JBCS

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas têm-se observado um grande interesse pelo potencial terapêutico das plantas medicinais,¹ de tal modo que cerca de 30% das drogas prescritas no mundo são obtidas direta ou indiretamente das plantas.² Estima-se que cerca de 60% da população mundial faça uso de ervas e produtos naturais para diversos tratamentos.³ Muitas espécies de plantas, aromáticas ou não, têm sido testadas principalmente devido à sua atividade antioxidante, propriedade hipoglicêmica, antimicrobiana, dentre outras.^3,4

As plantas da família Lamiaceae tem despertado interesse devido seus efeitos biológicos diversos como: antioxidante, antimicrobiano, hipoglicêmico, antidistúrbios digestivos entre outros.⁵ Dentre as plantas desta família, destaca-se o Origanum vulgare L. (orégano), que é uma das espécies mais importantes da família Lamiaceae, e é utilizada como erva aromatizante em muitas cozinhas de todo o mundo, especialmente na culinária mediterrânea.^6,7

A composição química dos vegetais depende do clima, da altitude e do período de colheita. Espécies como o orégano apresentam uma composição bastante diversificada como polímeros naturais, dentre eles podemos citar: polissacarídeos, tais como a celulose e outras fibras, e proteínas.^8,9 Compostos de menor massa molar, como os compostos fenólicos, lipídios, ácidos graxos, flavonóides,¹⁰ limoneno, beta-cariofileno, p-cimeno, linalol e alfa-pineno,¹¹ ácido o-cumárico, ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido vanílico e ácido rosmarínico,³ além de uma classe com certa relevância que são os óleos essenciais com cerca de 30 compostos ativos.^12,13

Os óleos essenciais constituem, de uma maneira geral, uma mistura muito complexa de hidrocarbonetos, álcoois e aromáticos, encontrados em todo tecido vivo de plantas. Em geral, esses compostos estão concentrados na casca, nas flores, nas folhas, nos rizomas e nas sementes. Sua composição pode variar segundo a localização, embora todos os órgãos de uma planta consigam acumular óleos voláteis.¹⁴

Em contato com a água, os óleos essenciais apresentam solubilidade limitada, mas suficiente para aromatizar as soluções aquosas denominadas hidrolatos. Por serem voláteis, necessitam ser estocados em recipientes hermeticamente fechados e protegidos da luz direta, calor, umidade e metais.¹⁵

Na composição química das folhas do orégano observa-se a existência de até 1% de óleo essencial, com média de 40 a 70% de cavacrol, seguido de borneol, cineol, terpineol, terpineno e timol.¹⁶

O óleo essencial é utilizado na composição de aromatizantes de alimentos, de perfumes e na medicina. Toda a planta é utilizada na medicina doméstica, costume esse originário da Itália.¹⁷ Cada um de seus componentes pode também ter uma aplicação específica, como por exemplo, 1,8-cineol - medicinal e cosmético; p-cimeno-aditivo na indústria de perfumaria, solvente e material de partida para síntese orgânica; farnesol - bactericida; linalol - perfumaria e flavorizantes; acetato de geranila - perfumaria.¹⁸

Com relação à composição química dos óleos essenciais, os autores destacam a importância de técnicas instrumentais e simples, mas com precisão para a identificação destes compostos, como a técnica de cromatografia gasosa (CG). É uma das técnicas mais difundidas para análises químicas, por apresentar um processo de separação eficiente na elucidação de estruturas.^19,20

Diante dos inúmeros benefícios que as plantas em geral apresentam, tem-se verificado grande avanço científico envolvendo estudos químicos, alimentícios e farmacológicos das plantas medicinais, visando obter novos compostos com propriedades farmacêuticas.²¹

As principais técnicas e análises utilizadas na avaliação de alimentos são as técnicas espectroscópicas, tais como: ultravioleta (UV), infravermelho, além das análises cromatográficas. No entanto, poucos trabalhos dedicados ao estudo da planta Origanum vulgare foram publicados. Alguns destes estudos avaliam a atividade antioxidante da planta, enquanto outros investigam a importância dos óleos essenciais no efeito inibitório sobre determinadas bactérias.²²

