JBCS

INTRODUÇAO

Própolis é uma mistura complexa de substâncias resinosas, gomosas e balsâmicas coletadas pelas abelhas melíferas de brotos, flores e exsudados de plantas, às quais as abelhas acrescentam secreçoes salivares, cera e pólen para a elaboraçao do produto final. A própolis bruta encontra-se no estado sólido, sendo dura a 15 ºC e maleável a partir dos 30 ºC. Suas propriedades físicas, como cor, odor e faixa de fusao (60 ºC - 70 ºC) variam de uma amostra para outra. Devido à grande diversidade de espécies vegetais brasileiras visitadas pelas abelhas, ocorre uma elevada variaçao de seus princípios ativos. Sua cor varia do verde, vermelho ao marrom escuro, e esta variaçao está relacionada com a origem geográfica e a vegetaçao de onde ela é extraída.¹

Estudos realizados mostram que mais de trezentas substâncias foram identificadas em amostras de própolis, das quais se destacam: os flavonoides (galangina, crisina, tectocrisina, pinocembrina, canferol e quercetina), além dos aldeídos aromáticos (vanilina e isovanilina), cumarinas, ácidos fenólicos (ácido caféico, ferúlico, cinâmico e cumárico), ácidos orgânicos (ácido benzóico), ácidos e ésteres alifáticos e aromáticos, açúcares, alcoóis, ácidos graxos, aminoácidos, esteroides, cetonas, chalconas e diidrochalconas, terpenoides e proteínas.² Dentre estas classes de substâncias, destacam-se a dos flavonoides e a dos ácidos fenólicos, pois sao atribuídas a elas grandes parte das atividades biológicas descritas para a própolis. Os flavonoides e ácidos fenólicos sao as principais classes de substâncias fenólicas, cujas relaçoes estrutura-atividade antioxidante em sistemas aquosos ou lipofílicos têm sido extensivamente relatadas.³ Ocorrendo naturalmente, espera-se que esses polifenóis ajudem a reduzir o risco de várias doenças, incluindo câncer e doenças cardiovasculares, devido à sua atividade antioxidante.

Há um interesse pelo consumo de própolis crescente no Brasil e no mundo devido ao aumento nas pesquisas envolvendo sua composiçao química e propriedades terapêuticas. Existem vários estudos que atribuem à própolis diversas aplicaçoes na medicina popular, os quais relatam seu grande potencial terapêutico. Diversas propriedades biológicas, tais como antimicrobiana, anti-inflamatória, cicatrizante, anestésica, anticarcinogênica, antiviral, antioxidante e fitotóxica têm sido atribuídas à própolis e aos seus constituintes.⁴

O Brasil está em terceiro lugar no ranking mundial em termos de produçao da própolis. As condiçoes climáticas, geográficas e as características da vegetaçao favorecem esta produçao que tem sua maior demanda voltada para o mercado japonês. De toda a própolis in natura consumida no Japao, cerca de 92% é de origem brasileira e, segundo os dados da Japan Trade Organization, o frasco do extrato alcoólico da substância é vendido por até US$ 110.00.⁵

Própolis possui atividade antioxidante, seus constituintes sao capazes de sequestrar os radicais livres. Por outro lado, a sua composiçao química e, portanto, a atividade antioxidante, pode variar amplamente de acordo com a localizaçao, época da colheita ou simplesmente comparando com outra colmeia. Apesar de existir uma série de estudos comparativos avaliando a capacidade antioxidante da própolis, poucos sao os relatos sobre amostras do estado do Rio de Janeiro. O propósito desse estudo foi determinar a composiçao química, quanto aos fenólicos e flavonoides totais, e testar e comparar a capacidade antioxidante de doze amostras de própolis verde bruta e doze amostras de tinturas de própolis comercializadas em diferentes regioes do sudeste do Brasil. Os extratos etanólicos de própolis foram analisados por CLAE-DAD para determinar e quantificar as substâncias bioativas responsáveis por sua propriedade antioxidante e, assim, entender a relaçao entre a composiçao e a atividade antioxidante. Além disso, a técnica de análise multivariada (PCA) foi aplicada ao conjunto de dados obtidos com as análises dos extratos etanólicos da própolis in natura e nas tinturas comerciais, para efeitos de comparaçao e para avaliaçao da qualidade dos extratos comerciais.

