JBCS

INTRODUÇAO

A Quimiometria é uma área da Química extremamente difundida nos dias atuais e muito útil na extraçao de informaçoes dos mais variados sistemas químicos. Além da pesquisa básica, a indústria química utiliza a análise multivariada para otimizar seus processos e, nesse contexto, formar profissionais com o conhecimento necessário é muito importante para o desenvolvimento do setor no país. ¹ Assim, esse artigo pretende dar sequência à série de tutoriais já publicados pela Química Nova para o ensino de Quimiometria. ^2-4 No primeiro desses estudos, a discriminaçao de óleos comerciais por espectroscopia no infravermelho médio foi utilizada para o ensino da Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis, PCA). ² O segundo trabalho empregou a determinaçao da concentraçao do princípio ativo paracetamol em comprimidos com espectroscopia no infravermelho próximo e regressao por mínimos quadrados parciais (PLS, do inglês Partial Least Squares) para o ensino de calibraçao multivariada. ³ Por fim, no terceiro tutorial, a tradicional determinaçao de Ferro (III) com o-fenantrolina através da espectroscopia na regiao do visível foi usada para apresentar os conceitos do planejamento experimental (design of experiments, DOE). ⁴ Todos esses trabalhos foram aplicados em disciplinas de Química Analítica Instrumental lecionadas no Instituto de Química da Unicamp, com muito boa aceitaçao pelos alunos.

A proposta desse atual tutorial é apresentar uma visao diferenciada das análises por espectroscopia no infravermelho próximo (Near Infrared Spectroscopy, NIR), em que análises convencionais sao substituídas por mapeamentos de regioes bem definidas e mais representativas da totalidade da amostra. Essa iniciativa pode ser mais eficiente quando se empregam ferramentas quimiométricas para o tratamento desses dados, como a Resoluçao Multivariada de Curvas (Multivariate Curve Resolution, MCR). Com isso, nao só informaçoes químicas das substâncias que constituem as amostras, mas também informaçoes relacionadas à distribuiçao desses constituintes no material podem ser obtidas. ⁵ Ao se aplicar essa estratégia, sao geradas imagens hiperespectrais, que sao, resumidamente, um conjunto de espectros de uma regiao delimitada da amostra, obtidos com uma técnica analítica com capacidade de responder à determinada propriedade físico-química do material. Para que seja gerada a imagem, a área da amostra deve ser subdividida em unidades menores e, para cada um desses pixels, deve ser obtido um espectro de absorçao, emissao ou reflectância, por exemplo. ^6,7 Na literatura, sao encontrados muitos exemplos dessa abordagem, seja na discriminaçao de nanopartículas magnéticas dispersas em polímero,⁸ na identificaçao de bactérias⁹ ou na análise de produtos alimentícios como carne e presunto cru. ^10,11

