JBCS

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, em função de alterações ambientais, como a depleção de ozônio,¹ a exposição solar, e por consequência, a incidência à radiação UV, têm aumentado na superfície terrestre. Em decorrência desse efeito, danos ao organismo,² à pele, envelhecimento precoce e fotoenvelhecimento têm sido relatados, sendo que, em alguns casos, sua relação com efeitos radicalares é comprovada.³

Com o intuito de inibir ou amenizar efeitos do fotoenvelhecimento, tratamentos^3,4 têm sido utilizados como prevenção ou atenuação dos efeitos da exposição à radiação UV/solar. Dentre estes tratamentos, podem ser citados o uso de fotoprotetores, de compostos reativos com o oxigênio, além de aplicações de laser, toxinas botulínicas, dentre outras.

Antioxidantes têm sido utilizados como tratamento do fotoenvelhecimento,⁴ sendo que as Vitaminas C e E merecem destaque em estudos e aplicações in vivo, em medicamentos e preparações cosméticas. Em relação à Vitamina E, esta pode atuar como antioxidante e pró-oxidante,⁵ sendo a ação pró-oxidante inibida pela ação da Vitamina C, atuando como co-antioxidantes.

Naturalmente, a Vitamina E compreende oito diferentes formas,⁶ dentre elas o α e o δ-tocoferol. Na Figura 1 tem-se a estrutura do α-tocoferol, um dos compostos da Vitamina E.⁷

Figura 1. Estrutura química do α-tocoferol

A ação do α-tocoferol, isoladamente ou associado a outros compostos,⁸ tem demonstrado efeitos positivos em relação à proteção à exposição solar e proteção de doenças, incluindo o câncer,⁸ sendo importante destacar o sinergismo existente entre os antioxidantes α-tocoferol e ácido ascórbico.⁹

Ainda, a busca por novos sistemas promotores de permeação permite otimizar a entrega dérmica de compostos que muitas vezes são suscetíveis à degradação¹⁰ devido a variações de temperatura, de concentração de oxigênio, dentre outros, sendo a vitamina E um composto passível de degradação em função de variações ambientais.¹¹

Dentre os promotores de permeação, pode-se destacar a iontoforese,¹² que consiste na aplicação de potencial ou corrente elétrica, por meio de eletrodos (cátodo e ânodo), associado a fármacos ou compostos de interesse, de forma tópica, na pele,¹³ por exemplo.

Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi realizar estudos da liberação e permeação do α-tocoferol, quando adicionado a um hidrogel, com e sem a aplicação de iontoforese, além de avaliar, por meio eletroquímico, possíveis reações de oxidação ocorridas após a aplicação do material. A importância deste trabalho reside na avaliação da promoção, por parte da iontoforese, do aumento de liberação (facilitador) e permeação do antioxidante α-tocoferol para o meio, em ensaios in vitro, investigando possíveis alterações estruturais ocorridas no princípio ativo, em função da corrente aplicada pela utilização da iontoforese.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes e preparo das amostras

Para a realização das análises, foram preparadas amostras contendo α-tocoferol (SIGMA-ALDRICH^®, grau de pureza > 96%) 1% em massa em meio hidrogel condutor de hidroxietilcelulose 2% manipulado em farmácia de manipulação.

Comportamento eletroquímico do α-tocoferol

Utilizou-se a técnica de voltametria cíclica para o estudo do comportamento eletroquímico do princípio ativo α-tocoferol, com e sem a aplicação de iontoforese. Os voltamogramas cíclicos foram registrados na faixa de potenciais de -0,3 a +1,2 V em uma velocidade de varredura de 10 mV s^-1. Todas as medidas foram realizadas em um sistema de 3 eletrodos, em que um fio de platina era o contraeletrodo e um fio de prata revestido com cloreto de prata era usado como referência. Como eletrodo de trabalho, utilizou-se uma placa de platina, com área superficial de 0,385 cm². As medidas foram realizadas em um potenciostato/galvanostato PGSTAT128N (AUTOLAB/Ecochemie), sendo que todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente em meio de gel hidroxietilcelulose. Todas as análises eletroquímicas foram realizadas em triplicata.