PARTE EXPERIMENTAL

Amostras de própolis

As doze amostras de própolis verde bruta (E) de Apis mellifera foram obtidas diretamente de diferentes apicultores, enquanto as doze tinturas de própolis (C) foram adquiridas atráves de compra em lojas especializadas no comércio de distintas cidades do estado do Rio de Janeiro, sendo que algumas dessas amostras sao produzidas em outros estados da regiao sudeste (Tabela 1). As amostras in natura foram pulverizadas em liquidificador, mantidas em frascos bem fechados e armazenadas em freezer até o momento das extraçoes.

Reagentes

Os reagentes carbonato de sódio anidro, cloreto de alumínio hexaidratado, bissulfito de sódio, assim como o metanol e ácido acético grau espectroscópico foram comprados da VETEC (RJ, Brasil). Os reagentes DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), ABTS [2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)], TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina), TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico), Folin-Ciocalteau, ácido clorogênico, ácido cafeico, vanilina, ácido ferúlico, ácido para-cumárico, ácido rosmarinico, hesperidina, naringenina, pinobanksina, canferol, canferide e pinostrobina foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, Germany).

Extratos etanólicos de própolis bruta (E)

Um grama de própolis bruta foi extraída com 25 mL de etanol (P.A., 95%) sob agitaçao magnética. Após agitaçao à temperatura ambiente durante 48 h, estas soluçoes foram filtradas. O solvente etanólico foi removido sob pressao reduzida produzindo extrato etanólico de própolis identificados como extratos etanólicos de própolis bruta (E1 - E12).

Amostras de própolis comerciais (C)

Os extratos obtidos do comércio estavam na concentraçao de 30% (m/v), conforme especificaçoes que constam no Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Extrato de Própolis, presente na normativa nº. 03, de 19 de Janeiro de 2001, do Ministério da Agricultura e Abastecimento.⁶ Para a realizaçao dos ensaios de determinaçao do teor em fenólicos e flavonoides totais, capacidade antioxidante, e para a quantificaçao por CLAE-DAD, todos os extratos de própolis comerciais foram evaporados à pressao reduzida e solubilizados em metanol grau espectroscópico de acordo com a concentraçao necessária para a realizaçao dos testes. As amostras foram identificadas como extratos comerciais de própolis (C1 - C12).

Determinaçao do teor de fenólicos totais: método de Folin-Ciocalteau

Uma alíquota de 50 µL da soluçao do extrato de própolis (1,00 mg mL^-1) foi misturado com 2,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu 1:10 e 2,0 mL de soluçao aquosa 4% de Na₂CO₃. Após 5 minutos de incubaçao a 50 ºC, a absorvância foi medida contra um branco (água ultrapura) a 760 nm.⁷ A curva de calibraçao foi preparada com ácido gálico (25 a 1000 µg mL^-1 ; Y = 0,12951 X + 0,12497; R = 0,999). O conteúdo de fenólico total foi expresso em mg E_GA 100 mg ^-1 e as análises foram feitas com três repetiçoes.

Determinaçao do teor de flavonoides totais

Uma alíquota de 400 µL de extrato de própolis (1,00 mg mL^-1) e 200 µL de soluçao metanólica de cloreto de alumínio (2%) foram misturados e diluídos com metanol em balao volumétrico de 10,00 mL. Após 30 minutos a absorvância foi medida a 425 nm contra um branco (metanol).⁸ A curva de calibraçao foi preparada com quercetina (1 - 50 µg mL^-1 ; Y = 0,06553 + 0,04078 X ; R = 0,999). Os resultados foram expressos em mg Q_E 100 mg ^-1 e as análises foram feitas com três repetiçoes.

