JBCS

INTRODUÇAO

A crescente preocupaçao com a escassez das reservas de petróleo e carvao mineral aliada à necessidade de preservaçao do meio ambiente estao entre os principais fatores que impulsionam a busca de fontes renováveis para a produçao de energia e de combustíveis sustentáveis. Atualmente, cerca de 80% da energia primária consumida no mundo têm origem nos combustíveis fósseis.¹ Diante desse cenário, os biocombustíveis se apresentam como uma potencial alternativa de novas fontes de energia para o setor de transporte, com destaque para o etanol de segunda geraçao (2G) produzido a partir de biomassas lignocelulósicas. O etanol 2G apresenta como principal vantagem a possibilidade de aumento da produtividade em etanol nas unidades já instaladas sem a necessidade de aumento de área cultivada.² No entanto, a viabilidade econômica do processo de produçao do etanol 2G ainda esbarra em algumas limitaçoes tecno-econômicas, como o alto custo das enzimas utilizadas na conversao da biomassa em açúcares fermentescíveis.

O uso de biocatalisadores representa uma alternativa importante aos processos químicos convencionais, pois as enzimas catalisam as reaçoes de forma específica, minimizando a geraçao de subprodutos indesejáveis, e atuam em temperaturas amenas, o que reduz o custo energético do processo. Assim, o desenvolvimento de processos alternativos e mais eficientes para a produçao de enzimas é um desafio que precisa ser superado, visto que o alto custo desse insumo pode ser um fator limitante no processo de produçao desse biocombustível.^3-5 Nesse sentido, a produçao de enzimas on-site utilizando materiais lignocelulósicos como fonte de carbono para o cultivo de microrganismos tem sido considerada uma estratégia potencial para reduzir os custos na produçao das enzimas celulolíticas e, consequentemente, contribuir para diminuir os custos do processo de obtençao do etanol 2G.^6-11

Atualmente sao usados dois métodos de cultivo convencionais para produçao de enzimas celulolíticas: a fermentaçao em estado sólido (FES), caracterizada pela ausência de água livre, e a fermentaçao submersa (FSm), que ocorre em meio líquido.¹² Cada um desses processos apresenta vantagens e desvantagens associadas a condiçoes ambientais e operacionais, sendo que a FSm é utilizada na maioria dos processos industriais para produçao de enzimas microbianas. Alternativamente, um novo método de cultivo, denominado de fermentaçao sequencial (FSeq), foi desenvolvido recentemente na tentativa de unir as vantagens dos processos de cultivo convencionais mencionados anteriormente. A FSeq é baseada na preparaçao do pré-cultivo no estado sólido com posterior transiçao para estado submerso, tendo se mostrado como um método promissor para a produçao de enzimas celulolíticas, tanto em termos qualitativos como quantitativos.^7,9,10,13-16

Em termos de microrganismos aptos a produzir enzimas celulolíticas capazes de degradar a biomassa vegetal, os fungos filamentosos se destacam, principalmente as linhagens Trichoderma reesei e Aspergillus niger. O fungo T. reesei tem sido amplamente utilizado na produçao industrial de coquetéis enzimáticos celulolíticos.^17,18 Apesar de ter um número reduzido de enzimas celulolíticas em comparaçao com outros fungos filamentosos,¹⁹ o fungo T. reesei possui sistemas eficientes para o transporte de nutrientes e alta capacidade de induçao/secreçao de celulases e hemicelulases.²⁰ O A. niger é também considerado um dos mais importantes fungos para aplicaçoes biotecnológicas e diferentes linhagens industriais sao comumente utilizadas na produçao de enzimas, entre outros produtos de alto valor agregado.²¹ Essa espécie de Aspergillus é capaz de produzir uma ampla gama de enzimas relacionadas à degradaçao de polissacarídeos vegetais tais como celulose, xilana, xiloglucano, pectina, entre outros.²² Em A. niger, a expressao de todas as principais celulases e hemicelulases é regulada pela mesma molécula indutora, D-xilose, mas os mecanismos de induçao do T. reesei sao mais diversos.²³

A produçao das principais celulases por ambos os fungos, T. reesei e A. niger, é controlada por um sofisticado sistema de regulaçao que evita o gasto de energia com processos desnecessários quando há fontes de carbono metabolizáveis presentes.^24,25 Nesse sentido, o bagaço de cana-de-açúcar tem sido amplamente utilizado como uma biomassa lignocelulósica indutora na produçao de enzimas do complexo celulolítico, além de ser utilizado no processo de sacarificaçao para liberaçao dos açúcares fermentescíveis. Estudos de proteoma das linhagens A. niger e T. reesei para identificar proteínas secretadas na presença de bagaço de cana têm demonstrado que essa biomassa lignocelulósica é capaz de induzir a produçao de diferentes tipos de celulases, hemicelulases, esterases e outras proteínas putativas e/ou hipotéticas importantes para a sacarificaçao da biomassa vegetal, tais como proteínas acessórias nao hidrolíticas que aumentam e/ou favorecem a eficiência enzimática.^14,23,26

No processo de conversao da biomassa lignocelulósica, há necessidade de uma etapa de pré-tratamento da biomassa vegetal para aumentar a acessibilidade da celulose para a açao das enzimas celulolíticas durante a etapa de hidrólise enzimática.^27,28 A reaçao de hidrólise enzimática compreende uma etapa de adsorçao das celulases no material lignocelulósico, porém a presença de lignina residual no material pode levar a uma adsorçao improdutiva dessas enzimas. A perda de atividade catalítica devido à adsorçao improdutiva das enzimas na lignina representa um dos principais fatores limitantes na conversao da biomassa, sendo influenciada pelo tipo de matéria-prima, pré-tratamento e fonte/características das enzimas. As celulases de T. reesei possuem resíduos de aminoácidos hidrofóbicos expostos em sua superfície, assim esses resíduos podem interagir com a superfície hidrofóbica da lignina, causando a adsorçao improdutiva das celulases com a desativaçao das mesmas, reduzindo a eficiência do processo catalítico.^29-31 As enzimas celulolíticas de A. niger também sofrem adsorçao improdutiva, porém estudos demonstram um perfil de adsorçao diferente. Por exemplo, a β-glicosidase de A. niger apresenta menor adsorçao em lignina do que a produzida pela linhagem T. reesei.³² Além disso, a β-glicosidase de A. niger é menos afetada pela lignina do que outras enzimas, como celulases e hemicelulases.³³ Assim, o entendimento da estrutura e características dos biocatalisadores empregados nas reaçoes de hidrólise da biomassa é chave para a viabilizaçao deste processo.

Este artigo de revisao aborda aspectos relacionados a novas estratégias para a produçao, caracterizaçao e aplicaçao das enzimas celulolíticas na sacarificaçao da biomassa vegetal. A produçao enzimática é discutida com base na literatura recente sobre as técnicas de fermentaçao em estado sólido, submerso e sequencial para as principais linhagens fúngicas. Análises do secretoma sao também apresentadas como ferramenta para identificaçao e caracterizaçao dos coquetéis enzimáticos. Além disso, aspectos relacionados ao processo de hidrólise enzimática sao abordados, bem como um dos desafios dessa etapa relacionado à adsorçao improdutiva das celulases na lignina, que afetam significativamente a eficiência do processo.

 

ENZIMAS CELULOLITICAS QUE ATUAM NA DEGRADAÇAO DA CELULOSE

A degradaçao da biomassa lignocelulósica ocorre principalmente por enzimas produzidas e secretadas por microrganismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos. Dentre esses microrganismos, os fungos filamentosos se destacam como a principal fonte das enzimas comerciais, pois sao capazes de produzir em altas concentraçoes uma variedade de enzimas que possuem atividades complementares.^34,35 Esse grupo de enzimas que atuam no polímero de celulose, denominado de celulases ou enzimas celulolíticas sao enzimas essenciais para o processo de sacarificaçao da biomassa lignocelulósica. Porém, a hidrólise enzimática da biomassa é um processo complexo, uma vez que a presença do polímero de hemicelulose e da lignina nos substratos lignocelulósicos limita a açao das enzimas, fazendo-se necessária a remoçao ou modificaçao química desses componentes por pré-tratamentos químicos, físicos e/ou biológicos. Deste modo, outras enzimas acessórias, além das celulases, sao necessárias para degradaçao da matéria lignocelulósica, como as hemicelulases (xilanase, mananase, arabinase), mono-oxigenases, esterases, entre outras.³⁶

As enzimas celulolíticas sao capazes de atuar na hidrólise do polímero de celulose através da açao sinérgica dos seus três principais grupos de enzimas: endoglucanases (EGases) que clivam aleatoriamente ligaçoes β-1,4 glicosídicas nas regioes amorfas da celulose e geram novos terminais redutores e nao-redutores, celobiohidrolases (CBH) que sao enzimas processivas e liberam celobiose a partir de terminais redutores e nao redutores de fragmentos de celulose produzidos por endoglucanases, e as β-glicosidases que hidrolisam celobiose ou celo-oligossacarídeos em glicose. As β-glicosidases sao enzimas nao-processivas, pois o substrato deve ser liberado após cada clivagem para permitir a liberaçao da nova molécula de glicose (Figura 1).³⁷ Ambas as enzimas, celobiohidrolase e β-glicosidase, sao fortemente inibidas pelo produto de cada reaçao, celobiose e glicose, respectivamente.

 

 

As enzimas envolvidas na desconstruçao de polissacarídeos estao agrupadas na base de dados "Carbohydrate-active enzymes database" (CAZy) baseadas na comparaçao das sequências de aminoácidos, estruturas 3D e mecanismos catalíticos.¹⁹ A classificaçao das enzimas em famílias é feita de acordo com sua funçao no processo de clivagem ou construçao de hidratos de carbono complexos, sendo que as celulases pertencem à família glicosil hidrolase (GH). Mais recentemente, foi descoberta a funçao real de membros da família GH61, antes classificadas como endoglucanases, como sendo mono-oxigenases de polissacarídeos líticas (LPMOs - lytic polysaccharide monooxygenases), resultando na inserçao dessas enzimas em uma nova categoria chamada de "atividades auxiliares" (AA).³⁹ Essas enzimas integram um grupo de módulos catalíticos envolvidos na degradaçao da parede celular vegetal, por isso essa nova classificaçao AA fornece uma visao complementar das enzimas lignocelulolíticas, concentrando-se em famílias de enzimas oxidativas.⁴⁰ A descoberta de outras enzimas acessórias, como a GH115, uma α-glucuronidase que possui um elo evolutivo com a α-glucuronidase da família GH67,⁴¹ representa uma evoluçao no processamento enzimático da biomassa e confirma que a açao das celulases hidrolíticas clássicas é facilitada pela açao das LPMOs e de outras enzimas acessórias, melhorando o processo de hidrólise enzimática da biomassa lignocelulolítica⁴² e auxiliando na tentativa da reduçao dos custos do coquetel enzimático.