Análise de liberação e permeação in vitro do α-tocoferol em sistema de difusão vertical

As análises de liberação e permeação do α-tocoferol foram realizadas em uma célula de difusão vertical tipo Franz, com solução receptora de hexano P.A (Nuclear). A utilização desta solução receptora justifica-se pela necessidade de solubilidade adequada do princípio ativo no meio receptor,¹⁴ sendo o α-tocoferol lipofílico.^15,16 Este sistema continha uma membrana de acetato de celulose (Sartorius Stedim Biotech com porosidade de 0,45 µm) e biomembrana de muda de pele de cobra (Boa constrictor), cedida pelo Museu de Ciências Naturais da Univates. Ressalta-se, ainda, que as mudas de pele de cobra foram reidratadas por 48 h em solução aquosa de azida sódica 0,0002%.¹⁷ A área exposta de ambas as membranas foi de 7,06 cm², sendo este valor utilizado na determinação do fluxo (J) de liberação para consequente determinação do coeficiente de permeabilidade no estado estacionário (K_p) versus a concentração de α-tocoferol do compartimento doador (C_doador) conforme Equação 1.¹⁸

A referida membrana tem como finalidade separar o compartimento doador do receptor, ou seja, formar uma barreira não interferente entre os fluidos.

A célula de difusão foi introduzida em banho termostatizado a 37 ºC, simulando a temperatura corporal. Em contato com a membrana foi adicionado o agente acoplador, gel hidroxietilcelulose + α-tocoferol 1% em massa. As alíquotas da célula de difusão foram retiradas em tempos de 0, 2, 6 e 10 minutos. Posteriormente, foram realizadas avaliações espectrofotométricas (190 a 990 nm), com pico de absorbância máximo em 275 nm, para a verificação da presença do substrato na solução receptora.¹⁹ Os resultados foram obtidos por meio da utilização de um espectrofotômetro Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 25. Para a determinação da concentração liberada e permeada das amostras analisadas, foi construída uma curva de calibração a partir de soluções de α-tocoferol nas seguintes concentrações: 0,09054 µmol L^-1, 0,36277 µmol L^-1, 0,725546 µmol L^-1 e 1,4510 µmol L^-1. A partir da concentração liberada também foi possível determinar o fluxo de liberação do α-tocoferol por hora para calcular o coeficiente de permeabilidade (Kp).

Aplicação da iontoforese in vitro

A aplicação de iontoforese in vitro foi realizada com o auxílio de um equipamento de iontoforese clínico (AF5 Tone Derm), acoplado ao sistema de difusão vertical, em banho termostatizado a 37 ºC em sistema de dupla camisa, conforme Figura 2, na qual está representada a célula utilizada, o posicionamento dos eletrodos, bem como a imersão em banho com temperatura controlada. Os eletrodos utilizados nas aplicações in vitro foram de carbono grafite (0,5 cm²) e os parâmetros seguiram as prescrições da literatura para a prática clínica:²⁰ frequência de 600 Hz, corrente de 200 µA e tempos de aplicação de 0, 2, 6 e 10 minutos, em sistemas contendo gel de hidroxietilcelulose e gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol.

Figura 2. Sistema utilizado nos experimentos de liberação e permeação, com célula de difusão (1), em banho (2) a 37 ºC; no detalhe (3) aplicação de corrente por meio de eletrodos de carbono (iontoforese)

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Comportamento eletroquímico do α-tocoferol em sistemas associados à iontoforese

Inicialmente, obteve-se os voltamogramas cíclicos do gel de hidroxietilcelulose com e sem a adição de 1% em massa de α-tocoferol (Figura 3).