Ensaio de sequestro de radicais DPPH

Setenta e um microlitros de soluçao de extrato de própolis (10 - 100 µg mL^-1) ou do padrao (5 -500 µmol L^-1) foram misturados com 29 µL de uma soluçao 0,3 mmol L^-1 de DPPH em metanol.⁹ A mistura foi deixada em repouso durante 30 min no escuro e, em seguida, a absorvância foi medida a 517 nm utilizando um leitor de microplacas de ELISA 680 (Bio-Rad, Brasil). Os resultados foram expressos em CE₅₀ (µg mL^-1).

Determinaçao da atividade antioxidante pela Captura do Radical-Cátion (ABTS^.+)

Uma alíquota de 50 µL do extrato de própolis (1,00 mg mL^-1) foi misturado com 5,0 mL do reagente de ABTS e, após 6 minutos, foi realizada a leitura da absorbância a 734 nm utilizando álcool etílico como o branco.¹⁰ A curva de calibraçao foi preparada com Trolox (0,00 - 2,40 mmol L^-1 ; Y = −26,37778 X + 0,65164; R = −0,9997). Os resultados foram expressos em: mmol TE 100 mg^-1 e as análises realizadas com três repetiçoes.

Avaliaçao da atividade antioxidante pelo Método de Reduçao do Ion Férrico (FRAP)

Uma alíquota de 0,5 mL do extrato de própolis (1,00 mg mL^-1) foi misturado com 4,5 mL do reagente de FRAP. Após 10 minutos de incubaçao a 37 ºC foi realizada a leitura da absorbância a 593 nm, utilizando água ultrapura como branco.¹¹ A curva de calibraçao foi preparada com FeSO₄.7H₂O (100 - 1000 µM ; Y = 0,0018 X + 0,00107; R = 0,99961) e os resultados expressos em: mmol Fe(II) 100 mg^-1. As análises foram realizadas com três repetiçoes.

Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-DAD)

Os perfis cromatográficos dos diferentes extratos de própolis foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD, Shimadzu), constituído por duas bombas série LC-20AT, detector de arranjo de díodos série SPD-M20A e autoinjetor SIL-10A. O controle do equipamento e aquisiçao dos dados foi feito através do software LCSolution (Shimadzu). As análises foram realizadas em coluna analítica de fase reversa Betasil C-18 (250 x 4,6 mm, 5 µm de partícula, Thermo) mantida a 30 ºC, com taxa de fluxo constante de 1,0 mL min^-1. A fase móvel foi constituída por uma mistura de água: ácido acético (99:1, solvente A) e metanol (100, solvente B), e um gradiente linear foi realizado começando com 30% de metanol até 92% durante 35 min. Todas as soluçoes de extrato de própolis foram preparadas em metanol grau espectroscópico a 1000 µg mL^-1 e 20 µL foram injetados após serem filtrados através de um filtro de seringa (13mm, porosidade de 0.45 µm, PVDF, Analítica). A identificaçao das substâncias presentes nos extratos foi baseada na comparaçao dos tempos de retençao e suas curvas no UV com os de padroes autênticos, e a quantificaçao foi realizada usando dados de calibraçao externo para os mesmos compostos. Cada padrao foi analisado individualmente e o monitoramento dos cromatogramas foi realizado a 280 e 320 nm. Na Tabela 2 estao definidas as equaçoes da reta, a linearidade (R) e a faixa de concentraçao de cada padrao. Todas as análises foram realizadas em três repetiçoes. Os resultados quantitativos foram expressos em mg de composto por 100 mg de extrato.

