JBCS

INTRODUÇAO

Plantas da família Clusiaceae têm sido motivo de estudos fitoquímicos, por apresentarem metabólitos especiais com estruturas diversificadas e com atividades biológicas, principalmente os pertencentes às classes de benzofenonas, biflavonoides e xantonas.^1,2 Nesta família, o gênero Clusia, constituído por aproximadamente 250 espécies,³ tem recebido mais atençao quanto ao estudo químico e farmacológico. Estudos realizados com este grupo de plantas levaram a caracterizaçao de metabólitos especiais pertencentes a várias classes, tais como: benzofenonas, floroglucinóis, biflavonoides, bifenilas e xantonas.^1,4-7 Entre as atividades relatadas para substâncias e/ou extratos obtidos de plantas deste gênero, destacam-se as propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas e antioxidantes.^5,6,8

Clusia lanceolata Cambess, popularmente conhecida como cebola-da-mata, é uma espécie endêmica nas restingas fluminenses, cujos extratos de folhas apresentaram atividade antioxidante in vitro.⁹ Nao há registro do uso medicinal e poucos sao os dados sobre estudo fitoquímico relacionado a esta espécie. Em trabalho anterior descrevemos a identificaçao de isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo, vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo, isoorientina e orientina em extratos de folhas de C. lanceolata por CLAE-EM.⁹ Em continuaçao a busca por substâncias com propriedades antioxidantes em espécies do gênero Clusia,^5,9 sao apresentados neste trabalho os resultados do estudo fitoquímico de extratos de folhas de C. lanceolata e avaliaçao da atividade antioxidante in vivo de algumas das substâncias isoladas.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Para cromatografia em camada delgada (CCD) utilizaram-se placas de sílica gel PF₂₅₄ (Whatman e Silicle), as quais foram observadas sob luz UV 254 e 366 nm e reveladas com soluçoes de sulfato cérico e vanilina sulfúrica, seguida de aquecimento. As separaçoes cromatográficas em coluna (CC) foram realizadas utilizando-se gel de sílica 60 (Vetec, 70-230 mesh e 230-400 mesh) e Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich). Os experimentos de RMN de ¹H e ¹³C (uni- e bidimensionais) foram obtidos em espectrômetro Bruker AVANCE II (500/125 MHz), utilizando-se CDCl₃, DMSO-d₆ e CD₃OD como solventes e os sinais residuais destes em relaçao ao TMS como referência. Os espectros no IV foram registrados em espectrômetro VERTEX-70, tendo sido as amostras preparadas sob a forma de filme sobre cela de NaCl ou pastilha de KBr. Os espectros de massas de baixa resoluçao foram obtidos no espectrômetro GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu. As análises fotométricas foram registradas em espectrofotômetro UV-VIS da marca Shimadzu, modelo UV-mini 1240.

Coleta e identificaçao do material botânico

O material botânico, folhas de Clusia lanceolata, foi coletado na Restinga de Grumari no munícipio do Rio de Janeiro-RJ em abril de 2012. O material botânico foi identificado pelo técnico Me. Thiago Amorim (RBR - UFRRJ). A exsicata de número 35424 está depositada no herbário RBR, da UFRRJ.

Extraçao e isolamento dos constituintes químicos

Folhas secas (230,0 g) foram trituradas e submetidas à extraçao com CH₂Cl₂ e, posteriormente, em MeOH, através de maceraçao a temperatura ambiente. As soluçoes resultantes após filtraçao foram concentradas sob pressao reduzida, fornecendo os extratos brutos em CH₂Cl₂ (CLFD, 23,0 g) e MeOH (CLFM, 20,0 g). Parte do extrato CLFM (17,0 g) foi solubilizada em uma soluçao MeOH/H₂O (7:3) e submetido a partiçoes líquido/líquido, e foram obtidas as fraçoes em n-hexano (CLFMH, 1,6 g), CHCl₃ (CLFMC, 1,5 g), AcOEt (CLFMAc, 3,5 g) e BuOH (CLFMBu, 2,0 g), respectivamente. A fraçao AcOEt forneceu um precipitado identificado como vitexina (1, 110,0 mg).

