JBCS

INTRODUÇAO

As esponjas de água doce sao classificadas em mais de 200 espécies pertencentes a 45 gêneros, distribuídos em seis famílias. Uma sétima família é restrita apenas a registros fósseis. Na regiao Neotropical é relatada a maior diversidade de esponjas dulcícolas com 65 espécies divididas em três famílias: Metaniidae, Potamolepidae e Spongillidae. A família Spongillidae apresenta uma distribuiçao bastante cosmopolita.¹

A pesquisa com substâncias voláteis está centrada em plantas terrestres, nas quais estas substâncias podem exercer diversas funçoes, como atrativos e repelentes de insetos, alelopática, entre outras.² Assim como ocorre em terra, a comunicaçao entre organismos aquáticos pode ocorrer por meio de substâncias voláteis.³

A identificaçao de substâncias voláteis de plantas é tradicionalmente realizada empregando cromatografia em fase gasosa acoplada a detectores de espectrometria de massas e ionizaçao de chama e utilizando padroes de hidrocarbonetos lineares para os cálculos de índices de retençao linear.⁴ Técnica semelhante é descrita no estudo de substâncias voláteis de esponjas marinhas.^5-8

Esponjas adquirem seus esteróis de quatro diferentes formas: a partir da biossíntese direta; pela ingestao; pela modificaçao de esteróis ingeridos; ou pela biossíntese associada a algum organismo simbionte.⁹ O número de esteróis presentes nas esponjas varia fortemente com a espécie, limitando-se geralmente entre sete e dez. Em muitos casos há apenas um esterol que se apresenta como majoritário e os demais aparecem em quantidade traço.¹⁰

A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas é também empregada na identificaçao de esteróis. Outros recursos empregados sao o uso de padroes para o cálculo de tempos de retençao relativos, e reaçoes de derivatizaçao utilizadas para facilitar a visualizaçao de picos diagnósticos no espectro de massas, além de obter um melhor comportamento cromatográfico.^11,12

Amostras pertencentes à espécie Trochospongilla paulula (Bowerbank, 1863) foram coletadas no rio Tapajós, permitindo a descriçao, pela primeira vez, da composiçao volátil de uma esponja dulcícola. Além disso, a análise de esteróis de uma espécie pertencente à família Spongillidae coletada na Amazônia permite a comparaçao com outras espécies da mesma família, provenientes de outros biomas.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Material biológico

Espécimes de Trochospongilla paulula (Bowerbank, 1863) foram coletados no município de Santarém, no distrito de Alter do Chao - PA (2º 30,215' S 54º 57,526' O) em 23 de outubro de 2011, com autorizaçao do SISBIO número 30292-1. As espécies foram identificadas por técnicas de microscopia¹³ e amostras voucher foram depositadas na coleçao de invertebrados do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia sob o número INPA 0078. Os espécimes foram coletados próximos à linha d'água, e mantidos congelados a - 5 ºC até o momento da extraçao, para análises de voláteis. Para as análises de esteróis foram coletados espécimes secos, na mesma regiao.

Obtençao das fraçoes esteroídicas

Inicialmente, foram realizadas extraçoes por maceraçao a frio e em extrator tipo Soxhlet por 12 h, ambas com solvente hexano, com as esponjas secas (10,000 g), conforme coletadas na natureza. Nao sendo observadas diferenças no perfil cromatográfico dos extratos obtidos, as extraçoes subsequentes foram realizadas em aparelho tipo Soxhlet. O extrato em hexano foi submetido à cromatografia com sílica impregnada com KOH com o intuito de se obter uma fraçao livre dos ácidos graxos presentes no extrato. A fraçao nao ácida obtida foi entao submetida à cromatografia de coluna aberta utilizando misturas de hexano e acetato de etila como eluentes, em gradiente crescente de polaridade. As fraçoes foram analisadas por cromatografia em camada delgada, reunidas, e as que apresentavam fator de retençao similar ao do colesterol foram submetidas à cromatografia flash e as fraçoes obtidas, ricas em esteróis, foram acetiladas e analisadas por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaçao por chama (CG-DIC) e cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). As acetilaçoes foram realizadas com anidrido acético, utilizando dimetilaminopiridina (DMAP) como catalizador. Tempos de retençao relativos ao colesterol (TRR) foram calculados para auxiliar na identificaçao dos esteróis, utilizando um padrao de colesterol.