Análise estatística

Para efetuar a análise de componentes principais (PCA) foi utilizado o software The Unscramble^® 10.3. As análises químicas foram realizadas em triplicata para a construçao da matriz de dados 24 x 18 (vinte e quatro amostras e dezoito variáveis). Os dados foram autoescalados, centrados na média e foi utilizada a validaçao cruzada na realizaçao do PCA.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Conteúdo de fenólicos totais (TP) e conteúdo de flavonoides totais (TF)

A determinaçao do teor de fenólicos totais (TP) presentes nas amostras foi feita pelo método espectrofotométrico utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau com modificaçoes.⁷ Os resultados estao expressos na Tabela 3. Para os extratos de própolis verde in natura (E) os valores de TP variaram de 1,37 - 14,43 mg E_GA 100 mg^-1, enquanto os resultados encontrados nos extratos comerciais (C) apresentaram valores bem superiores, variando de 4,05 - 122,68 mg E_GA 100 mg^-1, e os resultados foram expressos por meio de uma curva padrao de ácido gálico (R= 0,999).

O teor de flavonoides (TF) foi determinado pelo método de complexaçao por cloreto de alumínio que é específico para flavonas e flavonóis. Para a quantificaçao foi utilizada uma curva analítica de quercetina como padrao (R= 0,999). Os resultados de TF para os extratos in natura (E) variaram de 0,63 - 9,71 mg E_Q 100 mg^-1, e foram semelhantes aos encontrados para as tinturas comerciais (C) 0,16 - 9,13 mg E_Q 100 mg^-1.

Segundo a legislaçao brasileira vigente os extratos etanólicos de própolis devem conter, no mínimo, 0,25% de flavonoides e 0,50% de fenólicos.⁶ Neste trabalho o conteúdo médio de compostos fenólicos e flavonoides foi de 0,89 g% e 0,50 g% para os extratos de própolis verde coletados (E), e de 8,29 g% e 0,50 g% para as tinturas comerciais (C), respectivamente, indicando que todas as amostras estavam dentro dos padroes estabelecidos pela legislaçao quanto a esses dois parâmetros. Como a composiçao química da própolis é dependente da localizaçao geográfica, a relaçao entre os teores de fenólicos e flavonoides totais está relacionada com a flora e regiao da coleta,¹² bem como podem variar de acordo com o solvente usado na obtençao do extrato de própolis. Assim, os valores superiores de TP obtidos para os extratos comerciais podem estar relacionados à característica mais polar do solvente de extraçao (etanol 70%), bem como por serem extratos mais concentrados, na faixa de 30% (m/v), já que para os extratos de própolis verde coletados o solvente extrator foi um pouco menos polar (etanol 95%) e a concentraçao dos extratos nao ultrapassou 4% (m/v).

Atualmente existe um grande interesse no estudo das substâncias com propriedades antioxidantes, devido, principalmente, às descobertas sobre o efeito dos radicais livres no organismo. Na Tabela 3 estao apresentados os resultados da capacidade antioxidante dos extratos de própolis bruta e comercial realizados por três diferentes métodos: DPPH, ABTS e FRAP, que sao amplamente utilizados devido à simplicidade, rapidez, sensibilidade e reprodutibilidade.

Os resultados obtidos para ambos os extratos (E e C) neste trabalho, utilizando o ensaio com DPPH, foram expressos como CE₅₀ e variaram entre 19,36 a 100,32 µg mL^-1. Entre as amostras, observa-se que existe correlaçao significativa entre a quantidade de TF e a capacidade antioxidante (DPPH), como no caso da amostra C4, que apresentou teor mais elevado de TF e o melhor valor de CE₅₀. Este fato nao pode ser atribuído ao conteúdo de TP, visto que nao se observou uma correlaçao significativa com a capacidade antioxidante, como observado na amostra C7. Outro fator que também poderia ter contribuído para a menor capacidade antioxidante das amostras decorreu do fato das mesmas apresentarem-se ricas em cera e substâncias nao polares, como foi observado na amostra E3. Estes resultados indicam que a concentraçao total de compostos fenólicos ou flavonoides nao é o único fator responsável pelas propriedades antioxidantes. A natureza química das substâncias fenólicas e, talvez, a presença de outros derivados contribuam para a capacidade antioxidante total dos extratos. A forte capacidade antioxidante na própolis pode vir dos flavonoides, como canferol e canferide, porém, os fenólicos podem participar juntos com os flavonoides na determinaçao dessas atividades antioxidantes.

