JBCS

INTRODUÇAO

O género Croton (Euphorbiaceae) compreende aproximadamente 1300 espécies que se distribuem pelas regioes tropical e subtropical nos dois hemisférios. Estas espécies sao importantes na medicina tradicional da Africa, Asia e América do Sul.¹ A Croton gratissimus Burch. (C. zambesicus Mϋll. Arg.; C. microbotryus Pax.) encontra-se na Africa subsariana, crescendo em encostas rochosas das regioes quentes e secas do noroeste da Africa do Sul até ao Corno de Africa.^2,3

Todas as partes da C. gratissimus sao usadas para fins medicinais. As folhas sao aromáticas e frequentemente utilizadas como infusoes para tratar a tosse e a febre. As raízes sao usadas para tratar problemas no peito, tosse, febre e doenças sexualmente transmissíveis, como sífilis. A casca da raiz é frequentemente usada para tratar sangramentos gengivais, distúrbios abdominais, inflamaçoes da pele, dores de ouvidos e doenças no peito. As combinaçoes da raiz e da casca sao usadas para tratar distúrbios respiratórios.^2,4

Estudos anteriores sobre a composiçao química da C. gratissimus revelaram a presença de cembranolidas, lupeol, α-glutinol e 4(15)-eudesmeno-1β,6α-diol na casca do caule,² e cembranolidas, lupeol, α-glutinol e 24-etilcolesta-4,22-dien-3-ona,³ kaempferol-3-O-β-6''(p-coumaroil) glucopiranosídeo (tilirosida), apigenina-6-C-glucosídeo (isovitexina) e kaempferol⁵ nas folhas. Estudos prévios sobre a C. gratissimus focaram-se sobre as folhas,^3-7 a partir das quais foram identificados principalmente cembranolidas,^2,3 trachilobanos e isopimaranos.⁵ A partir da casca do caule foram isolados clerodanos e trachilobanos.⁶

A Medicina Tradicional (MT) foi, pela primeira vez, reconhecida na Declaraçao de Alma Ata em 1978, indicando a importância dos terapeutas tradicionais na prestaçao de cuidados primários de saúde.⁸ A importância da MT foi reafirmada na Declaraçao de Beijing,⁹ que na sua alínea III reconhece o progresso de muitos governos na integraçao da MT nos seus serviços nacionais de saúde. No entanto, afirma no seu parágrafo IV que a MT deve ser desenvolvida através da investigaçao e inovaçao, a qual foi definida na 16ª Assembleia Mundial de Saúde na resoluçao WHA 61.21 em 2008.¹⁰ Uma das vias que tem sido estudada é a validaçao dos usos das diferentes plantas através de estudos da composiçao química, atividade biológica e determinaçao dos compostos ativos.

Nesta linha, o nosso grupo tem avaliado plantas medicinais angolanas,^11-13 como é o caso da C. gratissimus angolana, que foi estudada para estabelecer a sua composiçao química e determinar a semelhança ou dissemelhança com outras plantas recolhidas na Africa do Sul e Benin.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais

Os espectros de RMN foram obtidos no Bruker Avance III de 400 MHz (400 MHz ¹H e 100,6 MHz ¹³C). Os deslocamentos químicos foram registrados em δ (ppm), tomando-se como padroes de referência interna o CHCl₃ residual (δ 7,26 ppm para o ¹H e 77,00 ppm para o ¹³C) ou o MeOH (δ 3,31 ppm para o ¹H e 49,00 ppm para o ¹³C). Os solventes deuterados utilizados nas análises foram o clorofórmio deuterado (CDCl₃) e o metanol deuterado (CD₃OD). As constantes de acoplamento (J) foram citadas em Hertz (Hz). Os espetros de absorçao na regiao do infravermelho foram obtidos num Termo Scientific Nicolet iS10 FTIR como filme capilar em células de NaCl ou ATR usando um cristal de diamante. Para a cromatografia em coluna utilizou-se como adsorvente sílica gel Schalau G-60, 70-230 mesh (ref. 1.07734). A razao entre a substância a cromatografar e o adsorvente foi de 1:100. As cromatografias flash foram realizadas em colunas sob pressao usando como adsorvente sílica gel para cromatografia flash Schalau G-60, 230-400 mesh (ref. Ge 0048). As cromatografias em camada fina foram executadas em placas de sílica gel DC- Fertigfolien Alugram^® Xtra Sil G/UV pré-preparadas em suporte de alumínio (Ref. 818.333). As placas foram previamente analisadas por irradiaçao com luz U.V. de λ = 366 nm, para visualizar as substâncias fluorescentes. A sua revelaçao deu-se através da pulverizaçao da placa com uma soluçao de ácido fosfomolíbdico em etanol a 5%, seguida de aquecimento a 120 ºC durante alguns minutos. Os solventes utilizados foram: hexano comercial da firma Valente e Ribeiro destilado num aparelho de destilaçao piloto Winkler TST-II, clorofórmio Carlo Erba Ref. 438603, metanol Carlo Erba Ref. 524102, acetato de etilo Fisher Chemical Ref E/0900/17.

