JBCS

INTRODUÇAO

Há um crescente interesse em estudos direcionados às alternativas para a síntese de novos complexos bioativos. Uma estratégia interessante e eficaz é fazer uso de ligantes (moléculas orgânicas) oriundos de produtos naturais, semi-sintéticos ou sintéticos, que apresentem atividade biológica comprovada.^1-4 O objetivo do uso de ligantes que já possuem atividade biológica é produzir um complexo que apresente efeito aditivo ou sinérgico, fazendo com que o candidato a fármaco apresente todas as potencialidades do ligante aliado ao íon metálico, que também apresente atividade. Os complexos que apresentam ligantes bioativos sao denominados híbridos.

Complexos híbridos, por apresentar duas parcelas funcionais bioativas, vêm sendo desenvolvidos na perspectiva de contornar fatores de resistência, principalmente aos fatores de resistência às múltiplas drogas (do inglês, multi-drug resistance - MDR); superar toxicidade sistêmica ou para melhorar a relaçao açao versus eliminaçao, através do controle cinético e termodinâmico das reaçoes envolvidas nos processos de substituiçao nucleofílica em complexos.^5,6 Além disso, os híbridos precisam apresentar vantagens quando comparados ao ligante livre isoladamente, por isso a escolha do ligante deve ser feita levando em consideraçao alguns critérios, como baixa toxicidade e efeitos colaterais brandos. Baseado nisso, o uso de produtos naturais tem sido uma alternativa promissora na busca de novos complexos híbridos.

A piplartina, 5,6-di-hidro-1-[1-oxo-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-propenil]-2(1H)-piridinona (Figura 1), é uma amida de ocorrência natural isolada principalmente de espécies de plantas da família Piperaceae, sendo as espécies de Piper longum, P. tuberculatum, P. arborescens, P. chaba, P. Sylvaticum, P. cenocladum P. alatabaccum e P. puberulum consideradas fontes naturais de piplartina.⁷ Esta amida tem sido amplamente investigada devido as suas diversas e potentes atividades biológicas como as atividades antitumoral, ansiolítica, leishmanicida, antifúngica, antiagregante plaquetário, tripanocida e antinocepitiva,^7,8 sendo um relevante modelo de molécula como protótipo para planejamento e desenvolvimento de novos fármacos.

Figura 1. Estrutura química da piplartina

A piplartina em testes in vivo apresentou efeito ansiolítico na dose de 50 mg/kg em camundongos, um potente efeito leishmanicida na dose de 30 mg/kg e atividade antitumoral em animais com sarcoma 180 nas doses de 50 e 100 mg/kg/dia.^9-11 Em testes antifúngicos de bioautografia, a piplartina inibiu o crescimento do fungo fitopatogênico Cladosporium cladosporioides na concentraçao de 0,5 µg/µL.¹² A piplartina exibiu atividade antibacteriana frente às bactérias patogênicas Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus em testes usando o método de difusao em disco com raios de inibiçao 24, 20 e 16 mm, respectivamente.¹³

Derivados sintéticos da piplartina têm sido alvo de estudo para obtençao de compostos ativos com atividades antitumoral, antimicrobiana, inibidor da atividade da enzima aldose redutase e anti-inflamatória.^14-16 Estudo prévio da relaçao estrutura-atividade da piplartina mostrou que derivados contendo o halogênio cloro no carbono α-carbonílico do anel piperidínico aumentam a citoxicidade da piplartina, inibindo o crescimento tumoral in vivo para o câncer de pulmao em 48,5% na dose de 2 mg/kg.¹⁷ Estudos químicos e biológicos com a piplartina relatados previamente nao têm sido direcionados para obtençao de complexos metálicos, sendo que muitos destes sistemas híbridos apresentam potentes atividades biológicas.¹⁸

