JBCS

INTRODUÇAO

O estudo de características e aplicaçoes de estruturas em escala nanométrica tem apresentado um grande interesse a pesquisadores das áreas médica (humana e animal), ambiental e agrícola. Estas estruturas nanométricas, preparadas de diferentes formas, permitiram o avanço da nanotecnologia. Dentre essas estruturas, destacam-se os nanocarreadores, que permitem melhorar a biodisponibilidade de muitos compostos bioativos, como, por exemplo, o aumento da solubilidade aquosa, melhorando assim processos de absorçao e distribuiçao tecidual (farmacocinética) e também a diminuiçao de possíveis efeitos tóxicos (reduçao da toxidade local e sistêmica).¹ O desenvolvimento da nanotecnologia permitirá seu uso na produçao animal em forma de monitoramento ou mesmo de aplicaçao direta de produtos nanotecnológicos na saúde, na alimentaçao, controle de parasitas, conforto térmico e ambiental desses animais.²

A nanotecnologia apresenta grande potencial para as pesquisas, possibilitando o desenvolvimento de novos produtos destinados à melhoria da sanidade e saúde animal, o que propicia produtos derivados de animais com maior qualidade e segurança, além de possibilitar potenciais aplicaçoes na área da medicina veterinária, que incluem sistemas de diagnóstico e tratamento de doenças, novas ferramentas para o melhoramento molecular e celular, modificaçao de resíduos animais, detecçao de patógenos, isolamento de toxinas, vetores para o transporte de fármacos,³ entre outros. Os avanços da nanotecnologia trazem possíveis consequências econômicas, sociais, ambientais e políticas.^4-6 A aplicaçao de nanotecnologia na área veterinária pode auxiliar no desenvolvimento de uma nova geraçao de produtos, como vacinas e métodos de aplicaçao de produtos veterinários de forma a aumentar a eficácia destes, reduzir possíveis efeitos tóxicos nos animais, bem como reduzir possível contaminaçao ambiental que o uso continuado destes produtos possa causar.

Algumas nanoformulaçoes têm sido empregadas de forma bem-sucedida para a entrega de fármacos no combate de fungos, protozoários e doenças bacterianas como a candidíase, leishmaniose, salmonelose, brucelose e tuberculose em testes com animais,⁷ demonstrando o grande potencial do uso de nanocarreadores como sistemas de entrega de fármacos e vacinas para o combate de doenças em animais.

A Ivermectina e o Metopreno sao amplamente utilizados no controle de endo e ectoparasitas em animais de produçao e domésticos. A Ivermectina (IVM) é um composto pertencente ao grupo das lactonas macrocíclicas que foi sintetizada pela primeira vez na década de 1970, no Japao, a partir de fungos Streptomyces avermitilis, sendo assim descoberta uma nova classe, as avermectinas.⁸ Seu modo de açao contra os parasitas ocorre por meio da estimulaçao da liberaçao do neurotransmissor inibidor GABA (ácido gama-aminobutírico) na fenda sináptica entre interneurônios do cordao central e neurônios motores,^9,10 sendo que quanto maior a liberaçao de GABA, maior será a hiperpolarizaçao do potencial de repouso normal das células pós-sinápticas, tornando difícil a neurotransmissao dos estímulos para os músculos periféricos.¹¹ Desta forma, sob a influência de uma pequena quantidade das avermectinas, os parasitas ficam paralisados, sendo posteriormente expelidos pelo organismo.⁸ O Metopreno (MTP) é um regulador de crescimento que possui a capacidade de combater uma variedade de espécies de insetos, incluindo Diptera, Lepidoptera, Siphonaptera e Coleoptera, o que possibilita ao metopreno uma grande capacidade de controlar uma variedade de pragas.¹² Reguladores de crescimento de insetos provocam a perturbaçao nos processos enzimáticos regulados por hormônios que sao relativamente específicos para a fisiologia dos insetos.^13,14 O Metapreno possui uma rápida degradaçao na água e em presença de luz, limitando assim em alguns casos o seu uso. Porém, nao provoca bioacumulaçao em peixes e nao persiste no ambiente, sofrendo rápida degradaçao e metabolismo de plantas, animais, micro-organismos aquáticos e de solo.¹⁵

Devido às características dos dois ativos, o desenvolvimento de produtos e processos mais eficientes destinados ao combate e controle dos efeitos de endo e ectoparasitas em veterinária tem se mostrado necessário. Como possibilidades para aumento da eficácia e estabilidade de fármacos como ivermectina e metopreno, destacam-se os sistemas carreadores lipídicos, no qual se destacam a nanopartícula lipídica sólida e o carreador lipídico nanoestruturado.^16-20

As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) sao sistemas constituídos por lipídeos sólidos sob temperatura ambiente e corporal;¹⁶ possuem grande importância por apresentarem vantagens como boa estabilidade física, química e biológica, excelente tolerabilidade, boa biodegradaçao, alta disponibilidade, possibilita a liberaçao sustentada por possuir uma matriz sólida, permite a prevençao da degradaçao química ou oxidativa do composto encapsulado, além da possibilidade da metabolizaçao de sua matriz lipídica por diversos organismos.^16,19-23 Sua matriz é composta por lipídeos sólidos em temperatura ambiente, tensoativos e água.