Material vegetal

A parte aérea da C. gratissimus foi colhida em julho de 2011 na Quiita, Lubango, Angola e identificado pelo Dr. Francisco Maiato. Um espécime foi depositado no Herbário do Lubango com o nº 7538.

Extraçao e isolamento

As partes aéreas de C. gratissimus (folhas, flores e caules; 797,7 g) foram secas ao ar, trituradas e maceradas por seis vezes em metanol, numa razao de 25 g de material vegetal para 100 mL de metanol, à temperatura ambiente, durante uma semana. Depois de concentrado num evaporador rotatório até à secura, o extrato (101,9 g) foi solubilizado em MeOH-H₂O (5:1, 300 mL) e submetido à partiçao com hexano (6x1L) e concentrado até a secura, obtendo-se a fraçao de hexano (27,9 g). O extrato metanol-água foi evaporado a vácuo, água foi adicionada e de seguida foi realizada a partiçao com clorofórmio (6 x 1 L), o clorofórmio foi evaporado quase até a secura e lavado com uma soluçao de NaCl a 1% (3 vezes) e seco com Na₂SO₄ anidro de forma a eliminar qualquer vestígio de água presente na fraçao, e em seguida o clorofórmio foi evaporado, obtendo-se, assim, a fraçao de clorofórmio (19,8 g). Finalmente a fase aquosa foi extraída com AcOEt, obtendo uma fraçao de AcOEt com uma massa de 22,6 g. A restante fase aquosa foi evaporada, num evaporador rotatório, obtendo-se 27,8 g de fraçao aquosa.

Uma amostra da fraçao de hexano (10 g) foi fracionada por cromatografia em coluna (CC, 100 g; ±100 mL) usando sílica gel, e com um gradiente Hex-AcOEt (1:0, 98:2, 95:5, 9:1, 7:3, 1:1, 0:1) seguido de um gradiente de AcOEt-MeOH (95:5 → 9:1) e metanol, obtendo-se 105 fraçoes agrupadas em 5 fraçoes(A-J). A fraçao A, resultante das fraçoes 1-17 eluídas com hexano, foi cromatografada em sílica gel com um gradiente [CHCl₃→CHCl₃; MeOH 98:2 → 8:2; ± 100 mL, 35 fraçoes), a fraçao 1-3 obtida da eluiçao com CHCl₃ foi sujeita a CC com um gradiente de Hex-AcOEt 9:1; 8:2; 7:3 resultando 36 fraçoes (± 100 mL), a fraçao 8 foi cromatografada em sílica gel com um gradiente (Hex/CHCl₃; 95:5, 9:1; ± 100 mL), na fraçao 12-16 obtida da eluiçao com Hex/CHCl₃ 9:1 foi isolado o composto 1 (32 mg), o composto 2 (8 mg) foi obtido como uma mistura com um gradiente de Hex-AcOEt 9:1; 8:2; 7:3 resultando 36 fraçoes (± 100 mL), as fraçoes 10-15 (Hex/AcOEt 8:2) foram cromatografadas em CC com Hex/AcOEt 9:1 e 8:2 (± 100 mL), na fraçao 8 (Hex/AcOEt 8:2).

A fraçao B, resultante das fraçoes 18-30 obtida na fraçao de Hex-AcOEt 98:2, foi cromatografada sob sílica gel (Hex-AcOEt, 1:0 → 1:1; ± 100 mL; 26 fraçoes); na fraçao III foi identificado o composto 3, na fraçao VI identificou-se o 4 e na VIII-XII os compostos 5 e 6. A fraçao III eluída em hexano foi novamente cromatografada com hexano e Hex/AcOEt 99:1 obtendo-se o composto 3 (15 mg; Hex/AcOEt 99:1; ± 100 mL; fraçoes 16/18). A fraçao VI foi sujeita a CF com hexano e Hex/AcOEt 99:1 → 7:3 (± 100 mL; 40 fraçoes) na fraçao 37-38 foi isolado o composto 4 (5 mg; Hex/AcOEt 8:2). A fraçao VIII-XII foi cromatografada com um gradiente Hex/ACOEt 1:0 a 7:3 (± 100 mL, 58 fraçoes) obtendo-se 5 (fraçao 26-30, Hex/AcOEt 98:2) e 6 (fraçao 42-46, Hex/AcOEt 9:1) impuros. A fraçao 26-30 foi submetida a CF com um gradiente Hex AcOEt 1:0 → 7:3 (± 50 mL; 32 fraçoes) o 5 (6 mg) foi obtido à polaridade Hex/AcOEt 95:5 na fraçao 26; para obter 6 (13 mg) a fraçao 42-46 foi cromatografada usando um gradiente Hexano/AcOEt 1:0→7:3 (± 50 mL; 38 fraçoes) e o mesmo isolado na fraçao 18 (Hex-AcOEt 9:1).

