JBCS

INTRODUÇAO

A catecol oxidase é uma metaloenzima binuclear de cobre da classe das oxido-redutases. Ela catalisa, especificamente, a oxidaçao do substrato catecol à correspondente orto-quinona com a reduçao do oxigênio à água (Figura 1).¹

 

 

A catecol oxidase é encontrada em diversos frutos e vegetais, tendo como funçao a proteçao destes contra patógenos e insetos. No ataque por agentes externos, a catecol oxidase atua na oxidaçao dos catecóis contidos na planta gerando as quinonas. A polimerizaçao destas quinonas forma o pigmento escuro chamado melanina.²

Eicken e colaboradores propuseram um mecanismo para a açao catalítica da catecol oxidase. A estrutura do sítio ativo desta metaloenzima é composta por um centro binuclear de íons Cu²⁺ com três resíduos de histidinas coordenadas a cada um destes centros bimetálicos. O ciclo inicia-se com a forma met da enzima, uma vez que essa é a forma nativa. Através do estudo de inibiçao com a feniltiouréia foi proposta uma ligaçao monodentada do substrato ao centro de CuB. A forma met reage com um mol de catecol e gera um mol da quinona correspondente. O centro de Cu²⁺ - Cu²⁺ sofre reduçao para a forma desoxi Cu⁺ - Cu⁺ possuindo uma molécula de solvente no CuA. Esta etapa é justificada pela formaçao de quantidades estequiométricas de quinona formadas na ausência de O₂. Em seguida a forma desoxi se liga simultaneamente ao oxigênio e a uma molécula de catecol. Quando o oxigênio se liga aos íons Cu⁺, é formada a ponte do tipo µ-η²:η² e ocorre a oxidaçao dos íons cuprosos a cúpricos (forma oxi). No complexo CO-O₂^2--catecol, dois elétrons sao transferidos do substrato para o peróxido, seguido da quebra da ligaçao O-O, com a perda de água e a geraçao da quinona. Com isso, a forma met é restabelecida e o ciclo pode ser reiniciado (Figura 2).³

 

 

A catecol oxidase pode apresentar potencial tecnológico através do seu uso como biosensor no diagnóstico médico. Isso porque catecolaminas hormonais como a dopamina, adrenalina e noradrenalina podem ser quantificadas com a reaçao de produçao de quinonas por ela promovida.⁴ No trabalho de Lupetti e colaboradores a enzima foi usada para determinaçao de dopamina em formulaçoes farmacêuticas.⁵ Outra possível aplicaçao é como agente oxidante de compostos poluentes em efluentes de despolpa do café, no caso, catecóis.⁶

Muitas vezes é praticamente impossível estudar teoricamente a própria enzima, o que acaba gerando a busca de moléculas que venham mimetizar a açao destas enzimas. Assim, um complexo denominado "análogo sintético" é aquele que reproduz as propriedades estruturais do sítio ativo da metaloenzima, tais como o ambiente de coordenaçao e a geometria. Já um complexo denominado "modelo sintético" é aquele capaz de reproduzir apenas algumas destas propriedades.⁷ A fim de mimetizar a atividade da catecol oxidase, diversos complexos análogos e modelos sintéticos têm sido sintetizados. Complexos mono e binucleares de Ni,^8,9 Co,⁹ Cu^10,11 e Mn^7,9,12-16 sao alguns exemplos. Os complexos de manganês têm mostrado boa atividade como miméticos da catecol oxidase.

Diversos estudos teóricos têm sido realizados a fim de estudar complexos com atividade da catecol oxidase. No trabalho de Martins e colaboradores estudou-se complexos binucleares de Cu²⁺ miméticos para catecol oxidase. Através da Teoria do Funcional de Densidade (do inglês DFT) foi possível entender porque o complexo com a piridina coordenada foi mais ativo que o complexo com imidazol coordenado. A grande participaçao da piridina no orbital LUMO fazia com que a carga adicional, proveniente da reduçao, fosse melhor acomodada.¹⁷

Panda e colaboradores sintetizaram diversos complexos de Cu²⁺ com ligantes NNO doadores com diferentes substituintes. Usando a DFT eles estudaram o mecanismo da oxidaçao do catecol desempenhado pelo seu modelo sintético e concluíram que a etapa determinante do ciclo era a transferência de hidrogênio intramolecular.¹⁸

Patra e colaboradores estudaram dois complexos binucleares: um de Cu²⁺ e um de Zn²⁺. Foram calculados, a partir da DFT, os valores da funçao Fukui (f_k⁺) para ambos os centros metálicos a fim de correlacionar com a atividade catalítica. Os resultados apontam que ambos os centros metálicos estao igualmente envolvidos na oxidaçao do catecol.¹⁹