Para a geraçao das imagens hiperespectrais, dentre várias técnicas analíticas, podem ser empregadas a espectroscopia Raman¹² ou a espectroscopia no infravermelho médio,¹³ por exemplo. Porém, uma técnica muito útil é a espectroscopia no infravermelho, principalmente na regiao do infravermelho próximo (NIR), de 750 a 2.500 nm ou 13.000 a 4.000 cm^-1, envolvendo fótons com energia compreendida entre 2,65 x 10^-19 a 7,96 x 10^-20 J. ¹⁴ Nesses valores de energia podemos observar vibraçoes de sobretons (primeiro, segundo e terceiro), que sao aquelas que ocorrem do nível vibracional fundamental (n = 0) para os níveis vibracionais superiores (n = 2, 3, 4. . . ). Pela regra de seleçao para o infravermelho, as transiçoes de sobretons nao seriam permitidas, mas acabam acontecendo devido ao fenômeno da anarmonicidade mecânica, ou seja, pelas diferenças de massas dos átomos envolvidos na ligaçao química. Além dos sobretons, bandas de combinaçao também sao observadas pela soma ou subtraçao dos números de onda, que acabam gerando uma banda única. Como na regiao do NIR muitos sobretons e bandas de combinaçao estao sobrepostos, nao há picos específicos a serem atribuídos aos componentes químicos e as diferenças e semelhanças entre os espectros podem ser mais bem compreendidas com o auxílio da Quimiometria. ^14-16 Quando se utiliza a espectroscopia NIR na geraçao de imagens hiperespectrais, temos entao a espectroscopia vibracional de imagem (Near Infrared-Chemical Imaging, NIR-CI), que possui como uma das principais características poder operar com reflectância difusa, diretamente na superfície da amostra. ¹⁷ Por ser uma técnica nao destrutiva e por requerer pouco ou nenhum preparo de amostra,¹⁴ NIR-CI tem sido recomendada pela agência norte-americana Food and Drug Administration (FDA) para uso no controle de processos farmacêuticos. ¹⁸ Sua contribuiçao consiste em verificar se um medicamento está adequado para a venda e consumo ou se o princípio ativo (active pharmaceutical ingredient, API) está disponível no produto. Essas informaçoes sao obtidas de forma rápida e limpa e, muitas vezes, sem consumo de reagentes e geraçao de resíduos tóxicos. Várias sao as contribuiçoes listadas na literatura para a área farmacêutica ao se empregar NIR-CI. ^19-27

Uma aplicaçao citada é o estudo e desenvolvimento de pellets, um dos vários tipos disponíveis de preparaçoes sólidas para uso oral. Pellets sao pequenas estruturas esféricas, com tamanho de partícula controlado e sua produçao normalmente é feita pela aglomeraçao das substâncias na forma de pós finos ou por revestimento por filme, proporcionando a incorporaçao de drogas que sejam incompatíveis entre si. Esse revestimento por filme pode contribuir também para características específicas dos pellets, desde estéticas até a disponibilizaçao uniforme e seletiva do API, evitando sinais de concentraçao no plasma ou a agressao da mucosa intestinal. ²⁸ Além disso, a forma com que o API está disperso no medicamento pode afetar sua solubilizaçao, o que se relaciona diretamente com a biodisponibilidade e, por consequência, com a eficácia terapêutica do fármaco. ²⁹ Normalmente, essa heterogeneidade da amostra nao pode ser avaliada por técnicas convencionais como HPLC ou UV, mas somente os valores globais de seus teores. Já a morfologia das dispersoes sólidas pode ser avaliada por microscopia óptica ou eletrônica de varredura (MEV), sem fornecer informaçoes químicas das amostras. ³⁰ Portanto, conhecer a distribuiçao dos seus componentes é de grande importância para a qualidade do produto final. ^31,32

Resoluçao multivariada de curvas com mínimos quadrados alternantes

As imagens geradas por NIR-CI contêm uma enorme quantidade de informaçao e esses conjuntos de espectros e sua interpretaçao pode ser realizada com métodos de análise multivariada. Tais métodos podem ser tanto de reconhecimento de padroes (como PCA), de classificaçao (como Linear Discriminant Analysis, LDA) ou de calibraçao multivariada (como PLS). ³³ A resoluçao multivariada de curvas por mínimos quadrados alternantes (MCR-ALS) resolve misturas de sinais de forma iterativa, pela otimizaçao dos perfis de concentraçao e dos espectros (matrizes C e S^T) com a aplicaçao de restriçoes prévias. Essas restriçoes sao baseadas no conhecimento químico ou matemático sobre as características dos dados. ^34,35

O método MCR pode ser classificado como uma técnica de análise de fatores,³⁶ na qual se busca isolar as fontes de variaçao de um conjunto de dados, além de resolver e quantificar tais variaçoes. Para isso, a matriz dos dados instrumentais (D) é decomposta pelo algoritmo de quadrados mínimos alternados (ALS) em uma matriz referente à concentraçao relativa de cada substância pura (C) e aos espectros dessas substâncias (S). A expressao para o MRC é descrita na Equaçao 1, onde E é uma matriz de resíduos. ³⁷

 

 