Parte da fraçao AcOEt (3,0 g) foi filtrada em Sephadex LH-20 usando MeOH como eluente, foram obtidas 6 fraçoes, após monitoramento por CCD. A quinta fraçao forneceu a isovitexina (2, 5,0 mg). A segunda e a quarta fraçoes foram filtradas novamente em Sephadex LH-20 usando MeOH como eluente e forneceram, respectivamente, a mistura de isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo e vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3 + 4, 40,0 mg) e a mistura de isoorientina, orientina e isovitexina (5 + 6 + 2, 12,0 mg).

O extrato CLFD (20,0 g) foi fracionado através de cromatografia em coluna (CC) em gel de sílica 60, empregando-se como eluentes, em modo isocrático, n-hexano, CH₂Cl₂, AcOEt e MeOH, fornecendo quatro fraçoes. A segunda fraçao (7,0 g) foi submetida a CC em sílica gel 60, empregando-se como eluentes n-hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt em gradiente crescente de polaridade, fornecendo as misturas de α e β-amirina (7 + 8, 1,2 g) e β-sitosterol com estigmasterol (9 + 10, 30,0 mg). A terceira fraçao (10,0 g) foi submetida a CC (sílica gel 60) e eluída com CH₂Cl₂, AcOEt e MeOH em gradiente crescente de polaridade, fornecendo 10 fraçoes. A terceira fraçao desta coluna forneceu a mistura de rel-13²-hidroxi-(13²-S-)-feofitina a e rel-13²-hidroxi-(13²-R)-feofitina a (11 + 12, 70,0 mg). A quinta fraçao foi submetida à nova CC (sílica gel 60) e eluída com CH₂Cl₂ e AcOEt, fornecendo a mistura de sitosterona e estigmasterona (13 + 14, 35,0 mg). Uma soluçao de 1,0 mg/mL em metanol grau HPLC da mistura de isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3) e vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (4) foi injetada no aparelho CLAE-DAD da Shimadzu com coluna C18 Betasil-Thermo (25 cm x 4,6 mm, 5 µm) a 29 °C. As substâncias foram eluídas com gradiente de fase móvel binária composta por: (A) ácido acético a 1% em água e (B) metanol. O sistema de eluiçao teve como condiçao inicial a eluiçao de 60% de B por 10 minutos, seguido de um gradiente linear de B até 28% até 12 minutos e, 28% de B até 15 minutos, com fluxo de 1,3 mL/min e volume de injeçao de 20 µL das substâncias. A faixa de comprimento de onda (λ) 200 nm a 500 nm foi utilizada na investigaçao. Todas as substâncias foram submetidas à análise de ressonância magnética nuclear de ¹H e ¹³C e, adicionalmente, as substâncias 7, 8, 13 e 14 foram identificadas inclusive com análise por CG-EM.

Vitexina (1): Sólido amarelo. RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz) δ_H (mult.; J em Hz; H): 6,79 (s; H-3), 13,17 (s; OH-5), 6,27 (s; H-6), 8,02 (d; J = 8,5; H-2', 6'), 6,87 (d; J = 8,5; H-3', 5'), 4,73 (d; J = 9,8; H-1"). RMN ¹³C (DMSO-d₆, 125 MHz) δ_C: 163,9 (C-2), 102,5 (C-3), 182,1 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1 (C-6), 162,6 (C-7), 104,6 (C-8), 156,0 (C-9), 104,0 (C-10), 121,6 (C-1'), 129,0 (C-2',6'), 115,8 (C-3',5'), 73,4 (C-1").