Uma técnica que pode ser promissora para este tipo de estudo é a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) que é capaz de analisar amostras empregando equipamentos de alta e baixa resolução, permite avaliar as amostras em seus estados físicos e a análise de diferentes núcleos, possibilita ainda a utilização de um conjunto de técnicas não destrutivas que informam tanto sobre a estrutura química quanto a dinâmica molecular.^23,24

De acordo com essas características da RMN, as análises do núcleo de hidrogênio são fundamentais para o estudo de diferentes sistemas por meio da análise da dinâmica molecular.^25-27 Os processos de relaxação relacionam o tempo necessário para que os spins nucleares retornem ao seu estado fundamental após a liberação da energia absorvida quando do fenômeno da RMN. Os processos de relaxação são de dois tipos: relaxação spin-rede e o processo de relaxação spin-spin.^25-30

A relaxação spin-rede também é chamada de longitudinal e está relacionada ao retorno da população de spins ao seu equilíbrio térmico, a este processo de relaxação está associada uma constante de tempo, T₁, este é um processo entálpico e a transferência de energia dos spins é doada indiscriminada para a rede, sendo transformada em movimentos rotacionais e translacionais na molécula.^25,26 A medida do tempo necessário para que ocorra essa relaxação fornece informações sobre a presença de domínios de mobilidades diferentes, homogeneidade, miscibilidade, interação entre componentes, entre outros.^25-31

A relaxação transversal, também denominada spin-spin, possui constante de tempo T₂ e está relacionada ao decaimento do sinal de ressonância. Neste processo de relaxação ocorre a transferência de energia de um spin para outro spin muito próximo. A relaxação T₂ está relacionada tanto ao FID (Free Induction Decay) quanto à largura dos sinais no espectro. Se o FID for curto, ou seja, com decaimento rápido, o T₂ correspondente será curto e os sinais obtidos serão largos, o que é o caso de materiais sólidos. E, de forma análoga, obtendo-se um FID largo, que terá decaimento lento, o T₂ será longo e seus sinais correspondentes serão finos. Assim, amostras que possuem reticulação são rígidas, e irão apresentar sinais muito largos. As amostras cristalinas, devido à isotropia obtida pela orientação, irão apresentar sinais mais finos, em comparação a amostras amorfas (anisotrópicas). As amostras que possuem ligações hidrogênio terão um aumento na largura do sinal, devido à menor mobilidade molecular, restrição de movimentos, que essas interações proporcionam à molécula.^30-32

Na literatura, encontram-se vários estudos de caracterização por RMN de produtos naturais. Os resultados encontrados demonstram a potencialidade desta técnica como, por exemplo, seu uso na diferenciação de água e gordura em alimentos, já que estes são os componentes mais abundantes nos alimentos. A água presente nos alimentos pode se comportar de maneira distinta devido as interações que estabelece nesses sistemas. Assim, quando analisadas por RMN via relaxação nuclear mostram a interferência deste comportamento nos valores de relaxação. Com isso, as moléculas de água estão diferentemente associadas a macromoléculas, possuem distintas mobilidades moleculares e, consequentemente, apresentam tempos de relaxação diferentes. Essas interações são responsáveis por propriedades químicas variadas, para diferentes itens alimentares como produtos animais e vegetais. Os diferentes comportamentos de populações de água em distintos compartimentos podem ser obtidos pelas curvas de relaxação de RMN, por exemplo, o desvio exponencial do decaimento da relaxação, como mostrado nas Equações 1 e 2.³³

nas quais S_t é o total do sinal de relaxação, A é a amplitude proporcional de água (igual aos núcleos de hidrogênio na água) e t_n é o tempo de relaxação do núcleo de hidrogênio da água para um tipo de hidrogênio encontrado no sistema. Se há dois ou mais compartimentos de água, isso pode ser expresso como:

Em outros estudos, feitos em alimentos por RMN, pretendeu-se determinar os tempos de relaxação dos sistemas de spins nucleares destacando-se as técnicas de relaxometria clássicas.^34-36