Para a resoluçao da equaçao anterior pelo algoritmo ALS é necessário construir uma estimativa inicial, para que a otimizaçao possa ser começada. Se optarmos por uma estimativa para a matriz S, ela pode ser conseguida através de uma informaçao já conhecida, como espectros das substâncias constituintes do sistema ou um sinal simulado por uma ferramenta matemática que consiga extrair as informaçoes menos aleatórias do sinal original. Além dessa informaçao, restriçoes podem ser aplicadas para limitar as possibilidades de soluçoes para o sistema. Um exemplo sao restriçoes de nao-negatividade, em que soluçoes que contemplem valores negativos para o sinal (S) ou para as concentraçoes relativas (C) sao desconsideradas. Assim, as matrizes C e S^T podem ser construídas em ciclos iterativos de duas etapas, conforme mostrado nas Equaçoes 2 e 3:³⁸

 

 

Uma vez estimadas as matrizes C e S nas etapas indicadas pelas Equaçoes 2 e 3, seu produto pode ser calculado (CS^T) e uma nova matriz, D^*, é reconstruída a cada iteraçao. Essas etapas sao repetidas até que algum critério de convergência estabelecido previamente seja alcançado, como um número máximo de iteraçoes a ser realizado ou caso a variaçao entre o resultado da iteraçao atual e aquele da iteraçao anterior seja menor que um valor pré-estabelecido. ^37,38 É importante ressaltar que, ainda que a convergência seja alcançada nessa etapa iterativa, a soluçao obtida nao é necessariamente a melhor resposta para o conjunto de dados estudado, pois há sempre o risco de se alcançar um mínimo local apesar das restriçoes pré-definidas.

Dessa comparaçao da matriz de dados originais D com essa nova matriz D^* podem ser calculados dois importantes parâmetros, que fornecem informaçoes sobre a qualidade do modelo construído: a porcentagem de falta de ajuste (Lack of Fit, %LOF) e a porcentagem de variância explicada (R²). O primeiro desses parâmetros é calculado conforme descrito na Equaçao 4 e compara cada termo da nova matriz com o termo correspondente da matriz original. Como o desejado é que essas matrizes sejam as mais semelhantes, os valores dos erros (e) devem ser pequenos e o valor de %LOF deverá estar mais próximo a zero. ^37,38

 

 

O segundo parâmetro segue o mesmo raciocínio, comparando as duas matrizes, mas dessa vez descrevendo o quanto da informaçao original está sendo modelada pelo MCR, ou seja, o quanto da matriz original D está contida na nova matriz D^*. A forma de calcular a porcentagem da variância explicada é descrita na Equaçao 5 e o ideal é que 100% da informaçao original seja expressa pelo modelo, sendo portanto desejado um valor para R² próximo a esse. ^37,38

 

 

Com a intençao de difundir e popularizar o uso do MCR como ferramenta analítica, algumas boas iniciativas foram desenvolvidas, como por Jaumot et al. ,³⁵ em 2005. Os autores disponibilizaram gratuitamente uma interface gráfica para ambiente MATLAB^® que permite, de forma intuitiva, a escolha do número de componentes, da estimativa inicial e também permite a aplicaçao de restriçoes. Isso facilita o uso principalmente para usuários menos familiarizados com o software. Essa ferramenta foi sendo aperfeiçoada e hoje conta com uma atualizaçao, que oferece opçoes adicionais de restriçoes, como a restriçao de correlaçao e a inclusao de modelos pré-definidos (hard-modeling), além de formas mais eficientes de apresentaçao dos resultados. ³⁹ Em 2014, Março et al. ³⁷ publicaram uma completa revisao, em língua portuguesa, descrevendo os aspectos teóricos e os avanços do método até entao. Sao discutidos pontos como o uso de estimativas iniciais, a otimizaçao pelo ALS e o uso de restriçoes para minimizar o efeito de ambiguidade rotacional e sua leitura é recomendada para aqueles que desejarem se aprofundar no tema.