No entanto, os custos para a obtençao de enzimas ainda limita sua utilizaçao em vários processos industriais, incluindo as celulases aplicadas na produçao do etanol 2G.^3,5,11,43 Assim, alternativas para diminuir o custo desses biocatalisadores têm sido objeto de vários trabalhos encontrados na literatura. Esses estudos buscam aumentar a produçao das enzimas celulolíticas através da seleçao da fonte de carbono,^44,45 da seleçao de microrganismos capazes de secretar uma alta quantidade de enzimas e um coquetel enzimático eficiente,^8,46,47 do entendimento da composiçao do coquetel celulolítico secretado por esses microrganismos,^14,26,48 da complementaçao do coquetel enzimático com outras enzimas,^49,50 entre outros.

A definiçao de métodos de avaliaçao sobre o custo das enzimas do complexo celulolítico é importante para apoiar o desenvolvimento futuro das biorrefinarias. Atualmente, os métodos de avaliaçao de custos das celulases apresentam vários resultados controversos, ou mesmo conflituosos.⁵ Em termos econômicos, no ano de 2001, a etapa de obtençao de enzimas a partir de microrganismos celulolíticos era em torno de 50% do custo global do processo de produçao do etanol 2G.⁵¹ Diferentes estudos contabilizam o custo das enzimas nesse processo em dólares/galao de etanol celulósico.³ Alguns estudos reportam que o custo das celulases varia apenas de $0.10 a $0.40/gal etanol, dando suporte a ideia de que a tecnologia atual seja economicamente viável.^52-55 Por outro lado, outros estudos pontuam o custo da enzima de $0.68/gal etanol baseado em rendimento máximo teórico,⁵⁶ chegando até a $1.47/gal etanol se o rendimento for baseado nas eficiências de sacarificaçao e fermentaçao previamente reportados na literatura.³ Dependendo do preço real das celulases no mercado industrial de enzimas e da produçao de etanol convencional, o custo da enzima pode chegar até $2.71/gal etanol, sendo responsável por 48% do preço mínimo de venda do etanol celulósico.⁵

Tendo em vista esses valores do custo da enzima no processo de produçao de etanol 2G, a produçao de enzimas on-site, isto é, utilizando as mesmas instalaçoes da usina, pode reduzir significativamente o custo da enzima, proporcionando uma alternativa promissora para a produçao de etanol celulósico em larga escala.⁴ Estudos mostram uma reduçao significativa no custo da enzima quando produzida on-site para menos de $0.30/gal etanol, devido a sua purificaçao simplificada e logística, bem como a potencial utilizaçao de fonte de carbono de baixo custo a partir de material lignocelulósico.⁵⁷ Em um estudo comparativo dos custos de produçao de celulases, mostrou-se que as enzimas produzidas on-site reduziram até 30% do custo da enzima em comparaçao com as enzimas comerciais.⁵⁸ Segundo Takimura et al.⁵⁹ a reduçao foi de até 70% no custo das celulases quando produzidas on-site em relaçao às celulases comerciais, tendo como fonte de carbono a palha de arroz. Outro estudo realizado rencentemente compara os custos de três abordagens para a produçao de celulases: off-site, on-site e integrado, no qual a fonte de carbono é a própria biomassa lignocelulósica.⁴ A reduçao de custos observada foi considerada significativa, de $0.78 para $0.58 e $0.23/gal etanol mudando os sistemas de off-site para on-site e integrado, respectivamente, com reduçao de 7% e 19% nos custos totais da produçao de etanol celulósico. Portanto, a produçao de enzimas celulolíticas on-site tem se mostrado como uma potencial estratégia para a diminuiçao de custo das enzimas utilizadas no processo de sacarificaçao da biomassa para liberaçao de açúcares fermentescíveis, contribuindo para tornar o etanol 2G mais competitivo diante do mercado dos biocombustíveis.

Estratégias de cultivo para a produçao de enzimas on-site

Há muitos anos os processos fermentativos sao de grande importância prática e econômica para a espécie humana. Diversos produtos de interesse comercial, obtidos por processos de cultivo microbiano, têm sido aplicados com sucesso em diferentes setores que incluem farmacêutico, têxtil, alimentar, entre outros.^60,61 Além disso, há um grande potencial para o uso dos processos fermentativos em novas aplicaçoes, como na conversao de materiais lignocelulósicos gerados a partir da agroindústria em biocombustíveis e outros produtos de maior valor agregado.⁶²

No Brasil, onde a agricultura é uma das principais fontes de atividade econômica, a geraçao de resíduos florestais e agroindustriais é bastante considerável. O principal resíduo agroindustrial nacional é o bagaço de cana-de-açúcar, gerado a partir das usinas que produzem açúcar e etanol de primeira geraçao. A cada tonelada de cana-de-açúcar moída na fabricaçao desses dois produtos sao gerados em média 140 kg de bagaço e 140 kg entre palha e ponteira.² Uma parte dos resíduos agroindustriais é atualmente utilizada para produçao de bioeletricidade, enquanto outra grande fraçao é deixada no campo, muitas vezes tornando-se um problema ambiental.⁶² Portanto, a bioconversao dos resíduos lignocelulósicos em produtos de interesse comercial poderia proporcionar ajuda econômica e contribuiria para diminuiçao da poluiçao ambiental.

Os processos fermentativos realizados por microrganismos podem dar origem a diversos bioprodutos, dentre eles as enzimas industriais, em especial as celulases. O desenvolvimento dos processos biotecnológicos tem sido foco de grande parte dos esforços para a reduçao nos custos de produçao das enzimas celulolíticas. Esses processos podem ser conduzidos em meio sólido, denominado fermentaçao em estado sólido (FES), ou em meio líquido, denominado fermentaçao submersa (FSm). Apesar de grande parte dos avanços na produçao de celulases microbianas ter sido desenvolvida para FSm, o crescimento de fungos filamentosos produtores de enzimas celulolíticas ocorre naturalmente em condiçoes similares à FES.⁶⁰ Ambos os processos apresentam características positivas e negativas, as quais devem ser consideradas de acordo com o produto desejado e o microrganismo a ser utilizado. Recentemente, uma combinaçao dos dois métodos anteriores, definida como fermentaçao sequencial (FSeq), tem gerado resultados positivos na produçao de enzimas celulolíticas (Figura 2).^7,9,10,13-16

 

 

No processo de FES, o crescimento do microrganismo ocorre em substrato sólido com umidade suficiente apenas para manutençao do metabolismo e desenvolvimento microbiano, nao havendo água na forma livre. A água indispensável para o crescimento é adsorvida num suporte sólido ou complexado no interior de uma matriz sólida.^63,64 Para fungos filamentosos a FES é considerada interessante, pois suas características assemelham-se às condiçoes sob as quais a maioria das espécies fúngicas crescem na natureza.^65,66 Existem outras vantagens inerentes à FES, como maior produtividade dos coquetéis enzimáticos, menor susceptibilidade à inibiçao pelo produto e substrato e a possiblidade de obtençao de enzimas mais estáveis em termos de pH e temperatura.^67,68 Do ponto de vista ambiental, uma vantagem importante da FES é a capacidade de utilizar substratos sólidos como resíduos agroindustriais, que servem como fontes de carbono e de energia para o crescimento do microrganismo e a produçao de enzima.⁶² Como exemplo, o bagaço de cana vem sendo usado como matéria-prima em vários trabalhos que aplicam a técnica da FES.^46,69-74

Na fermentaçao submersa, o meio essencial consiste de água contendo nutrientes dissolvidos, sendo que a água pode constituir cerca de 90 a 99% da massa total do material. O processo de cultivo submerso apresenta vantagens relacionadas à instrumentaçao e controle dos parâmetros físicos-químicos, como controle de temperatura, aeraçao, agitaçao e pH.⁷⁵ Na FSm, o caldo de fermentaçao pode ser considerado como uma mistura perfeita, na qual os microrganismos sao inoculados diretamente em meio nutriente líquido. Quando se faz uso de fungos filamentosos para a produçao de enzimas celulolíticas por esse método de cultivo, pode ser feita tanto a inoculaçao de esporos quanto de micélios desenvolvidos em uma etapa de pré-cultivo. Além disso, esse tipo de cultivo pode contribuir para uma melhor absorçao de nutrientes pelo microrganismo e facilitar a recuperaçao de metabólitos.^12,76 A maioria das celulases comerciais sao produzidas por fungos filamentosos, principalmente A. niger e T. reesei cultivados em FSm.^77-80

Alternativamente aos cultivos convencionais FES e FSm, foi descrita recentemente uma nova configuraçao de processo fermentativo, denominada fermentaçao sequencial (FSeq).⁷ A FSeq é caracterizada pela preparaçao de pré-cultivo com fase inicial de crescimento fúngico sob estado sólido, seguido por uma transiçao para estado submerso. A FSeq apresentou resultados significativos em relaçao ao processo submerso convencional de produçao de celulases, tanto em frascos agitados^10,13,14 como em biorreatores convencional tipo tanque agitado e aerado e nao convencional pneumático tipo airlift.^7,9 A produtividade em endoglucanase foi 3 vezes superior na FSeq em comparaçao com a FSm, sugerindo o potencial da técnica como uma alternativa promissora para a produçao de enzimas celulolíticas por A. niger.⁷ Florencio et al.¹⁰ validaram a metodologia de FSeq para linhagens do gênero Trichoderma, observando-se um perfil enzimático com maiores atividades de xilanase, endoglucanase, β-glicosidase, avicelase e FPase. Posteriormente, Florencio et al.¹⁴ avaliaram o secretoma das linhagens T. reesei e A. niger cultivadas em FSm e FSeq. Os autores observaram que a análise proteômica da linhagem A. niger mostrou que a FSeq apresentou o secretoma com um maior número de proteínas identificadas e as maiores atividades enzimáticas. Além disso, as atividades enzimáticas mais elevadas e/ou um melhor equilíbrio da composiçao do secretoma a partir da FSeq tiveram reflexo de 3 vezes maior conversao na sacarificaçao do bagaço de cana pré-tratado por explosao a vapor quando comparado a FSm.