Baranowska e colaboradores estudaram relaxação nuclear de ¹H em suspensão aquosa de amido de batata com gomas arábicas, xantanas e outras. Neste trabalho foram investigadas as relaxações longitudinal e transversal com referência às moléculas de água presentes na amostra, e constatou-se a influência da temperatura (55 ºC) nos valores de tempos de relaxação detectados para as amostras. Neste estudo, a temperatura de 55 ºC é apontada como uma temperatura de mudança nas interações água/polímero, isto é, em 5% de suspensão aquosa de amido de batata em temperatura em elevação até 55 ºC há aumento de T₁H e T₂H. Segundo o autor, esse aumento é devido à consequente produção de desordem causada pela elevação da temperatura. No entanto, T₁ tem seu decréscimo quando a análise tem seu início na temperatura de 55 ºC, devido ao processo de gelatinização, no qual há imobilização de moléculas de água dentro da estrutura gel formada.³⁷

Em outro estudo de Tang e colaboradores foram realizadas análises com o uso da técnica CPMAS em combinação com relaxação do núcleo de ¹H (T₁, T₁ρ, T₂) para a análise da dinâmica molecular da parede celular de batatas e sistema de modelos para detalhes estruturais dos domínios presentes. Neste estudo, T₁ demonstra ter maior valor para a celulose e os menores valores foram atribuídos à lignina e hemicelulose. Já os valores de T₂ para a celulose são menores que 20 µs, sendo que a pectina está contribuindo para ambos os tempos de relaxação.³⁸

Além das técnicas de relaxação T₁ e T₂, outra técnica de relaxação é muito utilizada na identificação e caracterização da dinâmica molecular de sistemas complexos, sendo esta chamada de técnica de relaxação de campo cíclico rápido (Fast Field Cycling NMR ou FFC).^39,40

Assim, de acordo com o exposto, o objetivo principal deste trabalho foi utilizar a técnica de RMN de baixa resolução, por meio da mudança na relaxação nuclear do hidrogênio, empregando as constantes de tempo T₁H e T₂H, para avaliar mudanças na estrutura ou degradação das amostras de orégano quando submetidas ao tratamento térmico e durante a cocção.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Coleta do material

O orégano comercial (desidratado) e a planta in natura foram adquiridos em mercado varejista no município do Rio de Janeiro durante os anos de 2013 e 2014.

Preparo das amostras

As amostras comercial e in natura do Origanum vulgare foram postas em estufa com circulação de ar por uma hora, a diferentes temperaturas: 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC, 100 ºC e 150 ºC. As dez amostras foram analisadas pelas técnicas de espectroscopia de absorção na região do infravermelho, determinação do tempo de relaxação spin-rede para determinação do valor de T₁ e spin-spin para determinação do valor com constante de tempo T₂.

Determinação dos tempos de relaxação spin-rede

Para a determinação das medidas de relaxação nuclear foi utilizado um espectrômetro de RMN de baixo campo Maran Ultra 23, operando à frequência de 23 MHz (para o núcleo de hidrogênio) e equipado com sonda de 18 mm, com variação de temperatura. O tempo de relaxação spin-rede do hidrogênio foi determinado diretamente pela sequência de pulso inversão-recuperação (180º-90º), o pulso de 90º foi calibrado automaticamente pelo software do equipamento. A amplitude do FID foi de 40 pontos variando de 0,1 a 5000 ms, com 4 medidas para cada ponto com um intervalo de reciclo de 1 segundos. O tempo de relaxação spin-spin do hidrogênio foi medido pela sequência de pulso CPMG, com tempo de intervalo entre os pulsos de 90º e 180º de 100 microsegundos. Os valores e as intensidades relativas de relaxação foram obtidos pelo fitting dos dados exponenciais com a ajuda do programa do equipamento denominado winfit (versão 2.4.0.0).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise por relaxometria

Com o objetivo de obter informações sobre a dinâmica molecular das amostras de orégano comercial e in natura, foram determinados os tempos de relaxação T₁H e T₂H, em um espectrômetro de RMN de baixa resolução, no estado sólido, utilizando a técnica-inversão recuperação e CPMG, respectivamente.