Os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) foram desenvolvidos como uma segunda geraçao das NLS, com o objetivo de melhorar a eficiência de encapsulaçao e o tempo de retençao do fármaco durante o período de armazenamento.¹⁸ Diferentemente das NLS que sao produzidas a partir de lipídios sólidos, os CLN sao compostos de uma matriz lipídica sólida encapsulando compartimentos de lipídios líquidos. Uma das vantagens dos CLN em relaçao às NLS deve-se ao fato de que nos CLN o fármaco nao é expulso do interior das nanopartículas, como ocorre nas NLS.^19,20

Este trabalho tem como principal objetivo preparar e caracterizar sistemas carreadores lipídicos para dois ativos utilizados em aplicaçoes veterinárias, a Ivermectina e o Metopreno, visando o desenvolvimento de formas alternativas para o uso destes para administraçao por via tópica (pour on). Neste contexto, a nanotecnologia tem um grande potencial para auxiliar na melhora da qualidade de vida animal e no desenvolvimento de soluçoes para reduçao de prejuízos econômicos para a pecuária, bem como para a minimizaçao de possíveis impactos ambientais.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais

Ivermectina - Pestanal^®, Metopreno - Pestanal^®, Acido Oleico - Sigma^®, Gliceril Tripalmitato (grau de pureza 85%) - Sigma^®, Poli (Alcool Vinílico) - (PVA) - Sigma^®, Clorofórmio (grau espectroscópico analítico) - Merck^®, Acetonitrila (grau HPLC) - JT Baker^®, Dispositivos de ultrafiltraçao de celulose regenerada de 30 kDa- Millipore^®.

Preparo de nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados

As NLS e CLN foram preparadas utilizando o processo de emulsao/evaporaçao de solvente, adaptado de Vitorino et al.²⁴ Inicialmente, foi preparada uma soluçao de 30 mL contendo água deionizada com 1,25% de poli (álcool vinílico), polímero semicristalino utilizado como tensoativo, a qual foi mantida sob agitaçao. Em seguida, 250 mg de tripalmitina foram dissolvidos em 5 mL de clorofórmio. Nesta mesma fase orgânica foram adicionados 10 mg de IVM ou 10 mg de MTP, e entao a fase orgânica foi gotejada com o auxílio de uma ponteira na fase aquosa. Esta soluçao foi entao submetida à sonicaçao durante 5 minutos em sonicador com 40 W de potência resultando em uma pré-emulsao. Posteriormente, essa pré emulsao foi levada a um ultraturrax, onde foi agitada vigorosamente por 7 minutos a uma velocidade de 14000 rpm. Após a agitaçao foi realizado o processo de evaporaçao do solvente orgânico, o qual foi eliminado com o auxílio de um evaporador rotativo, e a emulsao foi concentrada até o volume final de 10 mL, obtendo-se NLS com a concentraçao final de 1 mg mL^-1 de IVM ou MTP.

Para o preparo de CLN, procedeu-se da mesma forma como descrito para NLS, porém, em vez de utilizar 250 mg de tripalmitina, utilizou-se 125 mg de tripalmitina e 125 mg de ácido oleico.

Medidas de caracterizaçao e estabilidade das formulaçoes

Medida de diâmetro médio de partículas por espectroscopia de correlaçao de fótons

A avaliaçao da distribuiçao de tamanho das nanopartículas foi realizada diluindo-se as suspensoes de partículas com água deionizada (1:1000 v:v) e empregando um analisador de partículas ZetaSizer Nano ZS 90 (Malvern) sob um ângulo fixo de 90º e temperatura de 25 ºC. Cada resultado foi expresso como medida de três determinaçoes, sendo aplicada análise estatística de variância (ANOVA) com o teste de Tukey-Kramer através do software GraphPad Prism v.6^®.^25-27

Potencial Zeta

A carga das partículas foi avaliada através da determinaçao de potencial zeta, utilizando-se um analisador de potencial zeta Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern). As avaliaçoes foram efetuadas diluindo-se as suspensoes em água deionizada (1:1000 v:v) e os resultados foram expressos como médias de três determinaçoes.

Estabilidade lipídica (pH)

Monitorar o pH de suspensoes coloidais em funçao do tempo traz informaçoes relevantes para indicar a estabilidade química dos componentes da formulaçao. Variaçoes no pH das formulaçoes podem indicar alteraçoes nestes componentes que podem ser devido à hidrólise química de grupos funcionais presentes nos componentes das formulaçoes.²⁸ O pH das suspensoes de nanopartículas lipídicas sólidas foi medido no decorrer de 120 dias e utilizou para isso um medidor de pH (Jenway^®, modelo 3510) previamente calibrado com soluçoes tampao em pH 7,0 e 4,0.

Rastreamento de nanopartículas

Para as análises de rastreamento de nanopartículas, os dados foram coletados por meio de uma célula NanoSight LM 10 (laser verde, 532 nm) e uma câmera sCMOS usando software NanoSight (versao 2.3). Para evitar a contaminaçao das amostras, mediçoes da água deionizada foram realizadas. As suspensoes de nanopartículas foram diluídas 30000 vezes, sendo feitas análises em triplicata para cada amostra. Para garantir que diferentes partículas fossem analisadas, para cada réplica, 1 mL de suspensao da amostra foi injetado na célula volumétrica, com o intuito de deslocar o conteúdo medido anteriormente. Cada repetiçao foi constituída de cinco mediçoes com aproximadamente 2000 partículas contadas em cada análise. Foi obtida como resultado final a distribuiçao de tamanho das partículas em funçao da concentraçao, os quais foram expressos com o desvio padrao.²⁹

Microscopia Eletrônica de Transmissao

A morfologia das NLS e CLN foi verificada por Microscopia Eletrônica de Transmissao (Zeiss-LEO 906) conforme o método previamente descrito.³⁰ Uma pequena alíquota da suspensao de nanopartículas foi colocada em grades de cobre de 200 malhas por 15 min. Uma soluçao de acetato de uranila à 2% foi utilizada como contraste, sendo esta gotejada sobre a grades e posterior remoçao do excesso utilizando um papel. Após o preparo das amostras, as mesmas foram analisadas no microscópio a uma voltagem de 80 kV.