Extraçao da fraçao volátil

A extraçao foi realizada por extraçao e destilaçao simultâneas (SDE) em aparelho Likens-Nickerson.¹⁴ A esponja congelada foi submetida por 3 horas à extraçao e destilaçao simultânea contínua e a fraçao volátil, obtida em clorofórmio, foi seca com Na₂SO₄ anidro e armazenada em freezer até a análise em CG-DIC e CG-EM.⁵

Análises por cromatografia em fase gasosa

As análises foram realizadas em cromatógrafo em fase gasosa da Shimadzu^® modelo CG2010, equipado com detector de ionizaçao por chama (CG-DIC) e coluna DB-5, com medidas de 15 m × 0,25 mm × 0,25 µm, sendo utilizado como gás de arraste hélio em fluxo de 1 mL min^-1, e cromatógrafo em fase gasosa da Shimadzu^® modelo QP-2010, acoplado a um espectrômetro de massas (CG-EM) com coluna similar, empregando a técnica de impacto eletrônico a 70 eV.

Para a identificaçao dos esteróis a temperatura da coluna foi programada para iniciar a 100 ºC, com acréscimo de 5 ºC min^-1 até 290 ºC, permanecendo em 290 ºC por 10 minutos e as injeçoes foram realizadas no modo split 1:20. A análise dos esteróis acetilados foi realizada empregando uma isoterma a 280 ºC por 60 minutos e as injeçoes foram realizadas no modo split 1:20. Um padrao de colesterol acetilado foi utilizado para o cálculo do tempo de retençao relativo.

Para a fraçao volátil da esponja a temperatura da coluna foi programada para iniciar a 60 ºC e subir 3 ºC min^-1 até atingir 240 ºC, e a injeçao foi realizada no modo splitless. Padroes de hidrocarbonetos lineares foram injetados nas mesmas condiçoes para a obtençao dos índices de retençao linear. A identificaçao foi realizada pelo conjunto de espectros de massas, comparados com espectrotecas, tempos de retençao, índices de retençao e fragmentografia de massas, para identificaçao das séries homólogas.

 

RESULTADOS E DISCUSSAO

Extraçao por SDE

A comunicaçao entre organismos aquáticos por meio de compostos voláteis é documentada para diversos organismos.¹⁵ Para esponjas sao propostos mecanismos de interaçao ecológica por meio de aleloquímicos exsudados.¹⁶ Até o presente momento, nao há registros de estudos dos voláteis das esponjas dulcícolas.

O SDE é um método que proporciona alta recuperaçao para amplo conjunto de substâncias, em especial para óleos voláteis presentes em pequenas quantidades.¹⁷ Em estudo com esponjas marinhas do gênero Plakortis foram observados rendimentos entre 0,5 e 0,6% na obtençao de compostos voláteis empregando essa técnica.⁵ No presente estudo, que também utilizou o SDE, foi observado um rendimento do óleo volátil da esponja dulcícola T. paulula bastante baixo, inferior a 0,1%. Rendimentos baixos de óleos voláteis também sao relatados para algumas plantas como as partes aéreas de Stachys recta L. para as quais é relatado o rendimento de 0,014%.¹⁸

Foi possível identificar sete substâncias que representam 69,71% da fraçao volátil da esponja T. paulula (Tabela 1). Esse percentual é próximo (e até superior) ao observado em estudos similares realizados com esponjas marinhas. Para as espécies marinhas Plakortis angulospiculatus e P. lita os percentuais de substâncias identificadas dos óleos voláteis foram de 37,56% e 66,36%, respectivamente.⁵ Já para espécie Siphonodictyon coralliphagum foram identificados 99,61% da composiçao de seus voláteis,⁷ enquanto que na espécie Geodia cydonium foram identificados 85,5%. Resultados anteriores com esponjas do gênero Tedania sp. foram identificados 39,8 a 71,4% dos compostos.⁶

 

 

O composto majoritário encontrado no óleo volátil, o hexadecanol, identificado pelo conjunto de dados de índice de retençao, espectrometria de massas e fragmentografia, corresponde a 31,15% do óleo, e, somado aos dois outros álcoois presentes, totalizam 51,65%. Resultado similar foi relatado para um dos espécimes de esponjas marinhas do gênero Phycopsis, no qual o dodecanol aparece como majoritário entre seus voláteis, representando 29,39% de sua composiçao. No entanto, em outro espécime do mesmo gênero nao foram detectados álcoois.⁸ Outros estudos de compostos voláteis de esponjas marinhas relatam a presença de álcoois, muitas vezes aromáticos, como componentes minoritários.^7,19

Dois ácidos graxos de cadeia linear saturada foram identificados, os ácidos pentadecanóico (5,02%) e hexadecanóico (9,30%). Tais substâncias já foram relatadas na fraçao volátil de esponjas marinhas.^7,8 A presença de ácidos graxos livres é associada à degradaçao de lipídios. No entanto, a forma de extraçao branda empregada do SDE nao é associada à produçao de artefatos.