Figura 3. Voltamogramas cíclicos do gel de hidroxietilcelulose (linha tracejada), e este acrescido de α-tocoferol 1% (linha contínua), v = 10 mV/s

Com base na avaliação da Figura 3, verifica-se que o sistema contendo somente o gel de hidroxietilcelulose apresenta um comportamento eletroquimicamente ativo, com pico de oxidação irreversível em 0,80 V, o que é característico de sistemas contendo parabenos,²¹ em específico o metilparabeno que é um constituinte do hidrogel estudado, sendo utilizado como conservante antimicrobiano. Com a adição de α-tocoferol, há o aumento da corrente anódica em função de sua oxidação. Aliado a isto, observa-se uma leve diminuição no valor do potencial de pico quando comparado ao gel de hidroxietilcelulose apenas.^22,23 Assim, o potencial de pico de oxidação do sistema é deslocado para 0,78 V em função da presença do α-tocoferol, concordante com outros estudos realizados,²³ que obtiveram pico de oxidação do α-tocoferol em potenciais de 0,75 V.

Desta forma, verifica-se que ambos compostos, metilparabeno e α-tocoferol, oxidam-se em potenciais bastante próximos, com deslocamento de potencial de pico para potenciais mais negativos, quando da adição de α-tocoferol, e consequente aumento da corrente de pico, sendo que quando há somente hidrogel, uma banda de oxidação é observada e quando da adição de α-tocoferol observa-se o aparecimento de um pico de oxidação bem definido.

Posteriormente, testou-se o efeito da iontoforese sobre o sistema. Assim, obteve-se os voltamogramas cíclicos do gel de hidroxietilcelulose com a adição de α-tocoferol 1% em massa após a aplicação da iontoforese nos tempos de 0, 2, 6 e 10 minutos (Figura 4), sendo que a amostra analisada é a do compartimento doador. Com base na Figura, é possível tecer alguns comentários sobre a atividade eletroquímica do α-tocoferol em meio hidrogel condutor após a aplicação de corrente elétrica. Com o uso da iontoforese, verifica-se o decréscimo da altura dos picos de oxidação em função do tempo de aplicação, assim como o deslocamento do pico para potenciais mais positivos até os primeiros seis minutos.

Figura 4. Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de hidroxietilcelulose acrescido de α-tocoferol 1% em massa nos diferentes tempos estudados: a: 0 min, b: 2 min, c: 6 min e d: 10 min, v = 10 mV/s

Como esperado, o sinal de corrente do α-tocoferol decai com o tempo, já que parte dele é permeado através da membrana em função da aplicação da iontoforese, sendo este resultado esperado em sistemas que simulam a liberação e permeação do ativo. No entanto, não se verifica tal efeito ao se analisar a carga que passa através do sistema, observando-se um valor quase constante em torno de 0,24 (± 0,01) × 10^-3 C cm^-2, independente do tempo de aplicação estudado. De fato, analisando a Figura 4, observa-se uma diminuição da altura do pico e seu consequente alargamento. Acredita-se que parte do α-tocoferol está sendo degradada pela ação da iontoforese, e que seu produto de degradação esteja sendo oxidado no eletrodo de platina num potencial muito próximo ao do α-tocoferol. Zhang e col.,²⁴ mostram que na oxidação do α-tocoferol até a sua respectiva quinona, há a formação de quatro intermediários, sendo que a intoforese pode ser a responsável pela formação de tais intermediários. Ainda, após 6 e 10 minutos de aplicação de iontoforese, há o aparecimento de um pequeno pico de redução em torno de -0,1 V nas amostras submetidas à aplicação de corrente, o que evidencia que há a oxidação do α-tocoferol a outros intermediários, inclusive a α-tocoferil quinona, com consequente redução deste à α-tocoferol em -0,1 V. Outros trabalhos^24,25 também mostram esta redução, sendo que o valor do potencial de oxidação e redução é dependente do meio e do eletrodo utilizado. Em relação à carga relativa ao pico de redução, em -0,1 V, para o tempo de 6 minutos tem-se 8,49 x 10^-4 C cm^-2, e para o tempo de 10 minutos, 16,98 x 10^-4 C cm^-2, indicando o aumento da quantidade de espécie reduzida para este tempo de aplicação de iontoforese.