De maneira geral, as amostras C4 e E12 apresentaram os melhores resultados de atividade antirradicalar. Os valores de capacidade antioxidante em FRAP, ABTS e DPPH foram de 657,74 e 608,85 mmol Fe(II) 100 mg^-1; 246,83 e 142,68 mmol TE 100 mg^-1; 19,36 a 32,98 mg mL^-1, respectivamente.

Apesar dos extratos comerciais terem apresentado valores mais elevados de TP quando comparados aos extratos in natura, esse resultado nao refletiu diretamente em um aumento na capacidade antioxidante. Para auxiliar no entendimento e visualizaçao das potenciais correlaçoes entre estes diferentes parâmetros foi desenvolvida uma matriz de correlaçao (Tabela 4). Os resultados demonstraram uma correlaçao positiva com aumento do teor de flavonoides totais (TF) influenciando a capacidade antioxidante total. Essa matriz revelou alta correlaçao entre o teor de flavonoides (TF) e o potencial antioxidante realizado pelos três métodos: FRAP (r = 0,87), DPPH (r = -0,74) e DPPH (r = 0,74). Em relaçao aos fenólicos (TP) nao foram encontradas correlaçoes significativas. Uma análise mais detalhada da Tabela 3 mostrou que a capacidade antioxidante da própolis nao pode ser relacionada à concentraçao de compostos fenólicos, uma vez que a amostra E12 teve o dobro da concentraçao de fenólicos quando comparada a C4, e esta teve maior atividade antirradicalar.

Atualmente, a própolis tem sido usada como uma terapia alternativa em virtude de seus benefícios medicinais e até mesmo na forma de alimento funcional. A sua comercializaçao ocorre na maior parte na forma de extratos alcoólicos ou hidroalcoólicos.¹³

O aumento do consumo dessas tinturas leva a uma preocupaçao sobre a necessidade de se conhecer a sua composiçao química a fim de tentar estabelecer uma correlaçao entre as substâncias identificadas e as suas propriedades biológicas. Assim, é importante se preocupar para que durante o processo de preparaçao do extrato nao se deteriore o produto, e dessa forma seja assegurada a qualidade dos extratos para aplicaçao terapêutica.

Este trabalho apresentou uma comparaçao entre composiçao química e a atividade antioxidante de amostras de extratos de própolis verde in natura e tinturas que sao comercializadas em diferentes regioes do sudeste brasileiro, a fim qualificar o seu perfil químico.

De acordo com estes dados, as tinturas de própolis etanólicas encontradas no comércio apresentaram um bom teor de fenólicos e flavonoides. Além disso, foi possível determinar a capacidade antioxidante e estabelecer a composiçao química por CLAE-DAD que foi semelhante aos das amostras de própolis in natura.

Identificaçao dos constituintes fenolicos usando CLAE-DAD

Os dois grupos de própolis avaliadas neste trabalho apresentaram composiçao qualitativa semelhantes por CLAE-DAD, e treze subtâncias foram identificadas. A caracterizaçao do perfil químico dos diferentes extratos de própolis foi realizada por comparaçao dos tempos de retençao (t_R) e absorçoes máximas no espectro de UV com padroes autênticos. A análise revelou a presença de derivados de ácidos fenólicos, aldeído, flavonoides glicosilados e agliconas. Entre os extratos analisados foi possível identificar e quantificar vanilina, hesperidina, naringenina, pinostrombina, pinobanksina, canferol e canferide, além dos ácidos clorogênico, caféico, para-cumárico, ferúlico, rosmarínico e artepilin C, em ambos os extratos, própolis in natura (E) e tinturas comerciais (C). Cabe destacar a presença em todos os extratos de artepillin C (ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico), substância considerada um biomarcador da própolis verde comum na regiao sudeste.¹⁴