Eficiência de retençao dos ativos nas formulaçoes

A quantidade do bioativo retido nas nanopartículas foi determinada pelo método de ultrafiltraçao/centrifugaçao, que se baseia em submeter a suspensao de nanopartículas à centrifugaçao em dispositivos de ultrafiltraçao constituídos de celulose regenerada de 10 kDa (Microcon - Millipore^®) e quantificar o ultrafiltrado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).^28,31,32

A eficiência de retençao (% ER) foi determinada através da equaçao (1):

em que A corresponde a quantidade do ativo encapsulada nas partículas e B a quantidade total inicial de ativo adicionada às formulaçoes.

Ensaio de liberaçao in vitro

Com o propósito de verificar o perfil de liberaçao dos ativos pelas nanopartículas foi realizado ensaio de cinética de liberaçao. A liberaçao dos fármacos (IVM e MTP) através das nanopartículas foi modificado baseando-se no método descrito por Asrar et al.³³ Os ensaios foram realizados em condiçao de diluiçao "sink".³⁴ Sendo assim, 0,7 mL da suspensao de nanopartículas contendo IVM, de solubilidade em meio aquoso de 4 mg L^-1, foi diluído em 700 mL de agua deionizada, enquanto 0,3 mL da suspensao de nanopartículas contendo MTP, de solubilidade em meio aquoso de 0,51 mg L^-1, foi diluído em 857 mL de água deionizada. Alíquotas de 10 mL destas misturas foram entao colocadas em tubos Falcon fechados e submetidas à agitaçao em shaker (150 rpm) em temperatura ambiente. Em períodos de 15, 30, 45 e 60 min, ao longo de 180 minutos, um tubo era removido do shaker, submetido à centrifugaçao para a sedimentaçao das nanopartículas, e o sobrenadante era filtrado através de um filtro de 0,45 µm e quantificado por CLAE. Os valores de área obtidos foram convertidos em concentraçao de ativo em µg mL^-1, utilizando como padrao uma soluçao dos ativos livres. As medidas foram realizadas em triplicata.

Ensaio de cito e genotoxicidade

Citotoxicidade - Teste de reduçao do tetrazolium MTT (Método colorimétrico)

Os testes de viabilidade celular foram realizados em células da linhagem 3T3 (fibroblastos de camundongos Balb-c 3T3) e V79 (fibroblastos pulmonares de Hamster), mantidas em cultura contínua em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/sulfato de estreptomicina, pH 7,4, 37 ºC, sob atmosfera úmida com 5% de CO₂. O plaqueamento foi realizado inoculando-se 1x10⁴ células por poço em placas de 96 poços, incubadas por 24 horas até a aderência. Após a aderência as células foram expostas durante 24 horas às formulaçoes de nanopartículas incorporadas ou nao com ativos em concentraçoes variando na faixa de 0 a 50 µg mL^-1. A viabilidade celular foi determinada através do teste de reduçao do 3(4-5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólico (MTT). As células foram incubadas com MTT (0,5 mg mL^-1) durante 3 horas a 37 ºC. O número de células viáveis foi determinado através da mediçao da quantidade de MTT convertido a formazan (composto púrpura) pelas desidrogenases mitocondriais. Os cristais de formazan formados foram dissolvidos em DMSO à temperatura ambiente. A absorbância da soluçao em cada cavidade foi medida em leitor de placas (Labsystems Multiskan MS) em 570 nm e calculou-se as porcentagens de células viáveis.^35,36

Ensaio de aberraçao cromossômica Allium cepa

O ensaio de genotoxicidade foi realizado utilizando-se sementes de Allium cepa, no qual 30 sementes foram colocadas para germinar em placa de Petri contendo água destilada. Ao atingirem o tamanho entre 15 e 20 mm foram utilizadas para o teste. As raízes foram retiradas e expostas por 24 h às formulaçoes de nanopartículas sem e contendo os fármacos, sem serem diluídas. Em seguida, foram fixadas em fixador de Carnoy durante 24 h. Após a fixaçao, foram removidas da soluçao fixadora e lavadas por três vezes com água destilada para remoçao do excesso de fixador. Posteriormente, foram submetidas à hidrólise ácida a 60 °C, em que as raízes foram colocadas em banho maria a 60 °C durante 9 minutos em uma soluçao de HCl 1 mol L^-1. Após esta etapa, as raízes foram retiradas do banho e lavadas com água destilada por aproximadamente 5 minutos cada uma, e colocadas em reativo de Schiff durante 2 h para coloraçao. Após esse tempo, as raízes passaram por 3 banhos de água destilada até ser retirado todo o excesso do corante. Cortou-se a regiao meristemática das raízes que foram colocadas em lâmina com uma gota de Carmim Acético 2% (corante citoplasmático) e, em seguida, colocou-se a lamínula e executou-se suavemente o esmagamento para espalhar as células. Após o preparo das lâminas realizou-se a observaçao ao microscópio com a contagem e classificaçao das células.

Para este estudo utilizou-se amostras dos ativos (IVM e MTP) e dos nanocarreadores (NLS e CLN) incorporadas ou nao com ativos nas concentraçoes de 1 mg mL^-1. Como controle, utilizou-se água destilada. O teste de genotoxicidade foi realizado em triplicata, sendo aplicada análise estatística de variância (ANOVA) com o teste de Tukey-Kramer através do software GraphPad Prism v.6^®.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Caracterizaçao dos sistemas lipídicos

As análises de distribuiçao de tamanho para as nanopartículas mostraram o perfil monomodal das mesmas, ou seja, a existência de apenas uma populaçao de nanopartículas, tanto na análise de NLS como de CLN. Isto é de grande importância, pois se busca em formulaçoes para liberaçao modificada uma maior homogeneidade do sistema, para que ocorram menores interferências no processo de liberaçao dos ativos.^12,25,37

A Figura 1 retrata a distribuiçao de tamanho de NLS na ausência e na presença dos fármacos IVM e MTP no tempo inicial de estabilidade (0 dias), no tempo intermediário (60 dias) e no tempo final (120 dias). Observa-se (Figura 1a) que nao houve alteraçao significativa de tamanho durante o período de estocagem. Este perfil de distribuiçao foi semelhante para as NLS contendo MTP (Figura 1c), no entanto, para o tempo de 120 dias pode-se observar o aparecimento de uma populaçao com tamanho ao redor de 1000 nm, podendo indicar a presença de algum fenômeno de agregaçao. Para as NLS contendo IVM (Figura 1b) pode-se observar uma pequena alteraçao no perfil de distribuiçao de tamanho da formulaçao. Pode-se observar que durante o tempo de estocagem ocorreu variaçao na intensidade do tamanho da partícula analisada, o que sugere uma possível formaçao de agregados.