Maiti e colaboradores estudaram complexos de Mn³⁺ com ligante do tipo base Schiff. Os cálculos teóricos foram usados para estimar as energias de interaçao e a importância das interaçoes nao covalentes no estado sólido.²⁰

Nos trabalhos de Mistri e colaboradores a Teoria do Funcional de Densidade Dependente do Tempo (do inglês TD-DFT) permitiu a atribuiçao das transiçoes eletrônicas observadas no espectro eletrônico de complexos de Cu²⁺ miméticos da catecol oxidase.^21-22

Complexos binucleares de Cu²⁺ com ligantes substituídos com ferrocenila foram estudados no trabalho de Emirik e colaboradores. A DFT foi utilizada para atribuir as contribuiçoes dos orbitais nas transiçoes eletrônicas e no espectro vibracional. Além disso, a análise dos orbitais de fronteira forneceram informaçoes úteis acerca da reatividade dos complexos e do ligante livre.²³

Neste trabalho foi realizado o estudo teórico de complexos binucleares de Mn²⁺ com o ligante 2-hidroxibenzilglicina (HBG) (Figura 3) e seus derivados substituídos com os grupos -OCH₃, -Br, -Cl e -NO₂.

 

 

Este ligante e derivados já sao utilizados na bioinorgânica para sintetizar miméticos de insulina e de haloperoxidases.^24,25 Além disso, complexos de Cu²⁺ com ligante semelhante já demonstraram boa atividade catalítica.¹⁷ A inserçao de substituintes com diferentes caráteres doador e aceptor de densidade eletrônica, como -OCH₃ e -NO₂, respectivamente, visa entender a influencia destes na atividade catalítica destes complexos.

Portanto, o objetivo deste trabalho é compreender melhor a estrutura, reatividade e o modo de açao destes possíveis miméticos a fim de auxiliar na síntese racional de modelos para enzima catecol oxidase.

 

METODOLOGIA

Os cálculos foram realizados através do uso do programa Gaussian 09, utilizando a Teoria do Funcional de Densidade (DFT) com o funcional de troca e correlaçao híbrido B3LYP. Os átomos mais leves como C, N, O e H foram tratados com a base D95V²⁶ e o pseudopotencial LANL2DZ, de Hay e Wadt,²⁷ foi utilizado para os átomos de manganês. Todos os complexos otimizados nao apresentaram frequências imaginárias, indicando que as mesmas se encontram em um mínimo de energia.

Todas as possíveis geometrias para os isômeros dos complexos foram avaliadas. O isômero 1 possui dois ligantes aquo em posiçoes equatoriais opostas e no isômero 2 estao em posiçoes axiais paralelas (Figura 4).

 

 

Todas as multiplicidades possíveis para os respectivos complexos, baseados na aproximaçao de que os dois átomos de manganês se comportam como centros octaédricos e considerando o possível acoplamento das configuraçoes dos dois átomos de manganês no complexo, foram avaliadas em cada um dos isômeros, totalizando três multiplicidades possíveis: singleto, tripleto e 11-eto.

Para a análise da ligaçao do substrato catecol com os respectivos complexos, foram calculadas as durezas absolutas (η) de cada um dos complexos, seguindo a metodologia descrita por Parr e Pearson conforme a equaçao 1, onde E sao as energias dos orbitais LUMO e HOMO.²⁸

Segundo Pearson, uma espécie dura tende a ligar-se com outra espécie dura gerando um complexo mais estável. No trabalho de Balderas-Hernández e colaboradores,²⁹ comprovou-se a correlaçao entre a dureza absoluta e as constantes de formaçao do complexo, através de um estudo teórico-experimental do azul de timol e dos íons metálicos Hg²⁺, Pb²⁺ e Cd²⁺, constatando a eficácia deste postulado de Pearson.

As contribuiçoes dos orbitais atômicos na composiçao dos orbitais de fronteira foram avaliadas com o objetivo de se estabelecer correlaçoes entre os parâmetros estruturais dos respectivos complexos, considerando o mecanismo proposto.

 

RESULTADOS E DISCUSSAO

As multiplicidades avaliadas para os dois isômeros foram singleto, tripleto e 11-eto. Tendo em vista que os ambientes de coordenaçao dos dois íons de manganês sao iguais, estas três sao as únicas multiplicidades possíveis. Se ambos os íons estao em um campo fraco com spins desemparelhados temos a multiplicidade 11-eto, se os spins estiverem emparelhados temos a multiplicidade singleto e, por fim, se ambos os íons estiverem em um campo forte teremos a multiplicidade tripleto.