Na Figura 1 estao apresentados os cromatogramas das amostras E12 e C4. Nestas duas amostras foram identificadas as substâncias: ácido clorogênico (CLA), ácido caféico (CA), ácido ferúlico (FA), ácido para-cumárico (p-CA), ácido rosmarínico (RA), artepillin-C (ArtC), hesperidina (H); naringenina (N), pinobanksina (PK), canferol (K), canferide (C) e pinostronbina (PT). Os ácidos para-cumárico, clorogênico e caféico, assim como o artepillin C sao citados na literatura como constituintes de própolis verde.¹⁵

Figura 1. Cromatogramas obtidos em coluna C-18 (25 cm x 4,6 mmx 5 µm), fluxo de 1,0 mL min^-1, fase móvel: água: ácido acético (99:1, solvente A) e metanol (100, solvente B), DAD a 280 nm para as amostras E12 e C4

Os ácidos cafeico, para-cumárico e artepillin C, e os flavonoides galangina, pinocembrina e pinobanksina também foram identificados nos extratos de própolis verde da Africa do Sul,¹⁵ sendo semelhante ao encontrado nos extratos E e C. Da mesma forma, em própolis verde chinesa, também foram identificados os ácidos caféico, para-cumárico, ferúlico, além de pinobanksina, naringenina, canferol, pinocembrina e galangina.¹⁶

A avaliaçao da capacidade antioxidante das substâncias identificadas nos extratos foi determinada individualmente com a finalidade de se tentar estabelecer uma possível correlaçao entre as substâncias que foram identificadas e quantificadas nos extratos de própolis e a sua propriedade antirradicalar. Na Tabela 5 sao apresentados os tempos de retençao, as curvas no UV e a capacidade antioxidante (CE₅₀) das substâncias padroes que foram identificadas nos extratos.¹⁷

Na Tabela 6 estao apresentados os resultados de quantificaçao das substâncias identificados nos extratos, expressos em mg por 100 mg de extrato. Dos resultados obtidos para as amostras C4 e E12 foi possível observar a presença dos ácidos clorogênico (0,21 e 3,32 mg 100 mg^-1), ferúlico (0,93 e 3,26 mg 100 mg^-1) e rosmarínico (2,53 e 8,33 mg 100 mg^-1), além dos flavonoides canferide (2,14 e 3,99 mg 100 mg^-1) e canferol (0,22 e 0,55 mg 100 mg^-1) e o Artepillin C (7,45 e 1,16 mg 100 mg^-1), respectivamente. Com isso, para esses extratos, foi possível estabelecer uma relaçao entre as substâncias identificadas com os melhores resultados da capacidade antioxidante (Tabela 2). Todas essas substâncias identificadas nesses extratos apresentam CE₅₀ inferiores a 24,00 µg mL^-1, o que pode corroborar para os melhores resultados de capacidade antirradicalar dessas amostras.

Um dos objetivos na utilizaçao da análise multivariada foi reduzir a representaçao dimensional dos dados e, assim, organizá-los em uma estrutura que facilite a visualizaçao de todo o conjunto de dados.¹⁸ Para melhor comparar os extratos de própolis quanto às variáveis consideradas e correlacionar esses dados com o tipo de substância e atividade antioxidante encontradas foi aplicada a Análise das Componentes Principais (PCA).

Análise quimiométrica

Os métodos estatísticos multivariados consideram as amostras e as variáveis em seu conjunto, permitindo extrair informaçoes complementares que a análise univariada nao consegue discriminar. O método de análise exploratória de dados foi feito pela Análise de Componentes Principais (PCA), que é geralmente uma ferramenta eficiente para reduzir a dimensionalidade dos dados, além de fornecer uma melhor visualizaçao dos agrupamentos entre as amostras. É um método exploratório porque auxilia na elaboraçao de hipóteses a partir dos dados coletados. A análise de PCA foi realizada considerando os doze extratos etanólicos in natura de própolis (E) e as doze tinturas comerciais (C).

A técnica de análise multivariada foi utilizada visando resumir em poucas e importantes dimensoes a maior parte da variabilidade da matriz para a obtençao de relaçoes entre os dados obtidos, extraindo desta maneira a informaçao mais relevante para o resultado.