A morfologia de crescimento dos fungos difere de acordo com as condiçoes de cultivo empregadas, consequentemente, afetam de modo direto a produçao de enzimas. Para cada forma de cultivo avaliada tem sido investigada a influência de diferentes parâmetros, tais como pH e temperatura, tipo de reator, tipo de meio nutriente, cultivo de cultura mistas, umidade ideal para cada microrganismo.^{9,10,69,73,81-84} Como dito anteriormente, cada processo de cultivo microbiano descrito acima apresenta vantagens e desvantagens relacionadas à produçao das enzimas celulolíticas, sendo que o importante no emprego de cada forma de cultivo é ter o entendimento adequado acerca dos parâmetros operacionais que envolvem cada processo. A análise do proteoma para identificar as proteínas secretadas por diferentes microrganismos cultivados sob diferentes condiçoes pode ser considerada como uma ferramenta importante para a caracterizaçao dos complexos enzimáticos, possibilitando um melhor entendimento de como o perfil de proteínas produzidas pode impactar na eficiência da hidrólise da biomassa.

 

SECRETOMA COMO FERRAMENTA PARA A CARACTERIZAÇAO DE COMPLEXOS ENZIMATICOS

O mecanismo de produçao e secreçao das enzimas celulolíticas por microrganismos, em especial os fungos filamentosos, sempre foi alvo de diversos estudos. A princípio acreditava-se na hipótese de que os fungos filamentosos, dentre eles os do gênero Trichoderma, eram capazes de sintetizar níveis basais de celulases constitutivamente e que em contato com a celulose insolúvel o processo de hidrólise era limitado.^85,86 Segundo este modelo, o microrganismo seria capaz de secretar constantemente enzimas hidrolíticas em baixas concentraçoes. Tais enzimas degradariam os polissacarídeos em moléculas menores, as quais entrariam na célula provocando induçao transcricional de determinados genes para enzimas celulolíticas.⁸⁷ Essa hipótese excluiria a possibilidade de existência de um receptor para o reconhecimento dos substratos na membrana plasmática. No entanto, estudos mais recentes têm mostrado outra via de sinalizaçao hipotética.⁸⁸ A sugestao da existência de uma proteína receptora (sensora) situada na membrana plasmática da linhagem T. reesei, possivelmente acoplada a uma via de sinalizaçao celular específica que intensificaria a produçao de algumas enzimas e induziria a síntese de outras vem em contraponto à primeira hipótese.^89,90

Um grande desafio da biologia está no entendimento da expressao, funçao e regulaçao do grupo de proteínas codificadas nos genomas fúngicos, o que forneceria importantes informaçoes sobre mecanismos de colonizaçao fúngica, interaçao fungo-planta, patogênese e adaptaçao ecológica.⁹¹ Para melhor entendimento desses mecanismos, o uso de estratégias pós-genômicas, incluindo a proteômica faz-se necessário.⁸⁸ A análise sistemática do proteoma trata-se do conjunto de proteínas expressas por um determinado genoma, célula ou tecido em uma condiçao específica. A proteômica permite o entendimento de algumas respostas através da identificaçao e quantificaçao do número de proteínas que influenciam diretamente a bioquímica celular, além de prover uma análise do estado celular que podem ocorrer por mudanças durante o crescimento e/ou desenvolvimento ou resposta a fatores ambientais, mostrando-se útil no estudo de sistemas biológicos altamente dinâmicos e complexos.^92,93 Devido à alta complexidade dos proteomas, uma estratégia comumente adotada é o estudo das fraçoes específicas do proteoma total, ou seja, sub-proteomas que incluem sub-proteomas de organelas (mitocôndria e núcleo), glicoproteomas (proteínas glicosiladas), fosfoproteomas (proteínas fosforiladas) e secretoma (proteínas e/ou enzimas secretadas por um organismo).⁹⁴

A secreçao de proteínas produzidas por fungos filamentosos é de extrema importância na nutriçao dos mesmos e algumas dessas enzimas secretadas recebem atençao pelo potencial industrial que possuem, estimulando pesquisas relacionadas à genética e mecanismos de secreçao, como é o caso das enzimas celulolíticas. A análise do secretoma, definido como o conjunto de enzimas e demais proteínas secretadas por um determinado tipo celular, por um conjunto de células ou organismo,⁹⁵ juntamente com o entendimento da maquinaria responsável pela secreçao destas proteínas, sao indispensáveis para conhecer a identidade e funçao do arsenal de enzimas hidrolíticas extracelulares que participam na degradaçao de compostos lignocelulósicos e outros biopolímeros em resposta à adaptaçao a diferentes fontes de carbono e nitrogênio visando uma aplicaçao biotecnológica.⁹⁶

O aperfeiçoamento das técnicas de análise de separaçao e caracterizaçao de proteínas, combinada com avanços de espectrometria de massas (MS - mass spectrometry), tem permitido aumentar o conhecimento sobre as vias de secreçao e a expressao diferencial de proteínas de fungos filamentosos com relevância biotecnológica em relaçao às variáveis ambientais.⁹⁷ Além disso, estudos do secretoma estao sendo direcionados nao somente para o entendimento do papel dos fungos filamentosos na natureza, mas também para contribuir para viabilizar o uso desses microorganismos como maquinarias celulares capazes de secretar quantidades consideráveis de proteínas. No caso de fungos celulolíticos, o foco é na identificaçao de glicosil hidrolases e componentes acessórios envolvidos na degradaçao de polissacarídeos da parede celular de plantas.⁹⁸

Recentemente, a correlaçao entre a produçao de enzimas versus fonte indutora de carbono tem sido amplamente estudada para identificar o efeito dos substratos na produçao enzimática de celulases. De forma geral, pode-se considerar que a produçao de diferentes tipos de enzimas celulolíticas secretadas por fungos filamentosos é consequência da fonte indutora de carbono presente no meio de cultura, tais como lactose, soforose, D-galactose, sacarose, celulose, entre outras.^99-105 Estudo realizado com o fungo Aspergillus flavus utilizando diferentes fontes de carbono (glicose, batata dextrose e rutina) para a produçao de enzimas demonstraram proteínas secretadas diferencialmente. Para esse estudo foram encontradas proteínas comuns aos três meios, duas proteínas únicas para o meio de batata, 10 para o meio contendo apenas glicose e 18 proteínas no meio com rutina.¹⁰⁶

O secretoma de diferentes espécies de fungos filamentosos de interesse industrial tem sido investigado nos últimos anos, como é o caso da linhagem amplamente conhecida como a mais eficiente produtora de celulases, T. reesei.¹⁰⁷ Estudos do proteoma envolvendo esse fungo tem explorado diferentes fontes de carbono,¹⁰⁴ diferentes pHs,¹⁰⁸ diferentes características morfológicas,¹⁰⁹ entre outros. A composiçao proteica do secretoma produzido pela linhagem industrial T. reesei CL847 cultivada em meio de cultura para a produçao de celulases e hemicelulases foi explorada e posteriormente comparada com a linhagem superprodutora de celulases T. reesei Rut C30.¹¹⁰ Foram identificadas 22 proteínas potencialmente envolvidas na degradaçao da biomassa na linhagem T. reesei CL847. A maior diversidade observada no secretoma da linhagem CL847 sugere que este fungo pode ser um hipersecretor mais geral de enzimas, enquanto que linhagem T. reesei Rut C30 pode ter a produçao mais orientada para as celulases.¹¹⁰

A comparaçao do secretoma da linhagem mutante T. reesei Rut C30 e a selvagem T. reesei QM6a cultivados em meio de cultura contendo celulose, serragem e palha de trigo mostrou que as enzimas lignocelulolíticas no secretoma de ambas as linhagens sao dependentes da fonte de carbono.¹¹¹ A classificaçao funcional destas proteínas quantificadas revelou 31% de celulases, 18% de hemicelulases, 13% de proteínas de degradaçao de lignina, 22% de peptidases, 6% de quitinases e fosfatases, 3% de proteínas de transporte e 6% de proteínas hipotéticas. O sequenciamento do genoma da linhagem selvagem T. reesei QM6a realizado em 2008¹⁹ tem facilitado os estudos de sistemas biológicos deste fungo. Verificou-se que T. reesei possui relativamente menos genes que codificam enzimas lignocelulolíticas do que muitos outros fungos sequenciados, com exceçao de algumas hemicelulases.⁸⁸

A linhagem A. niger também tem sido alvo de diversos estudos secretômicos, pois sabe-se da sua capacidade como produtor de metabólitos primários e de enzimas lignocelulolíticas.¹⁰¹ Estudos empregando diferentes fontes de carbono têm sido realizados para este fungo, a fim de induzir a produçao de pectinases,¹¹² celulases e xilanases.^113-115 A utilizaçao de xilose e/ou maltose como fonte de carbono afetou fortemente a composiçao do secretoma do A. niger, com uma menor influência na composiçao do proteoma intracelular.¹⁰¹ Esses autores observaram que a composiçao do proteoma extracelular foi completamente diferente para ambas as culturas realizadas tanto em frascos agitados como em biorreator. A. niger cultivado em xilose secretou principalmente hidrolases envolvidas na degradaçao de polímeros da parede celular vegetal, enquanto o secretoma do A. niger cultivado em maltose foi dominado por glicoamilases, assim como as enzimas envolvidas na remoçao das espécies reativas de oxigênio foram mais abundantes no proteoma extracelular.¹⁰¹

Estudos de análises de secretoma utilizando resíduos agroindustriais como fonte de carbono para a produçao de enzimas lignocelulolíticas sao recentes, mas têm avançado rapidamente.^{23,26,48,98,111,116-122} A primeira análise global transcricional descrita usando bagaço de cana pré-tratado por explosao a vapor (BEX) e a linhagem A. niger foi reportada em 2011.²³ Os estudos revelaram genes que sao especificamente induzidos quando o BEX é usado como fonte de carbono. A degradaçao do BEX requer a produçao de diferentes enzimas que sao reguladas pelo tipo e complexidade do substrato disponível. Isto é essencial para compreender quais os genes que codificam enzimas hidrolíticas sao induzidos na presença de bagaço de cana, já que a intençao foi produzir coquetéis enzimáticos para hidrolisar esta biomassa pré-tratada. Segundo este estudo foram identificadas 18 celulases e 21 hemicelulases, que representam 58% das enzimas preditas de A. niger.