Isovitexina (2): Sólido amarelo. RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz) δ_H (mult.; J em Hz; H): 6,66 (s; H-3), 13,53 (s; OH-5), 6,32 (s; H-6), 7,88 (d; J = 8,5; H-2', 6'), 6,90 (d; J = 8,5; H-3', 5'), 4,57 (d; J = 10,0; H-1"). RMN ¹³C (DMSO-d₆, 125 MHz) δ_C: 163,9 (C-2), 103,0 (C-3), 182,2 (C-4), 161,4 (C-5), 109,0 (C-6), 163,7 (C-7), 94,0 (C-8), 156,6 (C-9), 103,6 (C-10), 121,4 (C-1'), 128,7 (C-2',6'), 116,3 (C-3',5'), 73,3 (C-1").

Isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3): Sólido amarelo. RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz) e ¹³C (DMSO-d₆, 125 MHz). Ver Tabela 1.

Vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (4): Sólido amarelo. RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz) e ¹³C (DMSO-d₆, 125 MHz). Ver Tabela 1.

Isoorientina (5): Sólido amarelo. RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz) δ_H (mult.; J em Hz; H): 6,67 (s; H-3), 13,57 (s; OH-5), 6,47 (s; H-6), 7,40 (d; J = 2,5; H-2'), 6,88 (d; J = 9,0; H-5'), 7,42 (dd; J = 2,5 e 9,0; H-6'), 4,58 (d; J = 10,0; H-1"). RMN ¹³C (DMSO-d₆, 125 MHz) δ_C: 163,6 (C-2), 102,8 (C-3), 181,9 (C-4), 160,7 (C-5), 108,9 (C-6), 163,6 (C-7), 93,5 (C-8), 156,2 (C-9), 103,3 (C-10), 121,3 (C-1'), 113,3 (C-2'), 145,8 (C-3'), 149,8 (C-4'), 116,1 (C-5'), 119,0 (C-6'), 73,1 (C-1").

Orientina (6): Sólido amarelo. RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz) δ_H (mult.; J em Hz; H): 6,64 (s; H-3), 13,18 (s; OH-5), 6,26 (s; H-6), 7,48 (sl; H-2'), 6,92 (d; J = 8,0; H-5'), 7,53 (dd; J = 2,0 e 8,0; H-6'), 4,68 (d; J = 9,0; H-1").

Mistura de α-amirina (7) e β-amirina (8): Cristais brancos. RMN ¹H e ¹³C e massas em acordo com dados da literatura.¹⁰

Mistura de β-sitosterol (9) e estigmasterol (10): Cristais brancos. RMN ¹H e ¹³C em acordo com dados da literatura.¹¹

Mistura de 13²-hidroxi-(13²-S-)-feofitina (11) e 13²-hidroxi-(13²-R)-feofitina (12): Sólido verde. UV, IV, RMN ¹H e ¹³C em acordo com dados da literatura.¹²

Mistura de sitosterona (13) e estigmasterona (14): Sólido amarelo. RMN ¹H e ¹³C e massas em acordo com dados da literatura.¹³

Determinaçao da atividade antioxidante in vivo

Linhagens de Saccharomyces cerevisiae e condiçoes de crescimento

A cepa BY4741 (MATa; his3; leu2; met15; ura3) foi adquirida da empresa Euroscarf (Frankfurt, Alemanha). Seus estoques foram mantidos em meio de cultura sólido YPD 2% (1% de extrato de levedura, 2% de glicose, 2% de peptona e 2% de ágar). Para todos os experimentos, as células foram cultivadas em meio YPD 2% líquido usando um agitador orbital a 28 °C e 160 rpm com a relaçao de volume/meio no frasco de 5:1. Componentes do meio de cultura foram adquiridos da Difco. A concentraçao celular foi determinada medindo a absorbância a 570 nm. O fator de conversao da absorbância em peso seco foi calculado por meio de filtraçao de 10 mL da suspensao de células através de um filtro Milipore (0,45 µm) e desidratado a 80 ºC até peso constante.