Figura 1. Distribuiçao de tamanho de NLS para os tempos 0, 60 e 120 dias na ausência de fármacos (a), contendo IVM (b) e contendo MTP (c)

A Figura 2a apresenta a variaçao do tamanho médio das formulaçoes de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) com e sem os ativos IVM e MTP.

Figura 2. a) Tamanho médio das NLS com e sem IVM e MTP em funçao do tempo. As medidas foram realizadas em triplicada (n=3). b) Tamanho médio dos CLN com e sem IVM e MTP em funçao do tempo. Utilizou-se o teste ANOVA para verificaçao de alteraçoes significativas, sendo considerada uma significância de p<0,05 para as diferenças estatísticas observadas entre os grupos, onde a* representa variaçoes nao significativas entre os grupos em funçao do tempo em relaçao ao controle no tempo zero; b* representa variaçoes significativas entre os grupos em funçao do tempo em relaçao ao controle no tempo zero

Como observado nas Figuras 1 e 2a, as formulaçoes de NLS sem os ativos e com os ativos apresentaram estabilidade durante o período estudado, apesar de sofrerem alteraçoes significativas em seu tamanho médio: na formulaçao de NLS com IVM ocorreram alteraçoes significativas em seu tamanho no período de estudo, sendo observadas estas alteraçoes em todo o decorrer de estocagem. Este aumento no tamanho pode estar associado à possível formaçao de agregados. As formulaçoes de NLS contendo MTP apresentaram alteraçoes significativas a partir de 30 dias de estocagem. De modo geral, o diâmetro das formulaçoes de NLS, NLS com IVM e NLS com MTP foi de 285,6 nm; 291,3 nm e 277,9 nm, respectivamente.

A Figura 2b apresenta a variaçao do tamanho médio das formulaçoes de carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) com e sem os ativos ivermectina (IVM) e metopreno (MTP). Como observado na Figura 2b, as formulaçoes de CLN sem os ativos nao apresentaram alteraçoes significativas durante o período de estocagem, exceto no tempo de 60 dias. As formulaçoes contendo MTP também nao apresentaram alteraçoes significativas durante o tempo de estudo. As formulaçoes de CLN com IVM apresentaram alteraçoes significativas de tamanho durante o período de estocagem. De modo geral, as formulaçoes apresentaram tamanho médio geral de 257,5; 245,9 e 258,3 nm para as formulaçoes de CLN, CLN com IVM e CLN com MTP, respectivamente.

Observa-se que tanto as formulaçoes de NLS como as de CLN apresentaram no tempo inicial um tamanho médio abaixo de 300 nm, destacando a eficiência do método de preparo das partículas. Pode-se observar também que as formulaçoes de NLS apresentaram maior tamanho quando comparadas às formulaçoes de CLN. Isso pode ter ocorrido pelo fato de que os CLN sao formados por lipídios sólidos e líquidos, enquanto as NLS sao formadas apenas por lipídio sólido. Lipídios com ponto de fusao mais elevados podem originar um aumento no tamanho das nanopartículas.³⁸ Como o ácido oleico apresenta ponto de fusao menor que a tripalmitina e os CLN apresentam 50% da massa de tripalmitina presente nas NLS, as formulaçoes de CLN apresentam menores tamanhos durante o período de estocagem, como observa-se nas Figuras 1 e 2b.

A polidispersao também foi analisada durante o período de estudo. A polidispersao representa a variabilidade do tamanho da partícula. Nas Figuras 3 estao representadas as variaçoes de polidispersao das formulaçoes de NLS e CLN com e sem IVM e MTP.

Figura 3. Polidispersao média de a) NLS e b) CLN com e sem IVM e MTP em funçao do tempo

Observa-se nas Figuras 3 a e b a ocorrência de variaçoes na polidispersao em funçao do tempo. Estas variaçoes podem estar relacionadas à reorganizaçao na distribuiçao de tamanho das partículas durante o período de armazenagem, porém, todas as formulaçoes apresentaram valores abaixo de 0,2, o que evidencia boa estabilidade das formulaçoes. A polidispersao média das formulaçoes de NLS, NLS com IVM, NLS com MTP, CLN, CLN com IVM e CLN com MTP foi 0,130±0,045; 0,164±0,059; 0,119±0,048; 0,100±0,06; 0,097±0,061 e 0,109±0,048, respectivamente. Estes resultados demonstram que as formulaçoes de nanopartículas na ausência ou presença dos fármacos IVM e MTP apresentam boa estabilidade.

Assim como o tamanho, a polidispersao sofre aumento quando comparamos os valores das formulaçoes de CLN com as de NLS. Um acréscimo de 5-10% no volume lipídico gera partículas de maior tamanho e uma distribuiçao mais ampla do tamanho das partículas, ou seja, um acréscimo no valor do índice de polidispersao.³⁹

Rastreamento de nanopartículas

A técnica de rastreamento de nanopartículas foi utilizada para caracterizar as suspensoes de NLS e CLN. As análises de distribuiçao de tamanho das partículas sao apresentadas na Figura 4. No tempo inicial (0 dias), observa-se que para as NLS (Figura 4) na ausência dos ativos foi obtido um diâmetro hidrodinâmico de 203,7±65,5 nm e uma concentraçao de 2,49±0,12 x 10¹³ partículas por mL. Para as NLS contendo os ativos IVM e MTP foram obtidos diâmetro médios de 237,3±83,6 nm e 185,1±98,3 nm, e concentraçao de 4,32±0,3 x 10¹³ e 7,47±1,14 x 10¹³ partículas por mL, respectivamente. Para os CLN na ausência dos ativos, o diâmetro médio apresentado foi de 191,1±52,2 nm e concentraçao de 5,43±0,06 x 10¹³ partículas por mL. Para os CLN com os ativos IVM e MTP o diâmetro médio apresentado foi de 196,5±87,1 nm e 196,3±62,3 nm, e a concentraçao foi de 4,35±0,3 x10¹³ e 4,53±0,09 x 10¹³ partículas por mL, respectivamente.