As energias das estruturas otimizadas dos dois isômeros, obtidas para as possíveis multiplicidades, sao apresentadas na Tabela 1:

 

 

No estudo dos isômeros 1 (com a configuraçao 11-eto) e o isômero 2 (com a configuraçao tripleto) foi observada uma peculiaridade, que nos fez desconsiderar estes dois sistemas em nosso estudo. Nestes dois casos, usando a mesma metodologia utilizada na otimizaçao dos demais complexos estudados, nao houve convergência para estruturas de mínimo ou as estruturas dos complexos originais eram literalmente fragmentadas. Por conta disto, estes dois sistemas nao foram considerados em nosso estudo.

Analisando os valores das energias relativas dos respectivos isômeros, apresentados na Tabela 1, é possível constatar que a estrutura do isômero 2, com a multiplicidade 11-eto, é a mais estável dentre as demais multiplicidades possíveis e obtidas. A diferença na estabilidade apresentada pelos dois isômeros pode ser explicada em termos de repulsao eletrônica entre os grupos fenolato, amina e carboxilato nestes. No isômero 1 os grupos fenolato, amina e carboxilato de cada íon Mn²⁺, estao mais próximos uns dos outros e por isso experimentam uma maior repulsao. Já no isômero 2 esta repulsao é minimizada devido a posiçao dos ligantes aquo, fazendo com que aqueles grupos de maior volume ocupem posiçoes equatoriais no complexo, resultando em um maior afastamento e, portanto, uma menor repulsao (Figura 5).

 

Com o estudo das possíveis geometrias dos complexos realizado, tendo selecionado a estrutura mais estável e tomando esta como padrao, foi realizada a otimizaçao de geometria dos demais complexos estudados neste trabalho, envolvendo os substituintes -OCH₃, -Br, -Cl e -NO₂. Esta etapa teve como objetivo avaliar os efeitos eletrônicos introduzidos por estes grupos, e as respectivas influências na reatividade de cada complexo. A Figura 6 apresenta a representaçao estrutural genérica dos complexos substituídos estudados:

 

 

A partir das energias dos orbitais de fronteira calculadas, foi obtido o valor da dureza absoluta para os complexos substituídos, seguindo a metodologia proposta por Parr e Pearson.²⁸ Da mesma forma, foi obtida a dureza absoluta do substrato catecol para comparaçao com os valores dos complexos. Esses valores estao apresentados na Tabela 2.

 

 

O caráter doador de densidade eletrônica do grupo -OCH₃ no ligante resultou em um complexo com uma menor dureza absoluta. Os complexos com os substituintes -H, -Cl, -Br e -NO₂ apresentaram valores de dureza absoluta próximos entre si. Estes valores sao maiores quando comparados com o complexo com o grupo -OCH₃. Desta forma, os resultados obtidos apontam na direçao de que os complexos com os substituintes -H, -Cl, -Br e -NO₂ deverao ligar-se mais fortemente com o substrato catecol que apresentou um valor de dureza absoluta de 2,87.

No mecanismo proposto para a catecol oxidase por Eicken e colaboradores³ o substrato se liga ao íon metálico de maneira monodentada. O substrato é oxidado e o íon metálico é reduzido pela transferência de dois elétrons. Deste modo, os complexos em estudo serao reduzidos, o que faz com que a descriçao do LUMO seja um importante alvo de estudo visando correlacionar esta reduçao com alguma propriedade inerente a este orbital. A Figura 7 apresenta os diagramas de contorno dos orbitais LUMO para os complexos.

 

 

O perfil do LUMO dos complexos com os substituintes -OCH₃, -H, -Br e -Cl mostra grande participaçao dos grupos H₂O e participaçao menor dos anéis aromáticos, dos nitrogênios e carboxilatos. Já o complexo com o grupo -NO₂ apresenta o LUMO com participaçao quase que exclusivamente dos anéis fenólicos. Os íons metálicos apresentaram pequena participaçao relativa em todos os complexos substituídos. Todos os complexos apresentaram participaçao do anel fenólico com os substituintes, indicando que uma mudança nestes substituintes altera os aspectos eletrônicos no LUMO do complexo formado.

Considerando a particularidade das metaloenzimas de possuírem um metal, foi realizada a análise dos percentuais de participaçao dos íons metálicos, sobretudo dos orbitais d, os quais devem ser os principais responsáveis pela atividade catalítica com base no mecanismo anteriormente proposto. Os valores dos percentuais de participaçao dos íons Mn²⁺ estao descritos na Tabela 3.