Pelo exposto, observa-se que o método de MCR tem grande utilidade na previsao da concentraçao e na distribuiçao dos constituintes das amostras farmacêuticas, sendo viável seu uso em processos industriais e no desenvolvimento de medicamentos. ^25,40-45 O que se propoe entao, nesse tutorial, é apresentar uma opçao para o ensino desses tópicos em disciplinas experimentais de Química Analítica, baseando-se em experiências bem-sucedidas no Instituto de Química da Unicamp.

Pré-tratamento

Uma realidade encontrada pelo analista é que, junto da informaçao desejada, informaçoes nao relevantes sao obtidas no momento da análise e uma boa parte dela pode ser removida em uma etapa criteriosa de pré-tratamento dos dados. Um exemplo sao variaçoes presentes em espectros obtidos por reflectância difusa em NIR, que ocorrem basicamente por fenômenos de espalhamento aditivo e multiplicativo da radiaçao na superfície das partículas. O fator mais importante para o espalhamento da radiaçao está relacionado com o tamanho das partículas do material, sendo um fenômeno essencialmente físico e que normalmente se manifesta como uma variaçao na inclinaçao do espectro. Dentre as possibilidades para a correçao desses efeitos,⁴⁶ uma delas é o uso da Padronizaçao Normal de Sinal (Standard Normal Variate, SNV), que corresponde a autoescalar cada linha da matriz original dos dados. ⁴⁷ Sao calculados o espectro médio (-x) e o desvio padrao (σ_n) das amostras, onde n é o número de amostras e, por consequência, de espectros (Equaçao 6).

 

 

Outra situaçao em que a correçao se faz necessária é na presença de ruído aleatório ao sinal instrumental, composto de erros experimentais, erros de medida e de outras fontes de variabilidade, como oscilaçoes de corrente elétrica ou variaçoes de temperatura durante a medida. Esse ruído pode ser reduzido, mas nao completamente eliminado e essa etapa deve ser muito bem conduzida para também nao remover sinal verdadeiro. Uma forma de remover ruído instrumental é por alisamento, ou seja, pela aplicaçao de um filtro que possibilitará a melhora da razao sinal/ruído (razao entre a intensidade do sinal analítico e a raiz da variância associada ao sinal). Dentre as técnicas de alisamento mais empregadas, estao aquelas que utilizam uma janela móvel, que percorrerá todo o espectro. ¹ Definido o tamanho dessa janela, todos os pontos nesse intervalo serao utilizados para gerar uma única resposta que será atribuída ao centro da janela. Um método muito comum para esse fim é o método Savitzky-Golay,⁴⁸ que gera uma média ponderada com pesos obtidos por um ajuste polinomial como a resposta do ponto central. A janela é movida e o polinômio é ajustado novamente, num processo que só termina quando todas as janelas tiverem sido alisadas. A escolha do grau do polinômio afeta grandemente o resultado do alisamento, com polinômios de graus mais baixos removendo mais ruído, mas com risco maior de distorçao do sinal. Da mesma forma, o uso de janelas maiores causa diminuiçao do ruído, mas também apresenta risco maior de distorcer o sinal. A escolha desses parâmetros deve, portanto, ser cuidadosamente avaliada. ¹

 

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais e reagentes

Para o estudo, foi utilizado um pellet comercial cujo princípio ativo é o cetoprofeno, um fármaco da classe dos anti-inflamatórios nao-esteroides e que apresenta açao anti-inflamatória e analgésica. ⁴⁹ Esses pellets sao constituídos de um núcleo inerte e de camadas que recobrem a regiao central, possuindo diâmetro aproximado de 900 µm. Para a análise, as amostras foram cortadas ao meio com auxílio de lâmina de barbear em uma lupa (Carl Zeiss, modelo Stemi DV4, 8 a 32x de magnificaçao). Após isso, foram afixadas em uma placa de vidro com fita dupla face transparente, para que fossem obtidos os dados que irao corresponder às imagens químicas dos componentes da amostra.