Estresse oxidativo, viabilidade celular e disfunçao mitocondrial

As células de levedura foram recolhidas na 1ª fase exponencial de crescimento (1,0 mg de peso seco/mL), e em seguida incubadas com as substâncias na concentraçao de 25 µg/mL durante 120 min a 28 °C e 160 rpm. As células foram recolhidas por centrifugaçao e lavadas duas vezes com tampao fosfato 50 mM, pH 6,0. Em seguida, as células livres do meio foram ressuspensas no mesmo tampao fosfato contendo H₂O₂ na concentraçao de 1,0 mM, e mantidas por 60 min a 28 °C e 160 rpm. A viabilidade celular foi determinada por plaqueamento em meio YPD sólido, após diluiçao apropriada, antes e depois das condiçoes de estresse oxidativo, e foi expressa como percentagem de sobrevivência. As placas foram incubadas a 28 °C durante 72 horas e as colônias contadas. Já para detectar a disfunçao mitocondrial as células passaram pelo mesmo tratamento anterior, porém o plaqueamento foi realizado em meio sólido YPGly 4% (1% de extrato de levedura, 4% de glicerol, 2% de peptona e 2% de ágar), usado para testar a incapacidade das células de crescer sob meio estritamente aeróbio (glicerol). A viabilidade foi medida como percentagem de células viáveis, cultivadas em YPD 2% que sobreviveram após incubaçao com vitexina (1) e a mistura de isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3) e vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (4) após o estresse com peróxido de hidrogênio. Já a taxa de danos nas mitocôndrias foi determinada como a diferença entre o número de colônias contadas em placas YPGly 4% e YPD 2% após incubaçao com as substâncias (1 e 3 + 4) após o estresse com peróxido de hidrogênio.¹⁴

Todos os experimentos foram realizados com três repetiçoes. A soluçao de H₂O₂ (30%) foi obtida da empresa Vetec (Rio de Janeiro, Brasil).

Análise estatística

Os resultados foram submetidos a tratamento estatístico através do teste de Tuckey, utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0 DEMO.

RESULTADOS E DISCUSSAO

O fracionamento cromatográfico de extratos de folhas de Clusia lanceolata conduziu ao isolamento da vitexina (1), isovitexina (2), isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3), vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (4), isoorientina (5), orientina (6), α e β-amirina (7 e 8), β-sitosterol (9), estigmasterol (10), rel-13²-hidroxi-(13²-S-)-feofitina a (11), rel-13²-hidroxi-(13²-R)-feofitina a (12), sitosterona (13) e estigmasterona (14) (Figura 1). A identificaçao das substâncias baseou-se na análise de espectros e comparaçao de dados com valores descritos na literatura.^{10-13, 15-19}

Figura 1. Estrutura das substâncias isoladas de Clusia lanceolata

As substâncias 1, 2, 5 e 6 foram identificadas como flavonas, através da análise dos dados de RMN ¹H e ¹³C (ver parte experimental) e espectros bidimensionais COSY ¹H-¹H, HMQC e HMBC, além da comparaçao com dados publicados anteriormente. Nos espectros de RMN ¹H as flavonas mostram um singleto entre δ_H 6,0 e 8,0 característico de hidrogênio ligado ao C-3, sendo que no espectro de RMN ¹³C o sinal correspondente a este carbono mostra sinal em torno de δ_C 102. A substância 1 foi identificada como vitexina,¹⁵ e as substâncias 2, 5 e 6 foram identificadas como isovitexina, isoorientina e orientina, respectivamente.^15,16,17