Para verificar se o alargamento dos picos da Figura 4 não se devia ao próprio sinal eletroquímico do gel de hidroxietilcelulose, ao invés de um possível produto de oxidação do α-tocoferol, registrou-se os voltamogramas cíclicos do gel após a aplicação da iontoforese por 0, 2, 6 e 10 minutos. Os voltamogramas indicam que o alargamento dos picos não se deve ao gel, uma vez que o sinal de oxidação do metilparabeno presente no gel decai em quase toda a sua totalidade após 10 minutos de aplicação (Figura 1S - Material suplementar). Consequentemente, o deslocamento do pico de oxidação, assim como o seu alargamento, se devem à presença de um subproduto da oxidação do α-tocoferol.

Determinação da quantidade liberada de α-tocoferol em sistemas de difusão vertical

Após a avaliação eletroquímica, foram realizados experimentos de liberação em sistemas de difusão vertical, com o intuito de se avaliar variações no coeficiente de permeabilidade em sistemas com e sem aplicação de iontoforese. Ainda, para análise dos resultados em termos de concentração, foi construída curva de calibração a partir de soluções de α-tocoferol, sendo que, por meio destes valores, obteve-se a equação da reta, e a curva obtida foi: y = -0,00202 + 547,36573.x, com coeficiente de correlação R = 0,97385.

A Figura 5 apresenta as curvas da quantidade liberada de α-tocoferol dos ensaios de difusão sobre a membrana de acetato de celulose, de sistemas com e sem aplicação de iontoforese. Os resultados obtidos com membrana de acetato de celulose indicam que o fluxo de partículas é proporcional ao gradiente de concentração.

Figura 5. Quantidade liberada de α-tocoferol em função do tempo (horas) em sistemas de difusão vertical contendo gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol controle (■) e associado à iontoforese (●)

Para a obtenção dos parâmetros de liberação no sistema analisado, utilizou-se a segunda lei de Fick, seguindo-se o modelo de dose infinita, em que o gradiente de concentração é constante e, consequentemente, a concentração de fármaco do compartimento doador também o será.²⁶

Os resultados de fluxo a partir dos ensaios de liberação sem e com a aplicação de iontoforese foram, respectivamente, de 1,13 µmol L^-1 cm^-2 h^-1 e 2,33 µmol L^-1 cm^-2 h^-1. Estes resultados demonstram que a liberação é aumentada cerca de 105% quando da aplicação de iontoforese ao sistema.

Comparando estes valores de liberação encontrados com outro trabalho publicado¹⁶ tem-se que, em meio gel de hidroxietilcelulose, após 10 min, obteve-se a liberação de 0,45 µmol cm^-2 de α-tocoferol, enquanto que no trabalho publicado a liberação foi de aproximadamente 7,23 µmol cm^-2 em meio de microemulsão óleo/água, sendo o meio extremamente importante na liberação do ativo, bem como na manutenção de sua estrutura e propriedades.²⁷ A escolha do gel de hidroexietilcelulose, como veículo no presente trabalho, justifica-se por este ser adequado para a aplicação de iontoforese, possuindo características condutoras e viscosidade adequada. Cabe ressaltar que características reológicas, bem como alterações de constituição do meio e pH, alteram a liberação dos sistemas.^28,29

A partir dos resultados de fluxo, foram calculados os coeficientes de permeabilidade para o grupo controle e para o grupo com aplicação de iontoforese.

Na Figura 6, tem-se os coeficientes de permeabilidade do α-tocoferol sobre a membrana de acetato de celulose sem (controle) e com aplicação de iontoforese.

Figura 6. Coeficiente de permeabilidade do α-tocoferol sobre a membrana de acetato de celulose em sistemas controle e com aplicação de iontoforese

A partir dos resultados obtidos, tem-se que o coeficiente de permeabilidade do α-tocoferol sem e com aplicação de iontoforese foi, respectivamente, 48,15 cm^-2 h^-1 e 98,81 cm^-2 h^-1, apresentando diferença significativa, aplicando teste t com intervalo de confiança de 95% (t = 4; p = 0,01).