Figura 4. Distribuiçao de tamanho das partículas em funçao da concentraçao no tempo de 0 dias. A) NLS; B) NLS contendo IVM; C) NLS contendo MTP; D) CLN; E) CLN contendo IVM; F) CLN contendo MTP. As análises foram realizadas a 25 ºC. A linha vermelha é correspondente ao desvio padrao das análises

Para o tempo de 120 dias (dados nao mostrados), para as NLS na ausência dos ativos foi obtido um diâmetro médio de 258,2±170,6 nm e concentraçao de 5,31±3,18 x10¹³ partículas por mL, respectivamente. Para as NLS contendo os ativos IVM e MTP, foram obtidos diâmetro médios de 193,7±63,4 nm e 188,6±76,3 nm, e concentraçao de 2,10±0,15 x 10¹³ e 2,35±0,09 x 10¹³ partículas por mL. Para os CLN na ausência dos ativos o diâmetro médio encontrado foi de 193,1±78,2 nm e concentraçao de 1,68±0,05 x10¹³ partículas por mL. Para os CLN com os ativos IVM e MTP, o diâmetro médio encontrado foi de 167,8±75,9 nm e 222,3±97,7 nm e concentraçao de 4,32±0,6 x 10¹³ e 3,18±0,24 x 10¹³ partículas por mL, respectivamente.

Como se pode observar (Figura 2 e Figura 4), por ambas as técnicas (espectroscopia de correlaçao de fótons e rastreamento de partículas) foram obtidos valores semelhantes para a distribuiçao de tamanho. Eventuais diferenças podem ser devido à forma de realizaçao de análises, em especial em relaçao a questao de diluiçao das amostras. No NTA as amostras sao diluídas em 30.000 vezes enquanto na ECF a diluiçao é realizada em 1.000 vezes. Tais diferenças em diluiçoes podem fazer com que eventuais agregados sejam desfeitos e isso faz com que em geral os valores de NTA sejam menores que os observados por ECF.

Potencial Zeta

A Figura 5 (a e b) apresenta os valores do potencial zeta para as formulaçoes de NLS e CLN com e sem os fármacos. As formulaçoes apresentaram valores médios de potencial zeta de -18,1; -14,7; -15,6; -18,8; -20,9; e -20,7mV para NLS, NLS com IVM, NLS com MTP, CLN, CLN com IVM e CLN com MTP, respectivamente.

Figura 5. Potencial zeta de a) NLS e b) CLN com e sem IVM e MTP em funçao do tempo de 120 dias

No preparo das formulaçoes, utilizou-se álcool polivinílico como tensoativo e este, por sua vez, possui uma açao estabilizante, ou seja, adsorve sobre a superfície das partículas criando uma camada estabilizadora por efeito estérico, a qual leva a uma reduçao do potencial zeta medido.^40,41 Desta forma, o principal fator de estabilizaçao destas partículas é determinado pela presença do tensoativo e nao pelo valor do potencial zeta. Assim, os valores de potencial zeta nessas formulaçoes nao indicam, necessariamente, uma baixa estabilidade. Mesmo com o efeito estabilizante do PVA, pode-se observar que, em funçao do tempo para os dois carreadores (contendo ou nao os ativos), nao foram observadas grandes alteraçoes nos valores de potencial zeta, sendo os valores entre -14 mV e -25 mV.

pH

O pH foi um dos parâmetros investigados para avaliar a estabilidade das NLS e dos CLN na presença e ausência dos fármacos. Na Figura 6 está representada as variaçoes de pH das formulaçoes com e sem os ativos IVM e MTP. Pode-se observar que ocorreram pequenas variaçoes de pH nas formulaçoes durante o tempo de armazenagem de 120 dias. Constata-se também que as formulaçoes de NLS apresentaram uma tendência de aumento no valor do pH enquanto as formulaçoes de CLN apresentaram uma tendência de diminuir o valor do pH. Estas alteraçoes podem estar relacionadas à composiçao da fase lipídica de cada formulaçao e pode indicar uma possível degradaçao dos fármacos ou dos componentes das formulaçoes devido à hidrólise química de grupos funcionais presentes nos componentes das formulaçoes.²⁸

Figura 6. pH das a) NLS e b) CLN com e sem IVM e MTP em funçao do tempo de 120 dias

As formulaçoes de NLS sofreram diminuiçao na variaçao de pH quando ocorreu a encapsulaçao dos ativos comparando-se com a nanopartícula na ausência destes. As formulaçoes de CLN nao apresentaram grandes alteraçoes de pH entre as nanopartículas com os ativos encapsulados e na ausência destes.

Eficiência de retençao

A porcentagem dos ativos retidos foi determinada através da quantificaçao da porcentagem dos ativos IVM e MTP nao encapsulados, livres no ultrafiltrado após a ultrafiltraçao, usando-se a equaçao 1. As porcentagens de retençao para a IVM nas NLS e CLN foram de 99,90±0,02% e 99,90±0,01% respectivamente. Para o MTP os valores encontrados foram 99,85±0,02 para NLS e 99,84±0,02% para CLN.