A análise por CLAE-DAD da fraçao contendo as substâncias 3 e 4 mostrou a presença de dois picos com espectros de UV exibindo duas bandas com máximos de absorçao em 270 e 350, característicos de núcleos de flavonas. O espectro de RMN ¹H de 3 apresentou sinais característicos de apigenina 6-C-substituída, sendo caracterizado pela presença de dois dupletos em δ_H 7,92 (J= 8,5 Hz; H-2'/6') e δ_H 6,93 (J= 8,5 Hz; H-3'/5'), sugerindo um sistema do tipo AA'XX', dois singletos em δ_H 6,77 (H-3) e δ_H 6,54 (H-8), e ausência de sinal característico de H-6. Adicionalmente, observou-se sinais em δ_H 4,66 (H-1") e δ_H 5,08 (H-1"') que permitiram atribuir a presença de duas unidades glicosídicas. Os espectros de RMN ¹³C e HMQC de 3 corroboraram com a sugestao de duas unidades de carboidrato pela presença de sinais para dois carbonos anoméricos em δ_C 71,6 (C-1") e δ_C 104,4 (C-1"'), além dos sinais para um carbono metilênico em δ_C 61,8 (C-6") e carbono metílico em δ_C 17,6 (C-6"'). Após comparaçao com dados da literatura¹⁸ propôs-se a presença de uma unidade de glicose e uma de ramnose. As correlaçoes ³J_HC observadas no HMBC entre os picos em δ 4,66/109,0 (H-1"/C-6) e δ 5,08/74,6 (H-1"'/C-2") confirmaram a conectividade do dissacarídeo na molécula. Por conseguinte, a análise detalhada dos dados de RMN de ¹H e ¹³C, COSY ¹H-¹H, HMQC e HMBC e a comparaçao com dados descritos na literatura permitiram identificar a substância 3 como isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo.¹⁸ Esta análise fez perceber que os espectros de RMN ¹H e ¹³C de 3 obtidos em DMSO-d₆ exibiram sinais alargados e/ou duplicados, indicando a presença de dois confôrmeros rotaméricos, que foram denominados confôrmeros A e B (Tabela 1; ver material suplementar). No caso de flavonoides, este fenômeno é normalmente observado em 6-C-glicosilflavonoides onde a rotaçao livre no C(sp³)-C(sp²) da ligaçao glicose-flavona é impedida por fatores estéricos.¹⁸ Adicionalmente, os valores nao usuais de deslocamento químico observados para H-5'" (δ_H 2,11) e H-6'" (δ_H 0,51) da unidade de ramnose do dissacarídeo podem estar relacionados a efeitos anisotrópicos do anel aromático da aglicona, decorrentes da conformaçao adotada por este tipo de substância.²⁰ Ainda nos espectros de RMN ¹H e ¹³C foram observados sinais de menor intensidade, atribuídos a um componente minoritário da mistura, característicos para apigenina substituída na posiçao C-8 pela mesma unidade de dissacarídeo de 3. A substância minoritária (4) na mistura foi identificada como vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo com base nos sinais adicionais nos espectros de RMN ¹H e ¹³C e comparaçao com dados da literatura (Tabela 1).¹⁹

O estudo fitoquímico de espécies do gênero Clusia têm revelado o acúmulo de flavonas C-glicosiladas derivadas da apigenina e luteolina, especialmente nas folhas. As substâncias 1 e 2 foram previamente isoladas em C. columnaris e C. criuva.^21,22 A substância 4 foi isolada de C. sandiensis.²³ Entretanto, este é o primeiro relato do isolamento da substância 3 e das feofitinas 11 e 12 na família Clusiaceae. As feofitinas sao consideradas produtos de degradaçao das clorofilas, durante o processo de degradaçao ocorre a substituiçao do átomo de Mg por dois átomos de H, processo conhecido como feofitinizaçao.²⁴ Apesar da ocorrência relativamente rara na natureza, a diversidade estrutural das feofitinas e as atividades biológicas que apresentam têm despertado muito interesse.