Ainda, com base neste resultado, verifica-se que a aplicação de iontoforese in vitro promove o aumento do fluxo e do coeficiente de permeabilidade do α-tocoferol em meio gel de hidroxietilcelulose,

Determinação da permeação in vitro de α-tocoferol em biomembrana de Boa constrictor

Após a realização dos ensaios de liberação, foram realizados experimentos de permeação do α-tocoferol, em células de difusão vertical, com biomembranas de Boa constrictor, em grupo controle e após aplicação de iontoforese. Na Figura 7 tem-se a média e o desvio padrão da concentração permeada do princípio ativo sem e com a aplicação de iontoforese, nos tempos 2 e 10 min. Estes tempos utilizados nesta avaliação justificam-se por serem, respectivamente, o menor e o maior tempo de aplicação de iontoforese utilizados nos estudos de difusão (lei de Fick).

Figura 7. Quantidade permeada do α-tocoferol sem (■) e com (□) aplicação de iontoforese, nos tempos 2 e 10 min

Avaliando os resultados apresentados na Figura 7, verifica-se que para o grupo controle há uma tendência de aumento da permeação, porém não há diferença significativa para os tempos 2 e 10 minutos, aplicando teste t com intervalo de confiança de 95%. Este fato pode ser devido à utilização de biomembranas neste estudo, que não possuem uniformidade em termos de espessura, simulando in vitro a não uniformidade do estrato córneo humano. Ainda, cabe ressaltar que a muda de pele de cobra Boa constrictor possui similaridade em termos de propriedades de absorção de água, composição lipídica e de permeação.^17,30 Nos ensaios de permeação in vitro com aplicação de iontoforese, a quantidade permeada de α-tocoferol para o tempo de 2 minutos foi de 0,23 ± 0,03 µmol L^-1 cm^-2, e para o tempo de 10 minutos foi de 0,36 ± 0,02 µmol L^-1 cm^-2, apresentando diferença significativa para intervalo de confiança de 95% (t = 3; p = 0,02). Já quando comparado o tempo 10 minutos para o grupo controle e após a aplicação de iontoforese, têm-se em termos percentuais médios, 60% de aumento de permeação, indicando, portanto, que a aplicação de iontoforese promove um aumento de permeação, principalmente em maiores tempos de aplicação de corrente.

Ainda, comparando os resultados de quantidade permeada de α-tocoferol em biomembrana de muda de pele de cobra com trabalhos publicados na literatura, que estudam a permeação do ativo, verifica-se que, para estudos em pele de orelha de coelho,²⁷ após 1 hora de ensaio de permeação tem-se que a quantidade permeada de Vitamina E foi de 6,96 µmol cm^-2. Já em estudos de permeação na epiderme de orelha de suíno,¹⁶ após 6 horas de experimento houve a permeação e retenção de 4,16 µmol L^-1 cm^-2. Estes resultados são compatíveis com os obtidos no presente estudo, considerando-se que o tempo máximo de permeação avaliado foi de 10 minutos, indicando que em tempos maiores há uma tendência de aumento da quantidade permeada, e que a iontoforese atua como promotora desta permeação.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos demonstraram, a partir de técnicas eletroquímicas, que há uma tendência de degradação do α-tocoferol com o incremento do tempo de aplicação da iontoforese. Sugere-se então que a iontoforese, em frequência de 600 Hz e corrente de 200 µA, tem a capacidade de oxidar parte do princípio ativo analisado. Por outro lado, por meio dos ensaios de liberação e permeação, verifica-se que com a aplicação de iontoforese há um incremento de liberação e permeação de α-tocoferol para o meio receptor. Desta forma, a associação de α-tocoferol e iontoforese é indicada para a prática clínica, considerando a ação antioxidante deste princípio ativo.

MATERIAL SUPLEMENTAR

No material suplementar, disponível em http://quimicanova.sbq.org.br na forma de arquivo PDF, com acesso livre, encontram-se os voltamogramas do gel de hidroxietilcelulose com e sem a aplicação de iontoforese, sobre eletrodo de platina (Figura 1S).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq pelo auxílio financeiro concedido.

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