Os valores indicam que a afinidade entre os ativos com os sistemas nanoestruturados lipídicos é alta, sendo que tal fato se deve principalmente pela hidrofobicidade destes compostos e também por suas baixas solubilidades em meio aquoso (IVM = 4 mg L^-1 e MTP = 0,51 mg L^-1). Além disso, destaca-se o fato dos valores de coeficiente de partiçao da IVM (log Poctanol-água = 3,21) e MTP (log Poctanol-água = 5,50), indicando assim uma alta interaçao com a fase lipídica.^42,43

Ensaio de liberaçao dos ativos

A liberaçao dos ativos está diretamente relacionada com a estrutura dos carreadores, bem como a interaçao do ativo com o sistema carreador. Os resultados se encontram na Figura 7.

Figura 7. Ensaio de liberaçao in vitro dos ativos IVM e MTP das partículas de a) NLS e b) CLN em funçao do tempo de 180 minutos

Como observado nas Figuras 7a e b, as formulaçoes de NLS e CLN contendo os fármacos apresentam uma liberaçao lenta. Comparando as formulaçoes em teste, tanto nas NLS como nos CLN, a IVM é liberada mais rapidamente que o MTP e a liberaçao das NLS é maior que a dos CLN. Este fato provavelmente é devido às interaçoes existentes entre os ativos e os componentes dos sistemas carreadores, o que também pode explicar o fato de que a liberaçao dos ativos ocorre de forma lenta, uma vez que, assim como descrito na literatura, alguns fármacos possuem maior solubilidade em lipídios líquidos do que em lipídios sólidos, proporcionando um menor grau de expulsao do fármaco.^44,45 Outro aspecto que pode ser destacado para a liberaçao mais rápida da IVM em relaçao ao MTP deve-se aos valores de coeficiente de partiçao octanol-água da IVM (logP 3,21) ser menor que o do MTP (logP 5,50). Destaca-se que tais valores provavelmente se devem às características dos grupamentos presentes nas moléculas destes compostos, sendo que a IVM possui um maior número de grupamentos capazes de formar ligaçoes de hidrogênio com a água em relaçao à molécula de MTP.

Microscopia eletrônica de transmissao (MET)

A técnica de MET foi empregada para caracterizar a morfologia das nanopartículas NLS e CLN contendo os ativos IVM e MTP, sendo avaliadas no tempo inicial de estocagem (Figura 8).

Figura 8. Micrografias de A e B) NLS e C e D) CLN no tempo de 0 dias contendo IVM (a) e MTP (b), e CLN no tempo de 0 dias contendo os ativos IVM (c) e MTP (d) com aumento de 27800 vezes

Como se pode observar nas micrografias obtidas, todas as nanopartículas apresentam formato esférico. A Figura 8 apresenta a micrografia de NLS no tempo de 0 dias contendo IVM (a) e MTP (b), e CLN no tempo de 0 dias contendo os ativos IVM (c) e MTP (d) com aumento de 27800 vezes. A partir da figura pode-se observar ainda que as nanopartículas (NLS e CLN) apresentam aproximadamente o mesmo tamanho e formato esférico, havendo formaçao de uma segunda populaçao na formulaçao de CLN contendo MTP, sem ocorrer alteraçao das características morfológicas das nanopartículas.

Ensaios de cito e genotoxicidade

Ensaio de citotoxicidade - Teste de reduçao do tetrazolium MTT (método colorimétrico)

Foram utilizados dois tipos celulares para verificar possíveis variaçoes entre diferentes células, sendo utilizadas células do tipo 3T3 e células V79. A Figura 9a apresenta os resultados para os ensaios de viabilidade celular, nos quais foram avaliados os efeitos citotóxicos dos fármacos IVM e MTP, das NLS e CLN contendo os fármacos IVM e MTP e também das NLS e CLN na ausência destes utilizando-se linhagem de células 3T3.

Figura 9. Avaliaçao da citotoxicidade de células 3T3 e V79 para IVM, NLS e NLS com IVM (a); IVM, CLN e CLN com IVM (b); MTP, NLS e NLS com MTP (c); e MTP, CLN e CLN com MTP (d)

A Figura 9b apresenta os resultados para os ensaios de viabilidade celular, nos quais foram avaliados os efeitos citotóxicos dos fármacos IVM e MTP, das NLS e CLN contendo os fármacos IVM e MTP e também das NLS e CLN na ausência destes utilizando-se células V79.

A Tabela 1 apresenta os valores de IC₅₀ para os ativos (IVM e MTP) e também para as formulaçoes de NLS e CLN na ausência e contendo esses ativos para as células 3T3 e V79.

Os resultados demonstram que as nanopartículas testadas para a encapsulaçao possibilitaram a alteraçao na viabilidade celular das células testadas. Porém, as nanopartículas sem a presença dos ativos apresentaram citotoxicidade na faixa de concentraçao estudada, uma vez que nao mantiveram a viabilidade celular em torno de 100% para as concentraçoes analisadas. Observa-se nas Figuras 9a (células 3T3) e 9b (células V79) que as NLS apresentam menor toxicidade que os CLN, dado que o valor de IC₅₀ de NLS é maior que o de CLN. Quando ocorre a encapsulaçao, este fato se mantém, sendo que as formulaçoes de NLS encapsulada com os ativos IVM ou MTP apresentam menor citotoxicidade que CLN encapsulado com os ativos IVM ou MTP, possibilitando uma melhora na viabilidade celular. Os resultados demonstram que, de forma geral, as formulaçoes de nanopartículas com ativos encapsulados apresentam viabilidade celular acima de 50% quando testadas concentraçoes menores que 0,2 mg mL^-1.

Observa-se na Tabela 1 que as células V79 apresentaram maiores valores de IC₅₀ quando comparadas com as células 3T3, exceto para as NLS e CLN contendo IVM. Desta forma, as formulaçoes apresentaram menor toxicidade (maior valor de IC₅₀) para as células V79. Para as células V79, as formulaçoes de NLS apresentam maiores valores de IC₅₀ que as formulaçoes de CLN, ou seja, apresentam menor toxicidade. O mesmo pode ser observado para as células 3T3, exceto quando ocorre a encapsulaçao de IVM, ocorrendo a inversao, ou seja, o CLN contendo IVM apresenta maior valor de IC₅₀ que a NLS contendo IVM.