Várias diferenças na regulaçao da produçao de glicosil hidrolases entre os fungos A. niger e T. reesei já foram descritos,^123-125 sendo que estudos comparativos podem proporcionar uma visao mais abrangente de como essas importantes espécies industriais produzem as enzimas hidrolíticas. Borin et al.²⁶ realizaram uma análise comparativa do secretoma das linhagens A. niger e T. reesei cultivadas na biomassa da cana-de-açúcar com dois níveis de complexidade diferentes, colmo "in natura" e bagaço pré-tratado por explosao a vapor. A produçao das enzimas foi monitorada por 24 h e foi observado que ambas as linhagens sao capazes de hidrolisar os polissacarídeos da parede celular da cana desde as 6 h pós-inoculaçao. O fungo A. niger produziu mais enzimas do que T. reesei em todos os períodos avaliados, qualitativa e quantitativamente. Entretanto, as enzimas mais importantes relacionadas à degradaçao da biomassa, incluindo celobiohidrolases, endoglucanases, β-glicosidases, β-xilosidases, endoxilanases, xiloglucanases e α-arabinofuranosidases foram identificadas em ambos os secretomas. A diferença no mecanismo de degradaçao da biomassa entre as linhagens A. niger e T. reesei sugerem que uma combinaçao das enzimas a partir das duas espécies pode ser uma opçao interessante para aumentar a eficiência da sacarificaçao.²⁶

A combinaçao dos coquetéis enzimáticos das duas linhagens, A. niger e T. reesei, produzidos por FSm e FSeq foi aplicada no processo de hidrólise do bagaço de cana pré-tratado por explosao a vapor (BEX), em um estudo realizado por Florencio et al.¹⁴ A análise do secretoma foi utilizada como ferramenta para um melhor entendimento dos resultados obtidos no processo de hidrólise enzimática, em que a combinaçao dos coquetéis produzidos por FSeq foi 3 vezes mais eficiente do que aqueles produzidos por FSm. As maiores atividades enzimáticas e/ou um melhor equílibrio na composiçao do secretoma obtido na FSeq proporcionou uma hidrólise enzimática mais eficiente do BEX.¹⁴

Assim, estudos sobre o secretoma dos fungos filamentosos podem contribuir na produçao dos coquetéis enzimáticos e no entendimento como esses influenciam a sacarificaçao da biomassa lignocelulósica. Além disso, a obtençao de coquetéis enzimáticos mais específicos para degradaçao de cada biomassa em particular pode contribuir para a reduçao da quantidade de enzimas necessárias no processo de conversao. A possibilidade de obtençao de enzimas com características diferenciadas como maior estabilidade e menor suscetibilidade à adsorçao improdutiva à lignina também sao estratégias potenciais para a reduçao da carga de enzimas e aumento da eficiência de sacarificaçao.

 

DESAFIOS TECNOLOGICOS DA APLICAÇAO DOS COQUETÉIS ENZIMATICOS NA SACARIFICAÇAO DE BIOMASSAS

O desenvolvimento da tecnologia de produçao de etanol 2G apresenta ainda desafios a serem superados, pois diferentemente do etanol de primeira geraçao sao necessárias etapas adicionais de processamento para a obtençao de açúcares fermentescíveis que serao convertidos a etanol. Como citado anteriormente, o pré-tratamento é uma das etapas críticas desse processo^27,28,126 e a escolha do tipo de tecnologia e condiçoes de processo irao impactar diretamente as etapas subsequentes. O processamento de altas cargas de sólidos na etapa de hidrólise enzimática é também outro desafio tecnológico,¹²⁷ pois para viabilizar o processo torna-se necessário que altas cargas de sólidos (≥ 20% m/v) sejam processadas para disponibilizar quantidade de açúcares que após a etapa de fermentaçao, possa gerar um caldo com teor suficiente de etanol que viabilize a etapa de destilaçao.^128-131 Além dos desafios do ponto de vista de engenharia de processo, como as dificuldades de bombeamento e agitaçao de altas cargas de sólidos, soma-se a presença de contaminantes das reaçoes bioquímicas que podem impactar de forma negativa tanto a eficiência da hidrólise enzimática, quanto a fermentaçao alcoólica. Tais contaminantes, também chamados de inibidores, em conjunto com a lignina residual, irao impactar um ponto crítico e determinante no custo final do etanol 2G: a quantidade de enzimas necessárias para converter a celulose em glicose.^132-134 Os inibidores podem ser classificados de acordo com a estrutura química de cada um deles, como ácidos orgânicos, furanos, oligossacarídeos, xilooligomeros e compostos fenólicos,^135,136 sendo os fenóis originados da decomposiçao da lignina os principais inibidores da hidrólise da celulose e da celobiose.¹³⁷

A presença da lignina confere ao material lignocelulósico uma limitaçao física à sacarificaçao enzimática da celulose, diminuindo a acessibilidade das enzimas hidrolíticas às fibras celulósicas.²⁹ Vários trabalhos têm buscado tratamentos que visem remover esse componente, atingindo dessa forma maiores valores de conversao de hidrólise.^138-141 A remoçao da lignina gera poros no material, aumentando a área acessível as enzimas celulolíticas.¹⁴² A correlaçao positiva entre o aumento da porosidade do bagaço e rendimentos de hidrólise da celulose foi mostrada em estudo com a deslignificaçao do bagaço de cana nao tratado, confirmando a importância da limitaçao da acessibilidade causada pela lignina na ineficiência da sacarificaçao.¹⁴² No entanto, a remoçao da lignina apresenta algumas desvantagens como o aumento de etapas no processo, alto custo de instalaçao de equipamentos, limitaçao da capacidade de deslignificaçao, entre outras.¹⁴³ Estratégias para a reduçao do teor de lignina na própria planta precisam ser desenvolvidas, porém sem alterar o desenvolvimento da planta ou causar efeitos indesejáveis, sendo que a maior limitaçao para o processo de reduçao da lignina seria a falta de especificidade do tecido exibida em abordagens clássicas de modificaçao da lignina.¹⁴⁴

Alguns tipos de pré-tratamentos com ácido diluído,^145,146 por explosao a vapor,^147,148 organosolv,¹⁴⁹ hidrotérmico,^150,151 entre outros, promovem a relocalizaçao e/ou a remoçao de parte da lignina da parede celular, garantindo maiores valores de conversao.^152-155 Além disso, tais processos também podem atuar aumentando a exposiçao da lignina, além de modificar a sua estrutura. Estudos recentes têm mostrado que o pré-tratamento hidrotérmico modifica a estrutura da lignina para uma forma mais condensada e heterogênea, que seria mais prejudicial à hidrólise enzimática do que a lignina original devido ao favorecimento da adsorçao improdutiva das enzimas.¹⁵⁶

Adsorçao improdutiva de enzimas na lignina

A hidrólise enzimática da celulose acontece de forma heterogênea e as interaçoes entre enzima/substrato sao geralmente nao-covalentes, sendo que as forças motrizes envolvem principalmente interaçoes hidrofóbicas e eletrostáticas repulsivas e atrativas, com menor contribuiçao das interaçoes de hidrogênio e dipolo.^157,158 As interaçoes hidrofóbicas frequentemente dominam a adsorçao da enzima na celulose, porém as enzimas podem se ligar a outras superfícies, como a lignina.¹⁵⁹ Esse efeito tem sido observado em diversos materiais lignocelulósicos submetidos a diferentes tipos de pré-tratamentos e tem sido considerado um importante efeito negativo da presença da lignina residual,^{29,32,128,151,156,160-163} prejudicial para a economia do processo de sacarificaçao.

Por ser uma molécula poliaromática, os grupos funcionais da lignina exercem influência na adsorçao improdutiva, pois podem ligar-se às enzimas por pareamento de anéis e outras interaçoes hidrofóbicas.¹⁶⁴ Durante o pré-tratamento, modificaçoes químicas da lignina podem alterar sua afinidade por proteínas, o que resultam no aumento de hidroxilas fenólicas que podem aumentar a capacidade adsortiva da lignina residual.^165,166 Por outro lado, sao gerados materiais menos susceptíveis a inibiçao quando o pré-tratamento aumenta a hidrofilicidade da lignina, principalmente pela introduçao de grupos ácidos.^167,168 Lignina de diferentes materiais lignocelulósicos também apresentam diferentes capacidades adsortivas, além das diferenças devido ao tipo de pré-tratamento. As ligninas de algumas biomassas como a palha de milho, por exemplo, adsorvem menos celulases que a lignina de madeiras, tanto de coníferas quanto de folhosas.¹⁶²

A adsorçao improdutiva nao depende apenas dos grupos funcionais das ligninas, mas também das propriedades das enzimas, como ponto isoelétrico e superfície hidrofóbica.^32,169,170 Estudos realizados com celulases produzidas por T. reesei mostraram que estas enzimas possuem resíduos de aminoácidos hidrofóbicos expostos em sua superfície, capazes de interagir com a superfície hidrofóbica da lignina, causando adsorçao improdutiva das celulases com desativaçao das mesmas, reduzindo a eficiência do processo catalítico.^29,171 Segundo estudos realizados por Ko et al.,³² as enzimas produzidas por T. reesei e A. niger exibem comportamentos diferentes na adsorçao pela lignina, sendo que a β-glicosidase de A. niger exibe menos adsorçao que a β-glicosidase produzida pela linhagem T. reesei. Os domínios de ligaçao a carboidratos (CBMs - carbohydrate binding modules) encontrados em algumas celulases, também exercem influência na adsorçao improdutiva,¹⁷² devido à presença de três resíduos de tirosina alinhados (Y5, Y31, Y32), importantes para o pareamento de anéis de interaçao CBM-celulose,¹⁶⁴ uma vez que tem sido observado aumento na adsorçao improdutiva pela presença de CBM.