A fraçao C, constituída pelas fraçoes 31-36, foi cromatografada sob sílica gel (Hex-AcOEt, 1:0 → 8:2; 100 mL; 56 fraçoes), na fraçao 16-17 eluída com Hex-AcOEt 99:1 obteve-se 7 impuro, na fraçao 19-23 foram identificados 8 e 9 como misturas. A fraçao 16-17 foi subsequentemente purificada por CF com sílica gel (Hex/AcOEt 1:0→9:1; ±100 mL; 82 fraçoes) obtendo-se o composto 7 (10 mg; Hex/AcOEt 99:1; fraçao 30-31). A fraçao 19-23 foi purificada por CF (Hex-AcOEt, 1:0 → 7:3; 100 mL; 80 fraçoes) na fraçao 38-42 (Hex/AcOEt 98:2) foi isolado o 8 (13 mg) e o composto 9 (31 mg) foi isolado na fraçao 46-52 (Hex/AcOEt 98:2).

A fraçao D, formada pelas fraçoes 37-42, foi cromatografada sob sílica gel (Hex-AcOEt, 1:0 → 1:1; ±100 mL; 66 fraçoes) a fraçao 19-22 (Hex/AcOEt 95:5) foi purificada por CF com sílica gel (Hex-AcOEt 8:2 a 6:4; ±100 mL; 69 fraçoes) obtendo-se o composto 10 (2 mg; Hex-AcOEt 8:2; fraçoes 31-35). Finalmente, a fraçao E, fraçoes 43-59, foi cromatografada sob sílica gel (Hex-AcOEt, 1:0 → 0:1; ±100 mL; 103 fraçoes) e as fraçoes 29-30 foram purificadas por CF com sílica gel (Hex-AcOEt 1:0→0:1; ±100 mL; 60 fraçoes), obtendo-se o composto 11 (12 mg; Hex-AcOEt 9:1; fraçoes 17-19).

Parte da fraçao de clorofórmio (10 g) foi fracionada por cromatografia em coluna (CC, 100 g; ±100 mL; 134 fraçoes), usando sílica gel, com um gradiente CHCl₃-MeOH (1:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 0:1; ± 100 mL; ) seguido de um gradiente de AcOEt-metanol (95:5 → 9:1) e metanol obtendo-se as fraçoes (K-S). A fraçao N (Hex/AcOEt 7:3) foi cromatografada em sílica gel (Hex-AcOEt, 95:5 → 1:1; ± 100 mL; 76 fraçoes] obtendo-se o composto 12 (0,8 mg; Hex-AcOEt 95:5; fraçoes 10-12).

Uma amostra da fraçao de AcOEt (10 g) foi fracionada por cromatografia em coluna (CC), usando sílica gel e eluída com um gradiente CHCl₃-MeOH (1:0, 98:2, 9:1, 7:3, 1:1; 0:1) obtendo-se 157 fraçoes que foram agrupadas (T-Y, ± 100 mL; 157 fraçoes). A fraçao X foi cromatografada em sílica gel (CHCl₃-MeOH, 7:3 → 1:1; ±100 mL; 37 fraçoes), as fraçoes 14 a 22 foram purificadas por CF com sílica gel (CHCl₃-MeOH 7:3→1:1; ±100 mL; 23 fraçoes) obtendo-se o composto 13 (30 mg; CHCl₃-MeOH 7:3; fraçoes 5-7) e 14 (71 mg; fraçao 4) foi obtido a partir das fraçoes 26 a 36 da fraçao X por eluiçao com um gradiente CHCl₃-MeOH 6:4→0:1 (± 100 mL; 23 fraçoes).