O fato das formulaçoes de NLS apresentarem maiores valores de IC₅₀ (menor toxicidade) quando comparadas com as formulaçoes de CLN pode estar relacionado com a composiçao das nanopartículas: a alteraçao do núcleo lipídico provoca significativa influência no valor de IC₅₀.⁴⁶ Desta forma, a viabilidade celular das linhagens de células testadas pode ser alterada com a alteraçao na composiçao das formulaçoes de NLS e CLN com a reduçao da quantidade de lipídios e tensoativo utilizados em sua preparaçao, possibilitando o uso veterinário sem prejuízos aos animais tratados.

Ensaio de genotoxicidade Allium cepa

A Figura 10 apresenta os resultados para os ensaios de índice mitótico obtidos com ensaio de aberraçao cromossômica Allium cepa, nos quais foram avaliados os efeitos genotóxicos dos fármacos IVM e MTP, das NLS e CLN contendo os fármacos IVM e MTP, e também das NLS e CLN na ausência destes.

Figura 10. Avaliaçao da citotoxicidade e genotoxicidade de células de Allium cepa para os fármacos IVM e MTP, carreadores NLS e CLN, e formulaçoes de NLS com IVM; CLN com IVM, NLS com MTP e CLN com MTP. Foi considerada uma significância de p<0,05 para as diferenças estatísticas observadas entre os grupos, onde a representa variaçoes nao significativas entre as formulaçoes em relaçao ao controle; b representa variaçoes significativas formulaçoes em relaçao ao controle

Na Figura 10 estao representados os resultados dos testes de citotoxicidade dos fármacos IVM e MTP em Allium cepa, sendo que o índice mitótico representa o número de células em divisao em relaçao ao número total de células. Com relaçao à genotoxicidade pode-se observar que as formulaçoes provocaram alteraçoes em relaçao à soluçao controle, sendo que a NLS apresenta maior índice mitótico que CLN, tanto na presença de IVM quanto na ausência dos fármacos. Tanto as NLS como os CLN apresentaram valores de índice mitótico acima do controle, o que indica que as formulaçoes provocam um estímulo à divisao celular. Desta forma, as formulaçoes testadas nao apresentaram citotoxicidade nas concentraçoes em teste.

O índice de alteraçao é utilizado para verificar possíveis danos ao DNA. Desta forma, pode-se observar na Figura 10 que todas as formulaçoes testadas provocaram alteraçoes no DNA das células testadas, sendo que o uso dos nanocarreadores NLS e CLN para encapsulaçao de IVM e MTP aumentaram o valor do índice de alteraçao destes dois ativos (IVM e MTP), aumentando as alteraçoes no organismo testado.

CONCLUSAO

Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as nanopartículas desenvolvidas (NLS e CLN) apresentam alta capacidade de encapsulaçao dos ativos IVM e MTP (acima de 99%). As formulaçoes desenvolvidas apresentaram estabilidade durante o tempo de estocagem. Por diferentes técnicas (ECF e NTA) foram obtidos valores semelhantes para a distribuiçao de tamanho, e também um perfil monomodal, ou seja, apenas uma populaçao de partículas. Pode-se observar que durante o tempo de estocagem ocorreu variaçao na intensidade do tamanho da partícula analisada, o que pode indicar possível formaçao de agregados. As análises de microscopia eletrônica de transmissao mostraram que tanto as NLS como os CLN apresentam morfologia esférica, sem a presença de agregados. Os ensaios de cinética de liberaçao demonstraram que os perfis cinéticos dos ativos encapsulados nas NLS e CLN foram lentos. Comparando as formulaçoes em teste, a IVM é liberada mais rapidamente que o MTP. Os resultados do ensaio de cito e genotoxicidade demonstram que as nanopartículas testadas para a encapsulaçao possibilitaram a alteraçao na viabilidade celular das células testadas. Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que as nanopartículas apresentaram boas características coloidais e a presença ou ausência de drogas nao provocam alteraçoes nas características das nanopartículas, possibilitando o desenvolvimento de sistemas carreadores para estes fármacos visando aplicaçoes veterinárias.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPESP pelo auxílio financeiro (processo #2013/12322-2, #2015/15617-9) e bolsa de mestrado para Diego Cola Faria (processo #2013/24788-6).

REFERENCIAS

1. Fricker, G.; Kromp, T.; Wendel, A.; Blume, A.; Zirkel, J.; Rebmann, H.; Setzer, C.; Quinkert, R. O.; Martin, F.; Müller-Goymann, C.; Pharma Res. 2010, 27, 1469.

2. Mella, M. R.; Mendo, O. H.; Trop. Subtrop. Agroecosyst. 2010, 12, 423.

3. Gao, J.; Gu, H.; Xu, B.; Acc. Chem. Res. 2009, 42, 1097.

4. Silva, T. E. M.; Calazans, D. R. S.; Premebida, A.; Trabalho apresentado no XVI Congresso Brasileiro de Sociologia, Salvador, Brasil, 2013.

5. Pyrrho, M.; Schramm, F. R.; Cad. Saúde Pública. 2012, 28, 2023.

6. Martins, P. R.; Trabalho apresentado no 2º Seminário Internacional de Nanotecnologia, Sociedade e Meio Ambiente, Sao Paulo, Brasil, 2005.

7. Manuja, A.; Kumar, B.; Singh, R. K.; Nanotechnol. Dev. 2012, 2, 17.

8. Booth, N. H.; McDonald, L. E.; Farmacologia e Terapêutica Veterinária, 7ª ed., Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 1992.