A maior parte dos estudos de adsorçao sao realizados em baixas temperaturas (0 a 10 °C), para evitar modificaçoes estruturais nos substratos devido a hidrólise, além de evitar a inativaçao térmica das enzimas. Nessas temperaturas, as enzimas que sao adsorvidas na lignina podem ser recuperadas, com perda mínima na atividade catalítica. Porém, em temperaturas típicas de hidrólise (acima de 45 °C), as interaçoes proteínas-lignina sao intensificadas e as enzimas perdem a suas estruturas nativas, sofrem desnaturaçao e ligam-se irreversivelmente à lignina.¹⁶¹

Tentativas para minimizar o efeito negativo da adsorçao improdutiva de enzimas sugerem a adiçao de uma quantidade relativamente alta de enzimas ao processo de sacarificaçao, pois a adsorçao improdutiva é um fenômeno dependente da concentraçao^147,162 e a superfície disponível para a interaçao diminui à medida que a concentraçao de proteínas aumenta. No entanto, essa estratégia nao é economicamente viável para aplicaçao em processo de larga escala. Outra alternativa de contornar esse efeito negativo é pelo uso de aditivos e/ou agentes bloqueadores de lignina (proteínas nao-catalíticas, surfactantes, polímeros) na hidrólise enzimática com o intuito de melhorar o rendimento do processo.¹⁷³ A Tabela 1 traz os principais trabalhos e tipos de aditivos que vêm sendo utilizados na etapa da sacarificaçao da biomassa para aumentar a eficiência da reaçao de hidrólise enzimática.

 

 

Vários estudos reportam a adiçao de outras proteínas, como a albumina sérica bovina (BSA), antes da adiçao das celulases.^{32,156,175,180,201} A proteína BSA possui uma elevada hidrofobicidade superficial, o que contribui para a sua adsorçao preferencial na lignina, pois o bloqueio dos sítios de adsorçao da lignina ocorre nao só pelo efeito da concentraçao de proteínas, mas também devido as suas propriedades químicas.^170,202 No entanto, o uso da proteína BSA se mostra proibitivo em processos de larga escala devido ao custo dessa proteína. Em estudo recente, Florencio et al.¹⁷³ fizeram uso da proteína de soja como aditivo alternativo na hidrólise enzimática do bagaço de cana pré-tratado por explosao a vapor, uma vez que a proteína de soja é considerada uma das proteínas de menor custo disponíveis comercialmente.³ O efeito dos coquetéis enzimáticos produzidos por A. niger e T. reesei sob diferentes métodos de cultivo (FES, FSm e FSeq) foi investigado durante o processo de sacarificaçao. A adiçao da proteína de soja no processo conduziu a um aumento de aproximadamente 2 vezes na conversao da hidrólise de celulose em relaçao ao ensaio controle sem adiçao de proteína de soja, tanto para o coquetel enzimático de A. niger quanto para o de T. reesei. Os resultados levaram a conclusao de que a proteína de soja é um potencial aditivo alternativo de menor custo para ser utilizado no processo de conversao da biomassa.¹⁷³

O efeito da adsorçao improdutiva também pode ser diminuído pela adiçao de polímeros, como o polietileno glicol (PEG). Existem algumas explicaçoes possíveis desse efeito que incluem a capacidade do PEG de aumentar a estabilidade das celulases, diminuir a adsorçao nao-produtiva de celulases e aumentar a dessorçao de enzimas adsorvidas.^{31,174,203,204} A adiçao de PEG na etapa de hidrólise enzimática de biomassas lignocelulósicas pré-tratadas por explosao a vapor (pinho, salgueiro, palha de trigo, palha de milho, bagaço de sorgo) mostrou ser benéfica para o aumento das celulases livres no sobrenadante da hidrólise.¹⁸⁷ Os resultados sugerem que o diferente grau de aumento na atividade das celulases livres obtidos pela adiçao do PEG é baseado nas distintas estruturas de lignina presentes em cada substrato. Os autores concluíram que os grupos hidroxil fenólicos expostos na superfície da lignina interagem com o PEG por meio de ligaçoes de hidrogênio, formando uma camada de PEG na superfície da lignina, o que impede a ligaçao improdutiva das celulases na lignina. Em contraponto, estudos recentes apresentaram resultados interessantes quanto ao efeito da adiçao de PEG durante o processo de hidrólise do Avicel, celulose pura e cristalina, pelas enzimas endoglucanase, produzida a partir da linhagem Talaromyces emersonii, e celobiohidrolase I de Trichoderma longibrachiatum.¹⁸⁴ Segundo os autores, o efeito positivo sobre o rendimento da hidrólise parece ser específico para a enzima celobiohidrolase I,¹⁸⁴ visto que nao há presença da lignina nesse material.

A adiçao de surfactantes nao-iônicos também tem sido base de estudos para diminuir o efeito negativo da adsorçao improdutiva e consequentemente melhorar o rendimento da hidrólise. As presenças de Tween 20 e Tween 80 podem eliminar a desativaçao enzimática atribuída à lignina, devido à exclusao das enzimas da superfície da lignina, além da atuaçao na dessorçao das celulases dos substratos durante a sacarificaçao, o que aumenta o rendimento da mesma.^{192,198,199,205} O estudo do efeito da adiçao de Tween 80 na hidrólise da palha de milho realizada por enzimas comerciais permitiu compreender melhor o papel da lignina na reduçao da adsorçao das celulases sobre o substrato, em parte devido à adsorçao do surfactante que ocupava a superfície hidrofóbica da lignina da palha de milho.²⁰⁶

Em resumo, o uso de aditivos mais comumente encontrados na literatura (proteínas nao catalíticas, polímeros e surfactantes nao-iônicos), assim como a proteína de soja, que vem sendo testada como uma alternativa mais economica, é significativamente eficaz e reduz a adsorçao improdutiva das enzimas do complexo celulolítico sobre a lignina, além de proteger as enzimas da desnaturaçao térmica durante o processo de hidrólise.

 

CONSIDERAÇOES FINAIS

Nesta revisao foram abordadas estratégias de cultivo para melhorar a produçao on-site de enzimas celulolíticas como forma de diminuir o custo dos biocatalisadores no processo de etanol 2G, apresentando as vantagens e deficiências do uso de cada processo para a produçao de enzimas fúngicas que atuam na bioconversao de resíduos lignocelulósicos. O sinergismo entre as enzimas fúngicas também tem sido reconhecido como uma estratégia eficaz para o desenvolvimento de bioprodutos a partir da biomassa lignocelulósica. Nesse sentido, o uso mais extensivo de tecnologias ômicas fúngicas, incluindo genômica, proteoma e secretoma sao considerados estrategicamente importantes para uma melhor compreensao dos papéis individuais e interativos das glicosil-hidrolases, das carboidratos-esterases, das ligninases e das proteínas auxiliares fúngicas na degradaçao da lignocelulose e na produçao e valorizaçao dos subprodutos. E além da questao relacionada ao custo e características das enzimas, destaca-se que os desafios atuais para a implantaçao do processo de conversao da biomassa em larga escala estao diretamente relacionados à necessidade de minimizar a adsorçao improdutiva das enzimas na lignina, visando aumentar a eficiência da etapa de hidrólise enzimática e, consequentemente, a reduçao do custo no processo global para a que seja possível viabilizar a produçao sustentável do etanol 2G a partir de recursos renováveis.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem às agências de fomento Capes, CNPq (Proc. 401182/2014-2) e FAPESP-BIOEN (Processos 2014/19000-3 e 2016/10636-8) pelo apoio financeiro. Os autores também sao gratos à colaboraçao do Dr. Eduardo Ximenes e Dr. Michael Ladisch (LORRE, Purdue University).

 

REFERENCIAS

1. Morales, M.; Quintero, J.; Conejeros, R.; Aroca, G.; Renewable Sustainable Energy Rev. 2015, 42, 1349.

2. Pereira, S. C.; Maehara, L.; Machado, C. M. M.; Farinas, C. S.; Biotechnol. Biofuels 2015, 8, 1.

3. Klein-Marcuschamer, D.; Oleskowicz-Popiel, P.; Simmons, B. A.; Blanch, H. W.; Biotechnol. Bioeng. 2012, 109, 1083.

4. Johnson, E.; Biofuels, Bioprod. Biorefin. 2016, 10, 164.

5. Liu, G.; Zhang, J.; Bao, J.; Bioprocess Biosyst. Eng. 2016, 39, 133.

6. Chandel, A. K.; da Silva, S. S.; Carvalho, W.; Singh, O. V.; J. Chem. Technol. Biotechnol. 2012, 87, 11.

7. Cunha, F. M.; Esperanca, M. N.; Zangirolami, T. C.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Bioresour. Technol. 2012, 112, 270.

8. Delabona, P. D.; Farinas, C. S.; da Silva, M. R.; Azzoni, S. F.; Pradella, J. G. D.; Bioresour. Technol. 2012, 107, 517.

9. Cunha, F. M.; Esperança, M. N.; Florencio, C.; Vasconcellos, V. M.; Farinas, C. S.; Badino, A. C.; Biochem. Eng. J. 2015, 97, 32.

10. Florencio, C.; Cunha, F. M.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2015, 175, 1389.

11. Johnson, E.; Biofuels, Bioprod. Biorefin. 2016, 10, 164.

12. Singhania, R. R.; Sukumaran, R. K.; Patel, A. K.; Larroche, C.; Pandey, A.; Enzyme Microb. Technol. 2010, 46, 541.

13. Vasconcellos, V. M.; Tardioli, P. W.; Giordano, R. L. C.; Farinas, C. S.; Process Biochem. 2015, 50, 1701.

14. Florencio, C.; Cunha, F. M.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Ximenes, E.; Ladisch, M. R.; Enzyme Microb. Technol. 2016, 90, 53.

15. Florencio, C.; Cunha, F. M.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Ximenes, E.; Ladisch, M. R.; Data in Brief 2016, 8, 588.

16. Cunha, F. M.; Vasconcellos, V. M.; Florencio, C.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Waste Biomass Valorization 2017, 8, 517.

17. Gusakov, A. V.; Trends Biotechnol. 2011, 29, 419.

18. Jourdier, E.; Cohen, C.; Poughon, L.; Larroche, C.; Monot, F.; Ben Chaabane, F.; Biotechnol. Biofuels 2013, 6.

19. Martinez, D.; Berka, R. M.; Henrissat, B.; Saloheimo, M.; Arvas, M.; Baker, S. E.; Chapman, J.; Chertkov, O.; Coutinho, P. M.; Cullen, D.; Danchin, E. G. J.; Grigoriev, I. V.; Harris, P.; Jackson, M.; Kubicek, C. P.; Han, C. S.; Ho, I.; Larrondo, L. F.; de Leon, A. L.; Magnuson, J. K.; Merino, S.; Misra, M.; Nelson, B.; Putnam, N.; Robbertse, B.; Salamov, A. A.; Schmoll, M.; Terry, A.; Thayer, N.; Westerholm-Parvinen, A.; Schoch, C. L.; Yao, J.; Barabote, R.; Nelson, M. A.; Detter, C.; Bruce, D.; Kuske, C. R.; Xie, G.; Richardson, P.; Rokhsar, D. S.; Lucas, S. M.; Rubin, E. M.; Dunn-Coleman, N.; Ward, M.; Brettin, T. S.; Nat. Biotechnol. 2008, 26, 1193.