Análise dos tempos de relaxação spin-rede

O tempo de relaxação spin-rede é uma maneira rápida e eficiente de avaliar o comportamento dinâmico molecular de um material (fase sólida e fase líquida), pois gera dados sobre mobilidade molecular deste, assim como as interações presentes entre os componentes de um sistema, principalmente em sistemas heterogêneos, como os alimentos.^{36, 39-42}

A determinação dos tempos de T₁H foi realizada visando obter informações sobre a fase sólida destas. As Tabelas 1 e 2 exibem os valores de T₁H para as amostras do orégano comercial e in natura, respectivamente. Foram determinados dois valores de relaxação spin-rede para ambos os sistemas denominados de T_1,1 e T_1,2; o menor valor do parâmetro de relaxação (T_1,1) é referente a fração de maior mobilidade molecular e o maior valor (T _1,2) é referente as estruturas de maior massa molar, e consequentemente mais rígidas.

 

 

 

 

As medidas de relaxação spin-rede mostraram comportamento semelhante para as amostras. No entanto, o efeito da temperatura foi mais acentuado para a fração de maior massa molar. Isso se deve a maior susceptibilidade das estruturas mais complexas em formar novas e mais fracas interações após a saída da água, pela diminuição das ligações de hidrogênio.

Foi observado que para as temperaturas de 25 ºC e 37 ºC os valores de relaxação T_1,1 sofrem uma diferença significativa em face do efeito da temperatura (similar a temperatura corpórea) devido às quebras das interações das partículas de menor massa molar, perda de água e voláteis. Além disso, a similaridade entre os valores de T_1,1 e T_1,2 para temperaturas acima de 50 ºC reside no fato da perda das moléculas de maior mobilidade molecular e menor massa molar ter sido significativa até a temperatura de 37 ºC.

As Figuras 1 e 2 mostram as curvas de distribuição de domínios de relaxação spin-rede das amostras de orégano comercial e in natura, respectivamente. As curvas de domínio de relaxação spin-rede das amostras de orégano comercial e in natura mostraram apenas um pico com uma base muito larga, este alargamento aumenta de acordo com o aumento de temperatura.

 

 

 

 

As curvas de domínios de relaxação nuclear, quer seja o tempo de relaxação longitudinal, quer seja o tempo de relaxação transversal, mostram o perfil exponencial da distribuição dos tempos de relaxação, que nos permite inferir sobre a organização do sistema. Quanto mais alargada for a curva de distribuição dos domínios, mais heterogêneo é o sinal. Essas curvas não apresentam deslocamento químico, mas sim o perfil de relaxação dos núcleos totais de hidrogênio presentes no sistema. De acordo com as curvas de domínios da Figura 1, nota-se que para a amostra comercial houve, além do alargamento das curvas de domínio, um deslocamento desta. Entretanto, para a temperatura de 50 ºC isto não ocorreu. Esse deslocamento pode ser devido a uma reorganização das estruturas constituintes da planta com a saída dos diferentes tipos de água existentes da amostra, causando um enrijecimento das estruturas presentes na mesma. Já para a temperatura de 50 ºC, o comportamento se assemelha àquele observado para a amostra a temperatura de 25 ºC, pois pode ter havido formação de diferentes tipos de interações, visto que o material inicial não apresentava um teor de água similar ao do material comercial. À temperatura de 100 ºC o deslocamento das curvas de domínio foi menor do que o observado para as outras temperaturas. Tal comportamento pode ser explicado pelo fato da saída de diferentes tipos de água ter causado arranjos moleculares e interações inter e intramoleculares diferentes e distintas das outras temperaturas de desidratação. O processo continua à temperatura de 150 ºC. Além disso, observa-se também um aumento do alargamento das curvas de domínio mostrando a heterogeneidade do material.