 

RESULTADOS E DISCUSSAO

As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas usando espectroscopia de IV, RMN de ¹H e ¹³C e ainda estudos bidimensionais de RMN. Estes dados foram comparados com os dados da literatura de cada um dos compostos identificando o óxido de cariofileno (1),⁶ 1β-metoxicariolan-9β-ol (2),^14,15 ácido kaur-16-en-19-oico (3),¹⁶ ácido cis-ozoico (4),^17,18 espatulenol (5),^19-21 lupeol (6),²² 7δ-metoxi-opposit-4(15)-en-1β-ol (7),^23,24 germacra-4(15),5,10(14)-trien-1β-ol (8),^25,26 β-sitosterol (9),²⁷ent-kaur-16-en-18-ol (10),¹⁶ ácido 15-metoxi-neo-clerodan-3,13-dien-16,15-olid-18-oico (11),^28-30 6α-metoxieudesm-4(15)-en-1β-ol (12),³¹ sacarose (13)³² e a N-metil-trans-4-hidroxi-L-prolina (14) (Figura 1).³³

 

 

Estudos prévios sobre a Croton gratissimus focaram-se sobre as folhas.^3,7 Foram identificadas principalmente cembranolidas,^2,3 trachilobanos e isopimaranos,^6,7 e na casca do caule, da qual foram isolados clerodanos e trachilobanos.^2,6

Este é o primeiro estudo sobre a composiçao química de flores, caules e folhas da Croton gratissimus. Pela primeira vez foram isolados, no género Croton, os seguintes compostos: 2, 4, 7, 8, 11, 12 e 14. Foram isolados outros compostos como o 1, 3 e 5, que já tinham sido isolados no género Croton, e 6 e 9, isolados, anteriormente, nas folhas da C. gratissimus.

A partir de estudos prévios sobre as folhas da C. gratissimus foram identificadas duas populaçoes: uma de Durban, Africa do Sul, em que a sua composiçao química consiste de, principalmente, cembranolidas³ e a da C. zambesicus, recolhida em Cotonou, Benin, que apresenta uma composiçao de trachilobanos e isopimaranos.⁷ Apesar de o nosso estudo se focar na parte aérea e nao as folhas, se a populaçao de Quiita fosse equivalente à populaçao de Durban ou Cotonou teriam de ser isoladas cembranolidas ou trachilobanos e pimaranos, respetivamente. Assim poderemos estar perante uma nova populaçao de C. gratissimus.

Esta diferença de composiçao deverá comprometer o uso tradicional desta planta, motivo pelo qual mais estudos devem ser efetuados em termos de atividades biológicas para determinar essas diferenças.

 

CONCLUSOES

Da avaliaçao da composiçao da C. gratissimus permitiu-se concluir que pela primeira vez foram isolados, no género Croton, os seguintes compostos: 2, 4, 7, 8, 11, 12 e 14. Foram isolados outros compostos 1, 3 e 5, que já tinham sido isolados no género Croton, e o 6 e 9, isolados anteriormente nas folhas da C. gratissimus.

Comparando a composiçao química da C. gratissimus recolhida na Africa do Sul e no Benin com a recolhida na Quiita em Angola verifica-se que ela é diferente entre estes três países pelo que será importante um estudo mais completo para determinar se efetivamente existem três populaçoes diferentes desta planta. Assim, o presente trabalho abriu uma nova linha de investigaçao para a confirmaçao das atividades biológicas destas três populaçoes que à partida devem ser diferentes.

As atividades biológicas desta planta podem ser inferidas pelas atividades próprias dos compostos isolados, assim o composto 1 é acaricida,³⁴ antimicrobiano,^35,36 anti-inflamatório e analgésico,³⁷ antimalárico³⁸ e tripanocida,³⁹ o 3 é antimicrobiano,⁴⁰ citotóxico,^41,42 analgésico e antiflamatório,⁴³ anti-HIV,⁴⁴ tripanocida,⁴⁵ entre outras; o composto 5 tem atividade citotóxica;⁴⁶ o composto 6 é antimicrobiano,⁴⁷ citotóxico,^48,49 entre outras; o composto 8 é citotóxico;⁵⁰ o 9 é antimicrobiano,⁵¹ antidiabético e antioxidante.⁵²

Comparando os usos, pela medicina tradicional, das várias partes da C. gratissimus com as atividades dos compostos isolados verifica-se que a maior parte dos usos sao compatíveis com os resultados deste estudo. Pode afirmar-se que a existência de compostos analgésicos, anti-inflamatórios e antimicrobianos justificam os usos tradicionais desta planta.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espetros de RNN de ¹H e ¹³C e os bidimensionais ¹H-¹H COSY, HSQC e HMBC dos compostos isolados estao disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Centro de Investigaçao Materiais Fibrosos e Tecnologias Ambientais - FibEnTech da Universidade da Beira Interior por todo o seu apoio.

 

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