20. Castro, L.d.S.; Pedersoli, W. R.; Antonio, A. C. C.; Steindorff, A. S.; Silva-Rocha, R.; Martinez-Rossi, N. M.; Rossi, A.; Brown, N. A.; Goldman, G. H.; Faa, V. M.; Persinoti, G. F.; Silva, R. N.; Biotechnol. Biofuels 2014, 7.

21. Pandey, A.; Selvakumar, P.; Soccol, C. R.; Nigam, P.; Curr. Sci. 1999, 77, 149.

22. de Vries, R. P.; Visser, J.; Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001, 65, 497.

23. Souza, W. R.; Gouvea, P. F.; Savoldi, M.; Malavazi, I.; Bernardes, L. A. D.; Goldman, M. H. S.; de Vries, R. P.; Oliveira, J. V. D.; Goldman, G. H.; Biotechnol. Biofuels 2011, 4, 16.

24. Kang, S. W.; Park, Y. S.; Lee, J. S.; Hong, S. I.; Kim, S. W.; Bioresour. Technol. 2004, 91, 153.

25. Schuster, A.; Schmoll, M.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87, 787.

26. Borin, G. P.; Sanchez, C. C.; de Souza, A. P.; de Santana, E. S.; de Souza, A. T.; Paes Leme, A. F.; Squina, F. M.; Buckeridge, M.; Goldman, G. H.; de Castro Oliveira, J. V.; PLoS One 2015, 10, e0129275.

27. Zhang, Z.; O'Hara, I. M.; Doherty, W. U. S.; Bioresour. Technol. 2012, 120, 149.

28. Nasirpour, N.; Mousavi, S. M.; Shojaosadati, S. A.; Bioresour. Technol. 2014, 169, 33.

29. Palonen, H.; Tjerneld, F.; Zacchi, G.; Tenkanen, M.; J. Biotechnol. 2004, 107, 65.

30. Yang, B.; Willies, D. M.; Wyman, C. E.; Biotechnol. Bioeng. 2006, 94, 1122.

31. Börjesson, J.; Engqvist, M.; Sipos, B.; Tjerneld, F.; Enzyme Microb. Technol. 2007, 41, 186.

32. Ko, J. K.; Ximenes, E.; Kim, Y.; Ladisch, M. R.; Biotechnol. Bioeng. 2015, 112, 447.

33. Sipos, B.; Dienes, D.; Schleicher, A.; Perazzini, R.; Crestini, C.; Siika-aho, M.; Réczey, K.; Enzyme Microb. Technol. 2010, 47, 84.

34. Valencia, E. Y.; Chambergo, F. S.; Fungal Genet. Biol. 2013, 60, 9.

35. Gupta, V. K.; Kubicek, C. P.; Berrin, J.-G.; Wilson, D. W.; Couturier, M.; Berlin, A.; Filho, E. X. F.; Ezeji, T.; Trends Biochem. Sci. 2016, 41, 633.

36. Shallom, D.; Shoham, Y.; Curr. Opin. Microbiol. 2003, 6, 219.

37. Zhang, Z.; Donaldson, A. A.; Ma, X.; Biotechnol. Adv. 2012, 30, 913.

38. de Castro, A. M.; Pereira, N.; Quim. Nova 2010, 33, 181.

39. Levasseur, A.; Drula, E.; Lombard, V.; Coutinho, P. M.; Henrissat, B.; Biotechnol. Biofuels 2013, 6.

40. Frandsen, K. E. H.; Simmons, T. J.; Dupree, P.; Poulsen, J. C. N.; Hemsworth, G. R.; Ciano, L.; Johnston, E. M.; Tovborg, M.; Johansen, K. S.; von Freiesleben, P.; Marmuse, L.; Fort, S.; Cottaz, S.; Driguez, H.; Henrissat, B.; Lenfant, N.; Tuna, F.; Baldansuren, A.; Davies, G. J.; Lo Leggio, L.; Walton, P. H.; Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 298.

41. Rogowski, A.; Basle, A.; Farinas, C. S.; Solovyova, A.; Mortimer, J. C.; Dupree, P.; Gilbert, H. J.; Bolam, D. N.; J. Biol. Chem. 2014, 289, 53.

42. Horn, S. J.; Vaaje-Kolstad, G.; Westereng, B.; Eijsink, V. G. H.; Biotechnol. Biofuels 2012, 5.

43. Zhang, Z.; Lohr, L.; Escalante, C.; Wetzstein, M.; Energies 2009, 2, 320.

44. Dashtban, M.; Buchkowski, R.; Qin, W.; Int. J. Biochem. Mol. Biol. 2011, 2, 274.

45. Juhász, T.; Szengyel, Z.; Réczey, K.; Siika-Aho, M.; Viikari, L.; Process Biochem. 2005, 40, 3519.

46. Delabona, P. D.; Pirota, R.; Codima, C. A.; Tremacoldi, C. R.; Rodrigues, A.; Farinas, C. S.; Biomass Bioenergy 2012, 37, 243.

47. Pirota, R.; Tonelotto, M.; Delabona, P. D.; Tremacoldi, C. R.; Farinas, C. S.; Cienc. Rural 2015, 45, 1606.

48. Gomez-Mendoza, D. P.; Junqueira, M.; do Vale, L. H. F.; Domont, G. B.; Ferreira Filho, E. X.; de Sousa, M. V.; Ornelas Ricart, C. A.; J. Proteome Res. 2014, 13, 1810.

49. Pinto Braga, C. M.; Delabona, P. d. S.; Lima, D. J. d. S.; Alvaredo Paixao, D. A.; da Cruz Pradella, J. G.; Farinas, C. S.; Bioresour. Technol. 2014, 170, 316.

50. Banerjee, G.; Scott-Craig, J. S.; Walton, J. D.; Bioenergy Res. 2010, 3, 82.

51. Wyman, C. E.; Abstr. Pap. Am. Chem. Soc. 2001, 221, U119.

52. Sassner, P.; Galbe, M.; Zacchi, G.; Biomass Bioenergy 2008, 32, 422.

53. Wingren, A.; Galbe, M.; Roslander, C.; Rudolf, A.; Zacchi, G.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2005, 121, 485.

54. Aden, A.; Foust, T.; Cellulose 2009, 16, 535.

55. Lynd, L. R.; Laser, M. S.; Bransby, D.; Dale, B. E.; Davison, B.; Hamilton, R.; Himmel, M.; Keller, M.; McMillar, J. D.; Sheehan, J.; Wyman, C. E.; Nat. Biotechnol. 2008, 26, 169.

56. Kazi, F. K.; Fortman, J. A.; Anex, R. P.; Hsu, D. D.; Aden, A.; Dutta, A.; Kothandaraman, G.; Fuel 2010, 89, S20.

57. Merino, S. T.; Cherry, J.; Biofuels 2007, 108, 95.

58. Hong, Y.; Nizami, A.-S.; Bafrani, M. P.; Saville, B. A.; MacLean, H. L.; Biofuels Bioprod. Biorefin. 2013, 7, 303.

59. Takimura, O.; Yanagida, T.; Fujimoto, S.; Minowa, T.; J. Jpn. Pet. Inst. 2013, 56, 150.

60. Singhania, R. R.; Patel, A. K.; Soccol, C. R.; Pandey, A.; Biochem. Eng. J. 2009, 44, 13.

61. Sanchez, S.; Demain, A. L.; Org. Process Res. Dev. 2011, 15, 224.

62. Farinas, C. S.; Renewable Sustainable Energy Rev. 2015, 52, 179.

63. Pandey, A.; Process Biochem. 1992, 27, 109.

64. Pandey, A.; J. Sci. Ind. Res. 1996, 55, 311.

65. Holker, U.; Hofer, M.; Lenz, J.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004, 64, 175.

66. Thomas, L.; Larroche, C.; Pandey, A.; Biochem. Eng. J. 2013, 81, 146.

67. Barrios-González, J.; Process Biochem. 2012, 47, 175.

68. Holker, U.; Lenz, J.; Curr. Opin. Microbiol. 2005, 8, 301.

69. Delabona, P.d.S.; Perpetua Buzon Pirota, R. D.; Codima, C. A.; Tremacoldi, C. R.; Rodrigues, A.; Farinas, C. S.; Ind. Crops Prod. 2013, 42, 236.

70. Delabona, P. D.; Lima, D. J.; Robl, D.; Rabelo, S. C.; Farinas, C. S.; Pradella, J. G. D.; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2016, 43, 617.

71. Vasconcellos, V. M.; Tardioli, P. W.; Giordano, R. L. C.; Farinas, C. S.; New Biotechnol. 2016, 33, 331.

72. Rodriguez-Zuniga, U. F.; Farinas, C. S.; Neto, V. B.; Couri, S.; Crestana, S.; Pesqui. Agropecu. Bras. 2011, 46, 912.

73. Rodriguez-Zuniga, U. F.; Couri, S.; Neto, V. B.; Crestana, S.; Farinas, C. S.; Bioenerg Res. 2013, 6, 142.

74. Rodriguez-Zuniga, U. F.; Neto, V. B.; Couri, S.; Crestana, S.; Farinas, C. S.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2014, 172, 2348.

75. Renge, V. C.; Khedkar, S. V.; Nandurkar, N. R.; J. Appl. Microbiol. 2012, 2, 585.

76. Mathew, G. M.; Sukumaran, R. K.; Singhania, R. R.; Pandey, A.; J. Sci. Ind. Res. 2008, 67, 898.

77. Gamarra, N. N.; Villena, G. K.; Gutierrez-Correa, M.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87, 545.

78. Cherry, J. R.; Fidantsef, A. L.; Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 438.

79. Hansen, G. H.; Lubeck, M.; Frisvad, J. C.; Lubeck, P. S.; Andersen, B.; Process Biochem. 2015, 50, 1327.

80. Cunha, F. M.; Kreke, T.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Ximenes, E.; Ladisch, M. R.; Bioresour. Technol. 2014, 172, 249.