O uso farmacológico de complexos de vanádio (IV e V) tem sido amplamente relatado na literatura,^19-21 isto devido aos efeitos insulino-miméticos e anti-diabéticos, in vitro ou in vivo, potenciais agentes antitumorais, anti-inflamatórios, antiparasitas, antivirais, antibacterianos e fungicidas. Considerando o potencial biológico da piplartina e dos complexos de vanádio (IV), o presente estudo foi direcionado para síntese e caracterizaçao de um complexo de óxido-vanádio tendo como ligante a piplartina, e a avaliaçao de seu potencial antimicrobiano.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes e solventes

Os reagentes usados foram obtidos comercialmente com pureza P.A.: Acetato de etila (Dinâmica^®), éter dietílico (Anidrol^®), metanol (Isofar^®), etanol (Dinâmica^®), hexano (Fmaia^®), clorofórmio deuterado (Sigma) e Sulfato de vanadila (VOSO₄.5H₂O) (99%) Aldrich^®.

Equipamentos

As curvas de TG da piplartina e do respectivo complexo de vanadila (TGA) foram obtidas através de um equipamento TGA 50/50 da Shimadzu com cadinho de platina, usando como gás de arraste o nitrogênio (50 mL min^-1), com razao de aquecimento de 10º C/min e uma faixa de temperatura de 30 a 800 ºC. Os espectros de infravermelho foram obtidos em um espectrofotômetro modelo 640 - IR, com faixa do espectro de 400 a 4000 cm^-1, com as amostras preparadas em pastilhas de KBr. O ponto de fusao foi obtido em um equipamento PFM-II-Tecnopono. O espectro de massas do complexo foi obtido em um espectrômetro Waters Xevo-G2-XS-QTof em módulo positivo com ionizaçao por eletrosplay. O espectrofotômetro de infravermelho utilizado foi modelo 640 - IR da Varian. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H e ¹³C foram obtidos através de um aparelho Varian Mercury - 300 e 75 MHz, respectivamente, usando CDCl₃ como solvente. Os espectros de absorçao eletrônica foram obtidos fazendo uso de um espectrofotômetro UV-Vis, modelo 8453 da Agilent^®, com cubeta de quartzo de 1 cm e faixa espectral de 200 a 800 nm, usando como solvente CHCl₃.

Extraçao da piplartina

As raízes de Piper tuberculatum foram coletadas na reserva de Dois Irmaos na cidade de Recife - PE. O material vegetal foi autenticado pela Dra. Angela Maria de Miranda Freitas, curadora do herbário Sérgio Tavares - UFRPE, do Departamento de Ciência Florestal, local onde a exsicata foi preparada e depositada sob o número: HST 18179. As raízes foram secas em estufa a 50 ºC por 48 h e posteriormente trituradas em moinho de facas, resultando em 165 g do material, que foi submetido à extraçao por maceraçao a frio por três vezes com uma mistura de 300 mL de éter dietílico: acetato de etila (2:1). Após a filtraçao o solvente foi removido em evaporador rotatório a 40º C sob pressao reduzida para fornecer 2,8 g de extrato bruto seco com presença de sólidos cristalinos. O extrato foi lavado com metanol por 3 vezes para obter 0,8 g de um sólido branco que foi caracterizado por RMN de ¹H e ¹³C.

Síntese do complexo

O complexo de vanádio (IV) com a piplartina foi obtido a partir da mistura de uma soluçao de piplartina (0,50 mmol, 48,6 g) em 10 mL de etanol com a soluçao de sulfato de vanadila hidratado (0,25 mmol, 12,12 g) em 20 mL de água destilada em agitaçao por 24 h (Esquema 1). A mistura reacional foi rotaevaporada e posteriormente liofilizada, obtendo um sólido esverdeado.