Na Figura 2, que apresenta as curvas de domínio de relaxação longitudinal do núcleo de hidrogênio do orégano in natura, observa-se que esta amostra apresenta um alargamento nas curvas de domínio maior do que aquele ocorrido para a amostra comercial, tendo em vista que a amostra comercial já havia sofrido tratamento de desidratação. Esse maior alargamento, assim como o deslocamento para tempos de relaxação menores, indica que a perda dos tipos de água de desidratação também influenciou na organização estrutural da planta, conforme já observado em trabalhos anteriores,³³ tornando-a mais heterogênea. Avaliando as diferentes temperaturas de desidratação observa-se a liberação de água de diferentes ambientes: a 25 ºC o sistema mostra que o domínio é regido pela água adsorvida pela mesma estar em grande quantidade; a 37 ºC inicia-se a perda da água adsorvida (externa), a 50 ºC ocorre à continuidade do processo de perda de água, iniciando-se a visualização da heterogeneidade da amostra, sem a influência predominante da água adsorvida. Na temperatura de 100 ºC observa-se o início de uma degradação/reorganização estrutural por perda de componentes mais voláteis e óleos, implicando num aumento do valor de T₁ em face do aumento da rigidez devido à perda da fração mais oleosa. Para 150 ºC a diminuição do valor de T₁ advém do início de uma possível degradação, por ação térmica das cadeias de constituintes de baixa massa molar, alguns tipos os terpenos e polissacarídeos.

Análise por relaxação spin-spin

Os tempos de relaxação T₂H foram determinados visando obter informações sobre a fase líquida das amostras analisadas. As Tabelas 3 e 4 mostram os valores de T₂H para as amostras do orégano comercial e in natura, respectivamente. Foram determinados três valores de tempos de relaxação transversais para as amostras. Os dois primeiros tempos de relaxação remetem aos prótons das águas estruturais enquanto que o terceiro domínio refere-se à água adsorvida.

 

 

 

 

De acordo com os dados de relaxação nuclear spin-spin listados nas Tabelas 3 e 4, a amostra de orégano in natura é mais susceptível à degradação quando relacionada ao aumento da temperatura de desidratação do que a amostra de orégano comercial, que por ter sofrido um pré-tratamento térmico e, por isso, ter perdido a água adsorvida e uma água mais interna (extracelular), o que pode ter gerado novas organizações estruturais, com menor número de ligação de hidrogênio, que promovem proteção maior quando esta amostra é submetida a tratamento térmico. Esse comportamento corrobora com o que já foi observado com relação à avaliação da dinâmica molecular dessas amostras pelo tempo de relaxação spin-rede.

As Figuras 3 e 4 mostram o comportamento das curvas de distribuição de domínios de relaxação spin-spin do núcleo de hidrogênio das amostras de orégano comercial e in natura, respectivamente. As curvas de domínio de relaxação spin-spin das amostras de orégano comercial e in natura mostraram um pico com base alargada, conforme o aumento de temperatura, sendo característico da perda de água. Também foi observado o aparecimento de novos domínios, possivelmente pela reorganização estrutural ou o aparecimento de novas estruturas organizacionais pela formação de novas interações inter e intramoleculares pela perda de água das amostras.

 

 

 

 

A Figura 4 apresenta o mesmo comportamento observado na Figura 2, no qual a temperatura de 50 ºC sofreu efeito diferenciado das demais temperaturas de tratamento - desidratação. Já para a Figura 3 o comportamento foi diferente do observado para a Figura 2, mostrando que entre as temperaturas mais baixas (25 e 37 ºC) não houve nenhuma mudança significativa, e as demais temperaturas tiveram o mesmo comportamento da amostra comercial.

 

CONCLUSÕES

A avaliação da dinâmica molecular do Origanum vulgare apresentada mostrou que o comportamento das amostras comercial e in natura apresentam similaridades e particularidades quanto à formação e reorganização estrutural. Ambas se devem a perda de água pelo processo de desidratação por temperatura que gera reorganizações estruturais devido à quebra de ligações de hidrogênio inter e intramoleculares durante o processo de desidratação, propiciando assim a geração de novas e mais fracas ligações nos sistemas. A avaliação por T₁H mostra que as estruturas de maior massa molar são mais sensíveis ao aumento da temperatura. De acordo com os valores de T₂H, até a temperatura de 150 ºC não se observa um efeito significativo na mobilidade e organização da água estrutural. Esses dados podem inferir na temperatura ideal de cozimento e preparação de chás a partir desta erva, que deve ser em torno de 100 ºC.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES e ao CNPQ pelo apoio financeiro ao Projeto.

 

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