fator de extrema importância para garantir o equilíbrio entre a atividade enzimática e a estabilidade do biocatalisador em reaçoes em fase gasosa. A atividade de água (a_w) é o parâmetro mais indicado para caracterizar e controlar a disponibilidade da água nesses sistemas. A polaridade do substrato deve ser também considerada como um parâmetro relevante na determinaçao da cinética destes processos. Nos sistemas contendo enzimas imobilizadas em suportes sólidos, o suporte pode afetar a atividade enzimática devido à dependência das suas propriedades hidrofóbicas ou hidrofílicas, podendo competir pela água durante a reaçao e deslocando o equilíbrio. Estudos de mecanismos da interaçao entre enzima, substrato, água e suporte e suas implicaçoes na estabilidade, seletividade e atividade destes biocatalisadores, assim como a diversificaçao de aplicaçoes e estudos de ampliaçao de escala para a implantaçao tecnológica desta tecnologia, sao ainda aspectos que necessitam ser aprofundados.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradem o apoio financeiro das Fundaçao de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) e à Fundaçao Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

REFERENCIAS

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