Esquema 1. Síntese do complexo híbrido vanadila-piplartina (código V-PIP)

Atividade biológica

Culturas de microrganismos

O potencial antimicrobiano da piplartina e do composto de coordenaçao foi avaliado frente às bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus (UFPEDA 02), Bacillus subtilis (UFPEDA 86), Enterococcus faecalis (UFPEDA 138) e as bactérias gram- negativas: Escherichia coli (UFPEDA 224), Klebsiella pneumoniae (UFPEDA 396), Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA 416), bem como para o fungo filamentoso Microsporum gypseum (UFPEDA 2565). As bactérias e fungo foram provenientes da coleçao de microrganismos do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. A suspensao dos microrganismos foi padronizada pela turvaçao equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland em água destilada, correspondente a uma concentraçao de aproximadamente 10⁸ UFC/mL para bactérias e 10⁷ UFC/mL para fungos.²¹

Determinaçao da Concentraçao Mínima Inibitória (CMI)

A CMI foi realizada através da técnica de microdiluiçao em multiplacas com 96 poços.²¹ Os meios de cultura empregados foram o Agar Sabourand (para fungo) e Agar Muelle-Hinton (para bactérias). O Metronidazol (2,5 µg/mL) e Fluconazol (2,5 µg/mL) foram usados como controle positivo, enquanto o álcool etílico como controle negativo. As análises foram realizadas em triplicata e as microplacas foram cultivadas à 37 ºC por 18-24 h para bactérias e 30 ºC por 48-72 h para o fungo. Após o período de cultivo, as microplacas foram reveladas com a adiçao de 10 µL da soluçao de risazurina a 0,01% e incubadas por 3 h.²³ A CMI foi definida como a menor concentraçao da amostra que inibiu o crescimento do microrganismo, com concentraçao final de 2500 µg mL^-1.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Um sólido cristalino com ponto de fusao de 122,2 ºC foi isolado das raízes de P. tuberculatum com rendimento de 30,8% em relaçao à massa extrato bruto e 1,7% em relaçao à massa das raízes secas, sendo caracterizado como a piplartina, após interpretaçao e comparaçao de seus dados espectrais de IV, RMN ¹H e ¹³C com os dados relatados previamente.²⁴

O complexo híbrido produzido se apresentou na forma de um sólido de coloraçao verde com rendimento reacional de 75%, e solubilidade em água e metanol. Os espectros de absorçao eletrônica da piplartina e do complexo V-PIP sao mostrados na Figura 2.

Figura 2. Espectros de absorçao eletrônica do ligante piplartina (A), e do complexo V-PIP (B e C), com janela de 200-800 nm e ampliaçao da regiao entre 400-800 nm, respectivamente

O espectro de absorçao da piplartina apresentou uma absorçao máxima em 210, 220 e 325 nm, associados a transiçoes π→π*, sendo a banda em 325 nm associada aos cromóforos dos dois grupos α,β-insaturados. Analisando o espectro de absorçao eletrônica do V-PIP é possível observar deslocamento hipsocrômico nas duas primeiras bandas, que no complexo estao em 200 e 210 nm (erro associada à medida ≤ 4 nm). Essa similaridade entre os espectros de absorçao deve-se ao íon vanadila estar coordenado a sítios que apresentam bandas de baixa intensidade (transiçoes proibidas). No espectro de absorçao do complexo V-PIP, na regiao do visível - Figura 2 (C) observa-se uma banda de absorçao em 800 nm (regiao do vermelho, complexo com coloraçao verde) referente à transiçao d-d do íon vanadila, que segundo sua configuraçao eletrônica (d¹) apresenta apenas uma banda de absorçao, corroborando com o esperado segundo o Diagrama de Orgel. Na Figura 3 sao apresentados os espectros de infravermelho da piplartina e do complexo V-PIP.

Figura 3. Espectros de Infravermelho do VOSO₄ (A), piplartina (B) e V-PIP (C)