Atividade antioxidante in vivo dos flavonoides

Diferentes métodos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para avaliar a atividade antioxidante de substâncias. Os testes químicos in vitro apesar de serem mais rápidos e simples nao sao representativos das condiçoes celulares do homem. Neste contexto, os ensaios microbianos in vivo utilizando células eucarióticas da levedura Saccharomyces cerevisiae têm se mostrado adequados, por fornecerem resultados rápidos, reprodutíveis e passíveis de serem correlacionados ao observado no homem.²⁵ Neste trabalho, a análise dos resultados foi realizada comparando-se os valores percentuais da viabilidade celular (Figura 2) e disfunçao mitocondrial (Tabela 2) da levedura S. cerevisiae tratada somente com H₂O₂ (1,0 mM) e com este agente estressor após pré-incubaçao das células com a vitexina (1) e com a mistura contendo isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3) e vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (4), nas concentraçoes de 25,0 µg mL^-1 cada. No ensaio de viabilidade celular foram encontradas diferenças estatísticas significativas entre a levedura tratada somente com H₂O₂ e tratada com H₂O₂ após pré-tratamento com o flavonoide 1 e com a mistura de 3 e 4. O aumento na viabilidade das células de S. cerevisiae na presença das substâncias sugeriu o efeito protetor dos flavonoides aos danos oxidativos causados pelo agente estressor H₂O₂. Além disso, ambas as substâncias também diminuíram ou evitaram os danos causadas à mitocôndria pela soluçao de peróxido de hidrogênio (1,0 mM) (Tabela 2). Como conclusao dos ensaios, observamos que tanto a substância 1 quanto a mistura de 3 e 4 protegeram as células da açao do peróxido de hidrogênio, mantendo os resultados ao nível experimental do controle. Este é o primeiro relato sobre a avaliaçao da capacidade antioxidante in vivo das substâncias 1, 3 e 4 utilizando-se como modelo de sistema biológico a levedura S. cerevisiae.

Figura 2. Viabilidade celular da levedura S. cerevisiae nos tratamentos com os diferentes flavonoides (25,0 µg mL^-1) e H₂O₂ (1,0 mM)

O peróxido de hidrogênio isoladamente é praticamente inócuo, entretanto pode se difundir facilmente pelas membranas celulares e reagir com metais presentes em seu interior e gerar radicais hidroxila. O radical hidroxila causa danos ao DNA, RNA, proteínas, lipídios e membranas celulares do núcleo e mitocondrial.²⁶Alguns flavonoides sao capazes de complexar-se com metais, tais como Fe³⁺ e Cu²⁺, evitando/diminuindo a geraçao de radicais hidroxila pela reaçao de Haber-Weiss/Fenton.²⁵ Considerando que a geraçao de radicais hidroxila pelo H₂O₂ é mediada por metais de transiçao, é possível que a propriedade quelante dos flavonoides 1 e da mistura 3 e 4 tenha contribuído para sua atividade antioxidante.

CONCLUSAO

Este é o primeiro estudo que relata o isolamento dos metabólitos especiais da espécie C. lanceolata e resultou na identificaçao de 14 substâncias, sendo três inéditas na família Clusiaceae, o flavonoide isovitexina-2"-O-α-L-rhamnopiranosídeo (3) e a mistura de feofitinas rel-13²-hidroxi-(13²-S-)-feofitina a (11), rel-13²-hidroxi-(13²-R)-feofitina a (12).

Adicionalmente, relatamos a promissora atividade antioxidante in vivo da vitexina (1) e da mistura de isovitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (3) e vitexina-2"-O-α-L-ramnopiranosídeo (4) empregando-se como modelo de sistema biólogico a levedura S. cerevisae. Estes resultados sugerem que C. lanceolata é uma nova fonte natural de susbtâncias antioxidantes, que podem vir a atuar futuramente no combate a doenças relacionadas ao estresse oxidativo.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C de algumas das substâncias isoladas, citados no texto, estao disponíveis na forma de material suplementar em http://quimicanova.sbq.org.br, em formato PDF, com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

A CAPES, CNPq e a FAPERJ pelas bolsas concedidas e pelo apoio financeiro.

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#This paper is part of the PubliSBQ Special Issue in honor of the late Prof. Angelo da Cunha Pinto.