Acidos graxos com número ímpar de átomos de carbono sao associados à presença de bactérias.²⁰ A associaçao de esponjas com microrganismos é bastante documentada,²¹ inclusive em ambientes dulcícolas.²² Outra justificativa para a presença de metabólitos de bactérias nas esponjas é que, ao filtrar a água, esses microrganismos sao absorvidos como alimento.²³

É interessante observar que o aroma percebido no óleo essencial é bastante semelhante àquele identificado por diversos participantes da pesquisa como o "cheiro do rio", onde as esponjas foram coletadas.

Esteróis

Colesterol é o esterol comumente encontrado como majoritário em membranas celulares do reino animal, principalmente em vertebrados, embora diversos invertebrados marinhos apresentem esteróis com esqueletos modificados ou com grupos alquilas adicionais na cadeia lateral como majoritários. Nas esponjas dulcícolas das famílias Spongillidae e Lubormiiskidae, o colesterol é relatado como esterol majoritário.^11,24,25 Entretanto, para esponjas dulcículas dos gêneros Drulia e Metania (Metaniidae) coletadas no rio Negro, o 24-etil-colesta-5,22-dieno-3β-ol é o esterol majoritário.²⁶ Como esta foi a primeira pesquisa com esteróis de esponjas dulcícolas da Amazônia e, também, a primeira vez em que esponjas da família Metaniidae foram estudadas, um novo estudo com esponjas da Amazônia e da família Spongillidae faz-se necessário para avaliar: 1. se a presença do colesterol como minoritário é uma característica das esponjas da Amazônia; 2. Se o 24-etil-colesta-5,22-dieno-3β-ol é um marcador de esponjas da regiao ou somente da família Metaniidae; e, 3. Se as esponjas da família Spongillidae amazônicas possuem composiçao semelhante à de outros locais. A confirmaçao para as três questoes apareceu com a composiçao evidenciada no presente estudo, em que é observado que o colesterol representa 32,11% do extrato obtido em hexano para esponja T. paulula (Tabela 2, Figura 1). Este resultado corrobora nao só as evidências de marcador quimiotaxonômico do colesterol para as esponjas da família Spongillidae em todo o mundo,^24,25 como também evidencia e fortalece a teoria de que o 24-etil-colesta-5,22-dieno-3β-ol seja o marcador para a família Metaniidae.

 

 

 

 

Para a esponja T. paulula, o 24-etil-colesta-5,22-dieno-3β-ol aparece como segundo mais abundante esterol, representando 20,32% do extrato obtido em hexano (Figura 1).

Outros três esteróis encontrados aparecem em concentraçoes relativamente elevadas: 24-metil-colesta-5,22-dieno-3β-ol (3,27%), 24-metil-colesta-5-eno-3β-ol (10,53%) e 24-etil-colesta-5-eno-3β-ol (8,16%). Isso evidencia a diferença no perfil aqui observado para os esteróis de T. paulula do relatado para as espécies da família Spongilidae: Ephydatia fluviatilis e Spongilla lacustres. Nessas, foram identificados 12 e 10 esteróis, respectivamente. No entanto, o colesterol representou mais de 65% dos extratos esteroidais.²⁴ O perfil aqui relatado assemelha-se ao relatado para as espécies da família Metaniidae.²⁶ Os esteróis aqui descritos para T. paulula também sao relatados como minoritários em espécies da família Lubormiiskidae que também apresentam o colesterol como majoritário.¹¹

 

CONCLUSAO

Os perfis relatados neste trabalho para os compostos voláteis e esteróis da esponja T. paulula contribuem grandemente para a quimiotaxonomia das esponjas, que embora se encontre muito distante de substituir as técnicas clássicas de taxonomia e morfologia pode fornecer valiosas informaçoes, inclusive já tendo sido usadas para sugerir revisoes em algumas classificaçoes.²⁷

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq, à CAPES e à FAPEAM pelo apoio financeiro à execuçao deste projeto.

 

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