O espectro de infravermelho do VOSO₄, Figura 3(A), apresentou a banda característica da ligaçao V=O (íon vanadila - VO²⁺) em 990 cm^-1, e duas bandas na regiao de 3432 e 3322 cm^-1 referentes a moléculas de água livres e coordenadas, respectivamente. Ao comparar o espectro de infravermelho da piplartina com o complexo V-PIP, observa-se a presença de uma banda em 910 cm^-1, no complexo, referente ao estiramento V=O presente no complexo.²⁵ Esta banda encontra-se deslocada quando comparado ao espectro de infravermelho do sulfato de vanadila, devido à coordenaçao do íon vanadila às carbonilas presentes na estrutura da piplartina. Outra evidência desta coordenaçao é o deslocamento da banda de estiramento C=O na piplartina (1700 cm^-1) e no complexo V-PIP (1684 cm^-1). Este deslocamento de banda nao se assemelha aos casos de coordenaçao de metais às β-dicetonas em que o próton alfa foi removido, propiciando a ressonância entre as carbonilas existentes. Apesar disso, a coordenaçao do íon vanadila às carbonilas da piplartina é sugerida, uma vez que, segundo a equaçao para determinaçao do número de onda, em um oscilador harmônico, a constante de força da ligaçao C=O diminui e a massa reduzida aparente aumenta. Em ambos os espectros do complexo e do ligante apresentaram bandas intensas de deformaçao axial de C−O−C em 1129 cm^-1, referentes às metoxilas aromáticas. No complexo V-PIP também sao observadas duas bandas em 3432 e 3322 cm^-1 referentes a moléculas de água livres (águas de hidrataçao) e coordenadas, respectivamente. Na Figura 4 sao apresentadas as curvas de TG da piplartina e V-PIP, sobrepostos.

Figura 4. Curvas de TG do ligante piplartina e do complexo V-PIP, sobrepostos

A curva de TG da piplartina, Figura 4(A), apresentou três eventos térmicos simultâneos, sendo o final em 760 ºC e correspondente a um resíduo de 7,5% em massa. Este percentual corresponde a um resíduo de 2C, pois a medida foi realizada em atmosfera redutora. A temperatura onset observada foi de 263 ºC.

No caso da curva de TG do complexo V-PIP, Figura 4(B), foram observados quatro eventos térmicos, e a temperatura onset foi em 210 ºC (retirando o evento associado a moléculas de água). O primeiro evento em 100 ºC corresponde a 12,1% em massa, o que corresponde a quatro moléculas de água de hidrataçao na estrutura do complexo. A perda de massa final, em 620 ºC, deixa um resíduo correspondente a 22% em massa, o que se atribui ao VO₂ e 4C (atmosfera redutora). No Esquema 2 sao apresentadas as etapas de perda de massa no complexo V-PIP.

Esquema 2. Decomposiçao do complexo V-PIP por TGA

O espectro de massas do complexo V-PIP é apresentado na Figura 5.

Figura 5. Espectro de massas do complexo V-PIP, analisado em modo positivo, com destaque no pseudo íon molecular [VO(PIP)(H₂O)₂ + K]⁺

Através do espectro de massas do complexo V-PIP, Figura 5, é possível observar o pico referente ao fragmento da massa molecular do composto m/z [M + K]⁺ = 459,3263 Da referente ao pseudo íon molecular do complexo formado. O pico base em m/z = 318,3014 Da foi atribuído a massa molar do ligante piplartina que corresponde ao fragmento do complexo [M - VO - 2H₂O + 1]⁺ e sendo observado também o fragmento do cátion acílio referente ao pico m/z = 221,0847 Da, fragmentaçao principal da piplartina.

Com base nos dados de análise térmica, espectroscopia de infravermelho e espectrometria de massas foi possível propor uma fórmula mínima que corrobore com todos os resultados obtidos, sendo esta [VO(PIP)(H₂O)₂]SO₄.4H₂O. Com base nesta fórmula mínima foi calculado o erro relativo entre a massa calculada (fórmula mínima proposta) e o valor experimental (obtido a partir do espectro de massas), apresentando um valor de 0,03%.

Baseado na interpretaçao dos dados de espectroscopia de absorçao eletrônica, espectroscopia de infravermelho, curvas de TG e espectrometria de massas, o sólido esverdeado obtido da reaçao da piplartina com o sulfato de vanadila foi caracterizado como sendo o complexo V-PIP.