81. Farinas, C. S.; Scarpelini, L. M.; Miranda, E. A.; Neto, V. B.; Braz. J. Chem. Eng. 2011, 28, 17.

82. Delabona, P.d.S.; Farinas, C. S.; da Silva Lima, D. J.; da Cruz Pradella, J. G.; Bioresour. Technol. 2013, 132, 401.

83. Farinas, C. S.; Loyo, M. M.; Baraldo, A.; Tardioli, P. W.; Neto, V. B.; Couri, S.; New Biotechnol. 2010, 27, 810.

84. Farinas, C. S.; Vitcosque, G. L.; Fonseca, R. F.; Neto, V. B.; Couri, S.; Ind. Crops Prod. 2011, 34, 1186.

85. Messner, R.; Kubicek, C. P.; Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57, 630.

86. Merivuori, H.; Siegler, K. M.; Sands, J. A.; Montenecourt, B. S.; Biochem. Soc. Trans. 1985, 13, 411.

87. Messner, R.; Kubicekpranz, E. M.; Gsur, A.; Kubicek, C. P.; Arch. Microbiol. 1991, 155, 601.

88. Kubicek, C. P.; J. Biotechnol. 2013, 163, 133.

89. Sternberg, D.; Mandels, G. R.; J. Bacteriol. 1979, 139, 761.

90. Karaffa, L.; Fekete, E.; Gamauf, C.; Szentirmai, A.; Kubicek, C. P.; Seiboth, B.; Microbiology 2006, 152, 1507.

91. Bhadauria, V.; Popescu, L.; Zhao, W.-S.; Peng, Y.-L.; Microbiol. Res. 2007, 162, 285.

92. Bhadauria, V.; Zhao, W.-S.; Wang, L.-X.; Zhang, Y.; Liu, J.-H.; Yang, J.; Kong, L.-A.; Peng, Y.-L.; Microbiol. Res. 2007, 162, 193.

93. Chen, S.; Harmon, A. C.; Proteomics 2006, 6, 5504.

94. Kim, Y.; Nandakumar, M. P.; Marten, M. R.; Trends Biotechnol. 2007, 25, 395.

95. Tjalsma, H.; Bolhuis, A.; Jongbloed, J. D. H.; Bron, S.; van Dijl, J. M.; Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000, 64, 515.

96. Bouws, H.; Wattenberg, A.; Zorn, H.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 80, 381.

97. Carberry, S.; Doyle, S.; Cytotechnology 2007, 53, 95.

98. Ribeiro, D. A.; Cota, J.; Alvarez, T. M.; Bruechli, F.; Bragato, J.; Pereira, B. M. P.; Pauletti, B. A.; Jackson, G.; Pimenta, M. T. B.; Murakami, M. T.; Camassola, M.; Ruller, R.; Dillon, A. J. P.; Pradella, J. G. C.; Paes Leme, A. F.; Squina, F. M.; PLoS One 2012, 7, e50571.

99. Jorgensen, T. R.; Goosen, T.; van den Hondel, C. A. M. J. J.; Ram, A. F. J.; Iversen, J. J. L.; BMC Genomics 2009, 10.

100. Javier Fernandez-Acero, F.; Colby, T.; Harzen, A.; Carbu, M.; Wieneke, U.; Manuel Cantoral, J.; Schmidt, J.; Proteomics 2010, 10, 2270.

101. Lu, X.; Sun, J.; Nimtz, M.; Wissing, J.; Zeng, A.-P.; Rinas, U.; Microb. Cell Fact. 2010, 9.

102. Jun, H.; Guangye, H.; Daiwen, C.; J. Proteomics 2013, 89, 191.

103. Mahajan, S.; Master, E. R.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 86, 1903.

104. Jun, H.; Kieselbach, T.; Jonsson, L. J.; Microb. Cell Fact. 2011, 10.

105. Verbeke, J.; Coutinho, P.; Mathis, H.; Quenot, A.; Record, E.; Asther, M.; Heiss-Blanquet, S.; Biotechnol. Lett. 2009, 31, 1399.

106. Medina, M. L.; Kiernan, U. A.; Francisco, W. A.; Fungal Genet. Biol. 2004, 41, 327.

107. Foreman, P. K.; Brown, D.; Dankmeyer, L.; Dean, R.; Diener, S.; Dunn-Coleman, N. S.; Goedegebuur, F.; Houfek, T. D.; England, G. J.; Kelley, A. S.; Meerman, H. J.; Mitchell, T.; Mitchinson, C.; Olivares, H. A.; Teunissen, P. J. M.; Yao, J.; Ward, M.; J Biol. Chem. 2003, 278, 31988.

108. Adav, S. S.; Ravindran, A.; Chao, L. T.; Tan, L.; Singh, S.; Sze, S. K.; J. Proteome Res. 2011, 10, 4579.

109. Chao, Y.; Singh, D.; Yu, L.; Li, Z.; Chi, Z.; Chen, S.; World J. Microbiol. Biotechnol. 2012, 28, 2635.

110. Herpoel-Gimbert, I.; Margeot, A.; Dolla, A.; Jan, G.; Molle, D.; Lignon, S.; Mathis, H.; Sigoillot, J.-C.; Monot, F.; Asther, M.; Biotechnol. Biofuels 2008, 1.

111. Adav, S. S.; Chao, L. T.; Sze, S. K.; Mol. Cell. Proteomics 2012, 11.

112. Tsang, A.; Butler, G.; Powlowski, J.; Panisko, E. A.; Baker, S. E.; Fungal Genet. Biol. 2009, 46, S153.

113. Oliveira, J. M. P. F.; van Passel, M. W. J.; Schaap, P. J.; de Graaff, L. H.; PLoS One 2011, 6, e20865.

114. Montibeller, V. W.; Vandenberghe, L. P. D.; Amore, A.; Soccol, C. R.; Birolo, L.; Vinciguerra, R.; Salmon, D. N. X.; Spier, M. R.; Faraco, V.; Bioresources 2014, 9, 7128.

115. Ries, L.; Pullan, S. T.; Delmas, S.; Malla, S.; Blythe, M. J.; Archer, D. B.; BMC Genomics 2013, 14.

116. Adav, S. S.; Cheow, E. S. H.; Ravindran, A.; Dutta, B.; Sze, S. K.; J. Proteomics 2012, 75, 3694.

117. Delmas, S.; Pullan, S. T.; Gaddipati, S.; Kokolski, M.; Malla, S.; Blythe, M. J.; Ibbett, R.; Campbell, M.; Liddell, S.; Aboobaker, A.; Tucker, G. A.; Archer, D. B.; PLoS Genetics 2012, 8, e1002875.

118. Hakkinen, M.; Arvas, M.; Oja, M.; Aro, N.; Penttila, M.; Saloheimo, M.; Pakula, T. M.; Microb. Cell Fact. 2012, 11.

119. da Silva, A. J.; Gomez-Mendoza, D. P.; Junqueira, M.; Domont, G. B.; Ferreira, E. X.; de Sousa, M. V.; Ricart, C. A. O.; Proteomics 2012, 12, 2729.

120. Delabona, P.d.S.; Cota, J.; Hoffmam, Z. B.; Alvaredo Paixao, D. A.; Farinas, C. S.; Lourenco Franco Cairo, J. P.; Lima, D. J.; Squina, F. M.; Ruller, R.; da Cruz Pradella, J. G.; Bioresour. Technol. 2013, 131, 500.

121. Marx, I. J.; van Wyk, N.; Smit, S.; Jacobson, D.; Viljoen-Bloom, M.; Volschenk, H.; Biotechnol. Biofuels 2013, 6.

122. Crivelente Horta, M. A.; Vicentini, R.; Delabona, P.d.S.; Laborda, P.; Crucello, A.; Freitas, S.; Kuroshu, R. M.; Polikarpov, I.; da Cruz Pradella, J. G.; Souza, A. P.; PLoS One 2014, 9, e88689.

123. Stricker, A. R.; Mach, R. L.; de Graaff, L. H.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 78, 211.

124. Glass, N. L.; Schmoll, M.; Cate, J. H. D.; Coradetti, S.; Annu. Rev. Microbiol. 2013, 67, 477.

125. Tani, S.; Kawaguchi, T.; Kobayashi, T.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 4829.

126. Mosier, N.; Wyman, C.; Dale, B.; Elander, R.; Lee, Y. Y.; Holtzapple, M.; Ladisch, M.; Bioresour. Technol. 2005, 96, 673.

127. Modenbach, A. A.; Nokes, S. E.; Biomass Bioenerg 2013, 56, 526.

128. Kim, Y.; Hendrickson, R.; Mosier, N. S.; Ladisch, M. R.; Bals, B.; Balan, V.; Dale, B. E.; Bioresour. Technol. 2008, 99, 5206.

129. Hu, J.; Chandra, R.; Arantes, V.; Gourlay, K.; van Dyk, J. S.; Saddler, J. N.; Bioresour. Technol. 2015, 186, 149.

130. Ramos, L. P.; da Silva, L.; Ballem, A. C.; Pitarelo, A. P.; Chiarello, L. M.; Silveira, M. H. L.; Bioresour. Technol. 2015, 175, 195.

131. Zeng, M. J.; Mosier, N. S.; Huang, C. P.; Sherman, D. M.; Ladisch, M. R.; Biotechnol. Bioeng. 2007, 97, 265.

132. Kim, Y.; Ximenes, E.; Mosier, N. S.; Ladisch, M. R.; Enzyme Microb. Technol. 2011, 48, 408.

133. Jonsson, L. J.; Alriksson, B.; Nilvebrant, N. O.; Biotechnol. Biofuels 2013, 6.

134. Mhlongo, S. I.; den Haan, R.; Viljoen-Bloom, M.; van Zyl, W. H.; Enzyme Microb. Technol. 2015, 81, 16.

135. Cantarella, M.; Cantarella, L.; Gallifuoco, A.; Spera, A.; Alfani, F.; Biotechnol. Prog. 2004, 20, 200.

136. Qing, Q.; Yang, B.; Wyman, C. E.; Bioresour. Technol. 2010, 101, 9624.

137. Ximenes, E.; Kim, Y.; Mosier, N.; Dien, B.; Ladisch, M.; Enzyme Microb. Technol. 2010, 46, 170.

138. Ma, X. J.; Cao, S. L.; Yang, X. F.; Lin, L.; Chen, L. H.; Huang, L. L.; Bioresour. Technol. 2014, 151, 244.

139. Martinez, P. M.; Bakker, R.; Harmsen, P.; Gruppen, H.; Kabel, M.; Ind. Crops Prod. 2015, 64, 88.

140. Yan, Z. P.; Li, J. H.; Li, S. H.; Chang, S.; Cui, T.; Jiang, Y.; Cong, G. T.; Yu, M. H.; Zhang, L.; Appl. Energy 2015, 160, 641.