 

 

Os valores percentuais demonstram que o complexo com o grupo -NO₂ apresenta maior contribuiçao no LUMO dos íons metálicos, o que favorece sua ligaçao ao substrato conforme mecanismo. Além disso, esta participaçao é principalmente feita pelos orbitais d dos íons metálicos, os quais sao cruciais na atividade catalítica. O valor do complexo com X=H foi o segundo maior, apresentando grande participaçao dos orbitais d metálicos (cerca de 11%), frente ao total de 17,8%. O complexo com X=Br apresentou o terceiro maior valor percentual. Apesar disso, a contribuiçao dos orbitais d dos metais nao foi tao expressiva, representando apenas 4,5%. Por fim, os grupos -OCH₃ e -Cl apresentaram baixíssimos percentuais referentes ao orbital d, e os menores na composiçao total.

O maior percentual dos orbitais d para o complexo com o grupo -NO₂ deve ser consequência do forte caráter π-aceptor deste, retirando a densidade eletrônica do anel aromático. Com isso os íons metálicos devem ficar com uma menor densidade eletrônica e, portanto, a coordenaçao do substrato é favorecida. Já o substituinte -OCH₃ possui caráter π-doador, doando densidade eletrônica para o anel aromático. Daí o menor percentual de participaçao no LUMO, referente aos orbitais d do metal. O -H na posiçao para ao fenolato no complexo é apenas σ-doador nao apresentando nenhum caráter π.

Por fim, os grupos -Cl e -Br que sao π-doadores e mais eletronegativos que o carbono do anel aromático. Assim, estes grupos recebem densidade eletrônica pela ligaçao σ e fazem a retrodoaçao pela ligaçao π ao anel aromático. O efeito da retrodoaçao π nesses dois, reflete os resultados obtidos e apresentados na Tabela 3. O grupo -Br nao possui uma capacidade de retrodoaçao π tao pronunciada quanto o -Cl, porque esta implica na superposiçao do orbital 4p do -Br com um 2p do carbono. Uma vez que esses orbitais possuem tamanhos diferentes, o efeito de retrodoaçao nao será tao efetivo. Já com o -Cl há a superposiçao de um orbital 3p do -Cl com o 2p do carbono, a qual será mais favorável do que o anterior, refletindo na maior efetividade da ligaçao π retrodoativa.

Esse efeito de retrodoaçao π estabiliza o anel, de forma que o anel aromático com o grupo -Cl possui maior densidade eletrônica que o anel com o grupo -Br. Daí o resultado apresentado na Tabela 3 indicando uma maior participaçao dos orbitais d do íon metálico no complexo com -Br, quando comparado com o complexo com o grupo -Cl.

 

CONCLUSAO

Através dos cálculos DFT foi possível determinar o isômero 2 como sendo o mais estável dentre as estruturas e multiplicidades obtidas. Esta maior estabilidade estrutural pode ser atribuída a menor repulsao eletrônica no isômero 2 que possui os ligantes HBG em posiçoes equatoriais no complexo resultando em uma maior distância entre os grupos mais volumosos.

Com o valor da dureza absoluta calculado para cada complexo e para o substrato catecol, concluiu-se que os complexos com os substituintes -Br, -Cl, -H e -NO₂ apresentaram, respectivamente, uma ligaçao mais forte com o substrato catecol. Por outro lado, o complexo com -OCH₃ deve ligar-se mais fracamente, quando comparado com os demais, com esse substrato.

A análise das representaçoes gráficas do orbital LUMO de cada complexo substituído possibilitou confirmar que a alteraçao da natureza eletrônica do substituinte na posiçao para do fenolato influi no aspecto eletrônico deste orbital no complexo.

Os complexos com os substituintes -NO₂, -H e -Br, apresentaram nesta ordem os maiores percentuais de participaçao dos orbitais d dos íons metálicos no LUMO. Os complexos com -OCH₃ e -Cl apresentaram baixíssimos valores de participaçao para os orbitais d metálicos. Esses valores parecem estar correlacionados com o caráter π-doador e π-aceptor dos substituintes.

Tendo em vista a ligaçao mais forte com o catecol e os maiores percentuais de participaçao dos orbitais d do metal no LUMO, os complexos mais promissores a desempenhar a possível atividade catalítica da catecol oxidase sao os com os substituintes -NO₂ e -H seguidos pelo -Br.

 

AGRADECIMENTOS

Ao CNPQ e a FAPERJ pelo apoio financeiro.

 

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