Atividade antimicrobiana

Os valores das CMI estao apresentados na Tabela 1 e o complexo V-PIP apresentou menores concentraçoes capazes de inibir o crescimento das bactérias e fungo quando comparado à piplartina, principalmente para as bactérias gram negativas. A piplartina apresentou CMI que variou de 312,5 a 1250 µg mL^-1, sendo que valores de concentraçoes ≤ 500 µg mL^-1 para material vegetal sao considerados ativos e valores de 600 a 1500 µg mL^-1 sao considerados moderados.^6,27 O complexo V-PIP apresentou valores da CMI que variaram de 156,2 a 625 µg mL^-1, sendo o menor valor observado para a bactéria E. coli com CMI de 156,2 µg mL^-1. O complexo frente o fungo M. gypseum apresentou uma menor CMI (312,5 µg mL^-1) quando comparado com a CMI (625 µg/mL) do ligante piplartina. O sulfato de vanadila usado na síntese do complexo V-PIP também apresentou atividade antimicrobiana, principalmente frente à bactéria gram negativa K. Pneumonial com CMI de 156,2 µg mL^-1 e o fungo M. gypseum com CMI de 312,2 µg/mL, revelando-se um antimicrobiano em potencial.

CONCLUSAO

O complexo de piplartina com o íon vanadila foi sintetizado e caracterizado por diversas técnicas, resultando em um composto de coordenaçao de fórmula [VO(PIP)(H₂O)₂]SO₄.4H₂O. Esse complexo, quando comparado a piplartina, apresentou solubilidade em meio aquoso, sendo essa uma propriedade física relevante para compostos candidatos a fármacos. O complexo V-PIP apresentou menores concentraçoes capazes de inibir o crescimento das bactérias e fungo quando comparado com piplartina, principalmente para as bactérias gram negativas, sugerindo que a presença do íon vanadila exerceu um efeito sinérgico sobre a atividade biológica da piplartina. Adicionalmente, o presente estudo revelou o sulfato de vanadila como um promissor composto antimicrobiano. As relevantes mudanças físicas e biológicas da piplartina, quando complexada com sulfato de vanadila e associadas ao potencial biológico da amida e do sal, tornam o novo complexo V-PIP descrito aqui um interessante composto para as investigaçoes de novas atividades biológicas.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros de RMN ¹H e ¹³C bem como as atribuiçoes dos valores dos deslocamentos químicos para a amida piplartina estao disponíveis no http://quimicanova.sbq.org.br (Tabela 1S, Figuras 1S e 2S), em arquivo pdf, com livre acesso.

AGRADECIMENTOS

Ao Centro de Apoio à Pesquisa da UFRPE (CENAPESQ). Ao CNPq pelo apoio financeiro do projeto Universal 14/2013 (Processo: 472382/2013-6). A CAPES pela bolsa de mestrado concedida.

REFERENCIAS

1. N'soukpoé-Kossi, C. N.; Descôteaux, C.; Asselin, E.; Tajmir-Riahi, H.-A.; Bérubé, G.; DNA Cell Biol. 2008, 27, 101.

2. Schobert, R.; Bernhardt, G.; Biersack, B.; Bollwein, S.; Fallahi, M.; Grotemeier, A.; Hammond, G. L.; Chem. Med. Chem. 2007, 2, 333.

3. Huxley, M.; Sanchez-Cano, C.; Browning, M. J.; Navarro-Ranninger, C.; Quiroga, A. G.; Rodger, A.; Hannon, M.; J.; Dalton Trans. 2010, 39, 11353.

4. Schobert, R.; Biersack, B.; Dietrich, A.; Knauer, S.; Zoldakova, M.; Fruehauf, A.; Mueller, T.; J. Med. Chem. 2009, 52, 241.

5. Wang, X.; Guo, Z.; Dalton Trans. 2008, 1521.

6. Wang, L.; Gou, S.; Chen, Y.; Liu, Y.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3417

7. Bezerra, D. P.; Pessoa, C.; Moraes, M. O.; Saker-Neto, N.; Silveira, E. R.; Lotufo, L. V. C.; Eur. J. Pharm. Sci. 2013, 48, 453.