9. Bill, R.; Pharmacology for veterinary technicians, 5ª ed., A&Chnicians: California, 1993.

10. McCall, J. W.; Lindemann, B. A.; Porter, C. A.; Am. J. Vet. Res. 1996, 57, 1189.

11. Pimpao, C. T.; Rocha, R. M. V. M.; Schaefer, R.; Wouk, A. F. P. F.; Cirio, S. M.; Benato, E. M.; Gurgel, L. G. A.; Fronczak, M. A.; Revista Acadêmica: ciências agrárias e ambientais 2005, 4, 19.

12. Daglish, G. J.; Holloway, J. C.; Nayak, M. K.; J. Stored Prod. Res. 2013, 54, 8.

13. Retnakaran, A.; Granett, J.; Ennis, T. Em Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry, and Pharmacology; Kerkut, G., Gilbert, L., eds.; Pergamon: Oxford, 1985.

14. Dhadialla, T. S.; Carlson, G. R.; Le, D. P.; Annu. Rev. Entomol. 1998, 43, 545.

15. Henrick, C. A.; J. Am. Mosq. Control Assoc. 2007, 23, 225.

16. Müller, R. H.; Maëder, K.; Gohla, S.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 161.

17. Mehnert, W.; Mader, K.; Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, 47, 165.

18. Wissing, S. A.; Kayser, O.; Müller, R. H.; Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 1257.

19. Fang, J. Y.; Fang, C. L.; Liu, C. H.; Su, Y. H.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008, 70, 633.

20. Teeranachaideekul, V.; Souto, E. B.; Junyaprasert, V. P.; Müller, R. H.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007, 67, 141.

21. Mandawgade, S. D.; Shobhona, S.; Pathak, S.; Patravale, V. B.; Int. J. Pharm. 2008, 362, 179.

22. Joshi, M. D.; Müller, R. H.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, 71, 161.

23. Souto, B. E.; Severino, P.; Santana, A. H. M.; Pinho, C. S.; Quim. Nova 2011, 34, 1762.

24. Vitorino, C.; Carvalho, F. A.; Almeida, A. J.; Sousa, J. J.; Pais, A. A. C. C.; Colloids Surf., B 2011, 84, 117.

25. Govender, T.; Stolnik, S.; Garnett, M. C.; Illum, L.; Davis, S. S.; J. Control. Release 1999, 57, 171.

26. Govender, T.; Riley, T.; Ehtezazi, T.; Garnett, M. C.; Stolnik, S.; Illum, L.; Davis, S.S.; Int. J. Pharm. 2000, 199, 95.

27. Venkatraman, S. S.; Jie, P.; Min, F.; Freddy, B. Y. C.; Leong-Huat, G.; Int. J. Pharm. 2005, 298, 219.

28. Schaffazick, S. R.; Guterres, S.; Freitas, L. L.; Pohlmann, A. R.; Quim. Nova 2003, 26, 726.

29. Anderson, W.; Kozak, D.; Coleman, V. A.; Jämting, Å. K.; Trau, M.; J. Colloid Interface Sci. 2013, 405, 322.

30. Jores, K.; Mehnert, W.; Drechsler, M.; Bunjes, H.; Johann, C.; Mader, K.; J. Control. Release. 2004, 95, 217.

31. Gamisans, F.; Lacoulonche, F.; Chauvet, A.; Espina, M.; Garcia, M. L.; Egea, M. A.; Int. J. Pharm. 1999, 179, 37.

32. Kilic, A. C.; Capan, Y.; Vural, I.; Gursoy, R. N.; Dalkara, T.; Cuine, A.; Hincal, A.A.; J. Microencapsul. 2005, 22, 633.

33. Asrar, J.; Ding, Y.; La Monica, R. E.; Ness, L. C.; J. Agri. Food Chem. 2004, 52, 4814.

34. Paavola, A.; Yliruusi, J.; Kajimoto, Y.; Kalso, E.; Wahlström, T.; Rosenberg, P.; Pharm. Res. 1995, 12, 1997.

35. De Lima, R.; Feitosa, L.; Pereira, A. E. S.; De Moura, M. R.; Aouada, F. A.; Matosso, L. H. C.; Fraceto L. F.; J. Food Sci. 2010, 75, N89-N96.

36. De Lima, R.; Feitosa, L.; Grillo, R.; Pereira, A. E. S.; Fraceto, L. F.; J. Environ. Sci. Eng. A 2012, 1, 553.

37. Marcato, P. D.; Rev. Eletr. Farm. 2009, 6, 1.

38. Rai, S.; Paliwal, R.; Gupta, P. N.; Khatri, K.; Goyal, A. K.; Vaidya, B.; Vyas, S. P.; Curr. Nanosci. 2008, 4, 30.

39. Venuganti, V. V.; Perumal, O. P.; Em Drug Delivery Nanoparticles Formulation and Characterization; Pathak, Y., Thassu, D., eds.; New York: Informa Healthcare, 2009.

40. Mosqueira, V. C. F.; Legrand, P.; Pinto-Alphandary, H.; Puisieux, F.; Barrat, G.; J. Pharm. Sci. 2000, 89, 614.

41. Marin, E.; Briceno, M. I.; Caballero-George, C.; Int. J. Nanomed. 2013, 8, 3071.

42. http://ceqg-rcqe.ccme.ca/download/en/192, acessada em Abril 2016.

43. http://www.doc.govt.nz/Documents/science-and-technical/DSIS67.pdf, acessada em Abril 2016.

44. Chen, C. C.; Tsai, T. H.; Huang, Z. R., Fang, Y. J.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2010, 74, 474.

45. Müller, R. H.; Radtke, M.; Wissing, S. A.; Em Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechonology; Nalwa, H. S., ed.; American Scientific Publishers: California, 2004.

46. Schöler, N.; Hahn, H.; Müller, R. H.; Liesenfeld, O.; Int. J. Pharm. 2002, 231, 167.