141. Yu, Q.; Zhuang, X. S.; Wang, W.; Qi, W.; Wang, Q.; Tan, X. S.; Kong, X. Y.; Yuan, Z. H.; Biomass Bioenergy 2016, 94, 105.

142. Santi Junior, C.; Ferreira Milagres, A. M.; Ferraz, A.; Carvalho, W.; Cellulose 2013, 20, 3165.

143. Maia, E. P.; Colodette, J. L.; Rev. Arvore 2003, 27, 217.

144. Eudes, A.; Liang, Y.; Mitra, P.; Loque, D.; Curr. Opin. Biotechnol. 2014, 26, 189.

145. Benjamin, Y.; Cheng, H.; Goergens, J. F.; Ind. Crops Prod. 2013, 51.

146. Benjamin, Y.; Cheng, H.; Goergens, J. F.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2014, 172.

147. Kumar, L.; Arantes, V.; Chandra, R.; Saddler, J.; Bioresour. Technol. 2012, 103, 201.

148. Oliveira, F. M. V.; Pinheiro, I. O.; Souto-Maior, A. M.; Martin, C.; Goncalves, A. R.; Rocha, G. J. M.; Bioresour. Technol. 2013, 130.

149. Arantes, V.; Gourlay, K.; Saddler, J. N.; Biotechnol. Biofuels 2014, 7.

150. Kim, Y.; Mosier, N. S.; Ladisch, M. R.; Biotechnol. Progr. 2009, 25, 340.

151. Kim, Y.; Kreke, T.; Ko, J. K.; Ladisch, M. R.; Biotechnol. Bioeng. 2015, 112, 677.

152. Chang, V. S.; Holtzapple, M. T.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2000, 84-6, 5.

153. Mooney, C. A.; Mansfield, S. D.; Tuohy, M. G.; Saddler, J. N.; Biological Sciences Symposium, San Francisco, USA,1997.

154. Várnai, A.; Siika-aho, M.; Viikari, L.; Enzyme Microb. Technol. 2010, 46, 185.

155. Lee, S. H.; Doherty, T. V.; Linhardt, R. J.; Dordick, J. S.; Biotechnol. Bioeng. 2009, 102, 1368.

156. Ko, J. K.; Kim, Y.; Ximenes, E.; Ladisch, M. R.; Biotechnol. Bioeng. 2015, 112, 252.

157. Claesson, P. M.; Blomberg, E.; Froberg, J. C.; Nylander, T.; Arnebrant, T.; Adv. Colloid Interface Sci. 1995, 57, 161.

158. Norde, W.; Macromol. Symp. 1996, 103, 5.

159. Jeoh, T.; Ishizawa, C. I.; Davis, M. F.; Himmel, M. E.; Adney, W. S.; Johnson, D. K.; Biotechnol. Bioeng. 2007, 98, 112.

160. Berlin, A.; Gilkes, N.; Kurabi, A.; Bura, R.; Tu, M. B.; Kilburn, D.; Saddler, J.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2005, 121, 163.

161. Rahikainen, J.; Mikander, S.; Marjamaa, K.; Tamminen, T.; Lappas, A.; Viikari, L.; Biotechnol. Bioeng. 2011, 108.

162. Nakagame, S.; Chandra, R. P.; Saddler, J. N.; Biotechnol. Bioeng. 2010, 105, 871.

163. Michelin, M.; Ximenes, E.; Teixeira de Moraes Polizeli, M. d. L.; Ladisch, M. R.; Bioresour. Technol. 2016, 199, 275.

164. Linder, M.; Mattinen, M. L.; Kontteli, M.; Lindeberg, G.; Stahlberg, J.; Drakenberg, T.; Reinikainen, T.; Pettersson, G.; Annila, A.; Protein Sci. 1995, 4, 1056.

165. Rahikainen, J. L.; Martin-Sampedro, R.; Heikkinen, H.; Rovio, S.; Marjamaa, K.; Tamminen, T.; Rojas, O. J.; Kruus, K.; Bioresour. Technol. 2013, 133, 270.

166. Yu, Z.; Gwak, K.-S.; Treasure, T.; Jameel, H.; Chang, H.-m.; Park, S.; Chemsuschem 2014, 7, 1942.

167. Lou, H.; Zhu, J. Y.; Lan, T. Q.; Lai, H.; Qiu, X.; ChemSusChem 2013, 6, 919.

168. Nakagame, S.; Chandra, R. P.; Kadla, J. F.; Saddler, J. N.; Bioresour. Technol. 2011, 102, 4507.

169. Lai, C.; Tu, M.; Shi, Z.; Zheng, K.; Olmos, L. G.; Yu, S.; Bioresour. Technol. 2014, 163, 320.

170. Sammond, D. W.; Yarbrough, J. M.; Mansfield, E.; Bomble, Y. J.; Hobdey, S. E.; Decker, S. R.; Taylor, L. E.; Resch, M. G.; Bozell, J. J.; Himmel, M. E.; Vinzant, T. B.; Crowley, M. F.; J. Biol. Chem. 2014, 289, 20960.

171. Reinikainen, T.; Teleman, O.; Teeri, T. T.; Proteins: Struct., Funct., Genet. 1995, 22, 392.

172. Rahikainen, J. L.; Evans, J. D.; Mikander, S.; Kalliola, A.; Puranen, T.; Tamminen, T.; Marjamaa, K.; Kruus, K.; Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 315.

173. Florencio, C.; Badino, A. C.; Farinas, C. S.; Bioresour. Technol. 2016, 221, 172.

174. Kristensen, J. B.; Borjesson, J.; Bruun, M. H.; Tjerneld, F.; Jorgensen, H.; Enzyme Microb. Technol. 2007, 40, 888.

175. Yang, B.; Wyman, C. E.; Biotechnol. Bioeng. 2006, 94, 611.

176. Zheng, Y.; Pan, Z.; Zhang, R.; Wang, D.; Jenkins, B.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, 146, 231.

177. Kumar, R.; Wyman, C. E.; Biotechnol. Bioeng. 2009, 102, 1544.

178. Ouyang, J.; Dong, Z.; Song, X.; Lee, X.; Chen, M.; Yong, Q.; Bioresour. Technol. 2010, 101, 6685.

179. Brethauer, S.; Studer, M. H.; Yang, B.; Wyman, C. E.; Bioresour. Technol. 2011, 102, 6295.

180. Wang, H.; Mochidzuki, K.; Kobayashi, S.; Hiraide, H.; Wang, X.; Cui, Z.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2013, 170, 541.

181. Ge, X.; Sun, Z.; Xin, D.; Zhang, J.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2014, 172, 2106.

182. Hui, W.; Shinichi, K.; Kazuhiro, M.; Bioresour. Technol. 2015, 190, 373.

183. Wang, H.; Kobayashi, S.; Hiraide, H.; Cui, Z.; Mochidzuki, K.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2015, 175, 287.

184. Hsieh, C.-w.C.; Cannella, D.; Jorgensen, H.; Felby, C.; Thygesen, L. G.; Biotechnol. Biofuels 2015, 8.

185. Lou, H.; Wang, M.; Lai, H.; Lin, X.; Zhou, M.; Yang, D.; Qiu, X.; Bioresour. Technol. 2013, 146, 478.

186. Cannella, D.; Jorgensen, H.; Biotechnol. Bioeng. 2014, 111, 59.

187. Sipos, B.; Szilagyi, M.; Sebestyen, Z.; Perazzini, R.; Dienes, D.; Jakab, E.; Crestini, C.; Reczey, K.; C. R. Biol. 2011, 334, 812.

188. Zhou, Y.; Chen, H.; Qi, F.; Zhao, X.; Liu, D.; Bioresour. Technol. 2015, 182, 136.

189. Monschein, M.; Reisinger, C.; Nidetzky, B.; Bioresour. Technol. 2014, 169, 713.

190. Li, Y.; Ge, X.; Sun, Z.; Zhang, J.; Bioresour. Technol. 2015, 186, 316.

191. Zhang, M.; Ouyang, J.; Liu, B. T.; Yu, H.; Jiang, T.; Cai, C.; Li, X.; Bioenergy Res. 2013, 6, 1252.

192. Eriksson, T.; Borjesson, J.; Tjerneld, F.; Enzyme Microb. Technol. 2002, 31, 353.

193. Alkasrawi, M.; Eriksson, T.; Borjesson, J.; Wingren, A.; Galbe, M.; Tjerneld, F.; Zacchi, G.; Enzyme Microb. Technol. 2003, 33, 71.

194. Seo, D.-J.; Fujita, H.; Sakoda, A.; Adsorption 2011, 17, 813.

195. Ballesteros, I.; Oliva, J. M.; Carrasco, J.; Cabanas, A.; Navarro, A. A.; Ballesteros, M.; Appl. Biochem. Biotechnol. 1998, 70-2, 369.

196. Tu, M.; Saddler, J. N.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, 161, 274.

197. Yang, M.; Zhang, A.; Liu, B.; Li, W.; Xing, J.; Biochem. Eng. J. 2011, 56, 125.

198. Okino, S.; Ikeo, M.; Ueno, Y.; Taneda, D.; Bioresour. Technol. 2013, 142, 535.

199. Jin, W. X.; Chen, L.; Hu, M.; Sun, D.; Li, A.; Li, Y.; Hu, Z.; Zhou, S. G.; Tu, Y. Y.; Xia, T.; Wang, Y. T.; Xie, G. S.; Li, Y. B.; Bai, B. W.; Peng, L. C.; Appl. Energy 2016, 175, 82.

200. Li, Y.; Sun, Z.; Ge, X.; Zhang, J.; Biotechnol. Biofuels 2016, 9, 1.

201. Bhagia, S.; Kumar, R.; Wyman, C. E.; Carbohydr. Polym. 2017, 157, 1940.

202. Lijnzaad, P.; Berendsen, H. J. C.; Argos, P.; Protein: Struct., Funct., Genet. 1996, 25, 389.

203. Börjesson, J.; Peterson, R.; Tjerneld, F.; Enzyme Microb. Technol. 2007, 40, 754.

204. Malmsten, M.; VanAlstine, J. M.; J. Colloid Interface Sci. 1996, 177, 502.

205. Park, J. W.; Takahata, Y.; Kajiuchi, T.; Akehata, T.; Biotechnol. Bioeng. 1992, 39, 117.

206. Li, Y.; Sun, Z.; Ge, X.; Zhang, J.; Biotechnol. Biofuels 2016, 9, 20.