A partir dos dados de variância determinou-se o número de PCs. Nessa análise foram escolhidos os dois primeiros PCs. As Tabelas 3 e 6 apresentam os conjuntos de dados experimentais utilizados para análise exploratória PCA, que permitiu a construçao de um gráfico de scores (Figura 2). Verificou-se que as componentes PC1 e PC2 descreveram 96% da variaçao total dos dados e forneceram informaçoes discriminatórias das amostras.

Figura 2. Gráfico dos scores de PC-1 x PC-2

A primeira componente principal (PC1) descreve 80% da variaçao total e a segunda (PC2) 16%. A Figura 3 apresenta o gráfico de scores e observam-se dois agrupamentos. As amostras comerciais (C) estao localizadas na parte superior, enquanto as amostras (E) encontram-se na parte inferior do gráfico. Apesar dos extratos in natura (E) e das tinturas comerciais (C) apresentarem os parâmetros químicos semelhantes, foi possível observar a discriminaçao em dois grupos distintos no gráfico de scores. Já o gráfico de loadings na Figura 3 mostrou a influência das variáveis sobre as amostras.

Figura 3. Gráfico dos loadings

Atráves da análise do gráfico de loadings foi possível identificar as váriaveis que contribuiram para a discriminaçao entre as amostras in natura (E) e comerciais (C). As substâncias hesperidina, canferol e os ácidos para-cumárico, clorogênico, ferúlico e rosmarínico foram importantes para a construçao do gráfico, assim como os dados oriundos das análises de ABTS, FRAP e TP. Deve-se destacar a importante contribuiçao das substâncias quantificadas, que mesmo sendo identificadas em ambos os tipos de extratos em concentraçoes semelhantes, exerceram um poder discriminante das amostras avaliadas.

CONCLUSAO

Neste estudo, determinou-se que a quantidade total de compostos fenólicos, flavonoides e a capacidade antioxidante foram parâmetros importantes para avaliar e comparar a qualidade de extratos in natura e tinturas comerciais a partir da própolis verde brasileira. A atividade antioxidante foi comprovada por dois mecanismos (sequestrante de radical livre e oxi-reduçao). Os resultados da determinaçao de teores de fenólicos e flavonoides, o potencial antioxidante (DPPH, ABTS e FRAP), assim como a identificaçao e quantificaçao de treze substâncias foram usados para estabelecer uma comparaçao e indicar uma diferença entre os extratos etanólicos de amostras in natura e das tinturas comerciais. As amostras diferiram entre si em relaçao aos conteúdos de fenólicos e flavonoides totais, bem como na quantificaçao das susbtâncias analisadas por CLAE-DAD. Essas variaçoes entre as amostras já eram esperadas, considerando-se que a diferença entre os extratos de própolis pode está relacionada com a flora e regiao da coleta, bem como pode variar de acordo com o solvente de extraçao usado na obtençao do extrato de própolis. Os resultados obtidos neste estudo confirmam a influência da origem da matéria-prima na composiçao química e nas características dos extratos de própolis. Apesar desta diversidade química, todos os extratos de própolis mostraram uma significativa capacidade antioxidante e, na maioria dos casos, pode-se sugerir que as substâncias responsáveis foram os constituintes fenólicos presentes na própolis. Finalmente, deve-se observar que a análise exploratória dos dados permitiu a obtençao de informaçoes rápidas e eficientes sobre a similaridade entre as amostras de própolis pela visualizaçao gráfica, indicando assim a sua procedência in natura ou comercial.

MATERIAL SUPLEMENTAR

O material suplementar está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF com acesso livre, e contém os cromatogramas dos extratos in natura e tinturas comerciais.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem as instituiçoes de fomento à pesquisa CNPq, FAPERJ e CAPES pelo auxílio financeiro e pela bolsa de estudo.

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#This paper is part of the PubliSBQ Special Issue in honor of the late Prof. Angelo da Cunha Pinto.