8. Bezerra, D. P.; Pessoa, C.; Moraes, M. O.; Costa-Lotufo, L. V.; Rubio Gouvea, D.; Jabor, V. A. P.; Lopes, N. P.; Borges, K. B.; Lima, M. A. S.; Silveira, E. R.; Quim. Nova 2012, 3, 460.

9. Bezerra, D. P.; Militao, G. C. G.; Oliveira De Castro, F.; Pessoa, C.; Odorico De Moraes, M.; Silveira, E. R.; Lima, M. A. S.; Elmiro, F. J. M.; Costa-Lotufo, L. V.; Toxicol. In Vitro 2007, 21, 1.

10. Bodiwala, H. S.; Singh, G.; Singh, R.; Dey, C. S.; Sharma, S. S.; Bhutani, K. K.; Singh, I. P.; J. Nat. Med. 2007, 61, 418.

11. Bezerra, D. P.; Castro, F. O.; Alves, A. P. N. N.; Pessoa, C.; Moraes, M. O.; Silveira, E. R.; Lima, M. A. S.; Elmiro, F. J. M.; Costa-Lotufo, L. V.; Braz. J. Med. Biol. Res. 2006, 39, 801.

12. Silva, R. V.; Navickiene, H. M. D.; Kato, M. J.; Bolzani, V. S.; Méda, C. I.; Young, M. C. M.; Furlan, M.; Phytochemistry 2002, 59, 521.

13. Prasanna, K. P.; Ganapathy, P. S. S.; Naika, L. R.; Pharmacophore 2010, 2, 141.

14. Kumar, J. U.; Shankaraiah, G.; Kumar, R. S. C.; Pitke, V. V.; Rao, G. T.; Poornim, B.; Babu, K. S.; Sreedhar, A. S.; J. Asian Nat. Prod. Res. 2013, 15, 658.

15. Rao, V. R.; Muthenna, P.; Shankaraiah, G.; Akileshwari, C.; Babu, K. H.; Suresh, G.; Suresh Babu, K.; Kumar, R. S. C.; Prasad, K. R.; Potharaju Ashok Yadav, P. A.; Petrash J. M.; Reddy, G. B. K.; Madhusudana Rao, J.; Eur. J. Med. Chem. 2012, 57, 344.

16. Seo, Y. H.; Kim, J-K.; Ju, J-G.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 5727.

17. Wu, Y.; Min, X.; Zhuang, C.; Li.; J.; Yu, Z.; Dong, G.; Yao, J.; Wang, S.; Liu, Y.; Wu, S.; Zhu, S.; Sheng, C.; Wei, Y.; Zhang, H.; Zhang, W.; Miao, Z.; Eur. J. Med. Chem. 2014, 82, 545.

18. Olar, R.; Dogaru, A.; Marinescu, D.; Badea, M.; J. Therm. Anal. Calorim. 2012, 110, 257.

19. Thompson, K. H.; Lichter, J.; Lebel, C.; Scaife, M. C.; McNeill, J. H. Orvig, C.; J. Inorg. Biochem. 2009, 554, 558.

20. Thompson, K. H.; Orvig, C.; Coord. Chem. Rev. 2011, 219, 1053.

21. Pessoa, J. C.; Etcheverry, S.; Gambino, D.; Coord. Chem. Rev. 2014, 301, 24.

22. Clinical and Laboratory Standards Institute; Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts and Filamentous Fungi. Approved standard: M27-A3 e M38-A2. Wayne (PA): CLSI, 2008.

23. Clinical and Laboratory Standards Institute; Performance Standadrds for Antimicrobial Susceptibility Testing. Twentieth Informational Supplement: M100-S20 e M100-S20-U. Wayne (PA): CLSI, 2010.

24. Duh C-Y.; Wu, Y-C.; Wang, S-K.; Phytochemistry 1990, 29, 2689.

25. Mosmann, T.; J. Immunol. Methods. 1983, 63, 65.

26. Barbosa, A. C.; Dissertaçao de Mestrado, Universidade de Sao Carlos, Brasil, 2005.

27. Wong-Leung, Y. L.; Fitoterapia 1988, 69, 11.