Para a comparaçao dos sinais instrumentais originais com os recuperados pelo modelo MCR, foram usados os reagentes de grau analítico cetoprofeno (Sigma-Aldrich), amido (Synth), sacarose (Synth) e dióxido de silício (Sigma-Aldrich), que foram acondicionados em um porta-amostras de alumínio, cuja cavidade foi completada com o pó do composto químico. Para minimizar o espalhamento da radiaçao, a superfície foi nivelada para que ficasse o mais uniforme possível.

Condiçoes operacionais

A aquisiçao dos espectros das amostras de pellets e das substâncias puras foi realizada no espectrômetro Spectrum 100 N FT-NIR, acoplado a um sistema de imagem Spotlight 400 N, ambos da Perkin-Elmer. As condiçoes operacionais utilizadas sao informadas na Tabela 1.

 

 

Tratamento dos dados experimentais

Os espectros foram obtidos em modo de refletância (R) e convertidos para pseudo-absorbância (log 1/R) e, como pré-tratamento, foi aplicada a padronizaçao normal de sinal,⁴⁷ para minimizar possíveis efeitos de espalhamento da radiaçao e alteraçoes causadas pelo tamanho de partículas. Os dados também foram alisados com janela de 19 pontos para remoçao de ruído experimental pelo método Savitzky-Golay. ⁴⁸

Foi realizada uma etapa de seleçao de espectros para a remoçao dos pixels referentes à placa de vidro e à fita adesiva através da escolha de valores de escores de uma PCA previamente realizada com os dados centrados na média. Assim, foi selecionada uma faixa de valores de escores que corresponde apenas aos espectros dos pellets. Esse processo pôde ser realizado de forma gráfica com o pacote HYPER-Tools, que foi criado especificamente para o tratamento de imagens químicas. ⁵⁰ Por essa razao e também por estar livremente disponível, foi empregado no estudo.

Com esse novo conjunto de dados, um modelo MCR foi construído com 4 componentes. A escolha do número de componentes levou em consideraçao o resultado da PCA com os dados centrados na média, que explicaram mais de 99% da variância.

Como estimativa inicial para o modelo MCR, foi construída uma matriz com o espectro médio de cada uma das substâncias puras, ou seja, a média dos 144 espectros obtidos experimentalmente para cada uma dessas 4 substâncias. Como condiçoes para o modelo MCR, foram impostas as restriçoes de máximo de 500 iteraçoes, erro inferior a 0,1% entre as iteraçoes, além da nao negatividade para a concentraçao.

Todos os cálculos foram efetuados em ambiente MATLAB R2016b (MathWorks, Natick, MA, USA), utilizando os pacotes gratuitos HYPER-Tools⁵⁰ e MCR-ALS. ⁵¹ Como alternativa gratuita ao software MATLAB, pode ser encontrada uma versao em ambiente R no site Comprehensive R Archive Network (CRAN). ⁵² Já para modelos MCR-ALS, existe um pacote, também gratuito, disponível no mesmo site, na seçao Chemometrics and Computational Physics. ⁵³

 

RESULTADOS E DISCUSSAO

Tratamento dos dados

(1) Uma vez finalizadas as análises das amostras e das substâncias puras, conforme indicado na seçao Condiçoes operacionais, sao gerados pelo equipamento arquivos com a extensao .fsm (extensao específica para esse tipo de dados para os equipamentos da Perkin-Elmer), que deverao ser copiados para o diretório de trabalho do MATLAB. O primeiro passo é construir uma estrutura de dados para conter cada um dos sinais (Pellet, Sacarose, Amido, dióxido de silício e Cetoprofeno).

>>DADOS(1).nomes = 'Pellet';

>>DADOS(2).nomes = 'Sacarose';

>>DADOS(3).nomes = 'Amido';

>>DADOS(4).nomes = 'SiO_2';

>>DADOS(5).nomes = 'Cetoprofeno';

(2) Como arquivos com extensao .fsm nao sao reconhecidos pelo MATLAB, é necessário que esses dados sejam extraídos com o emprego da rotina fsmload.m, fornecida pelo fabricante do equipamento, a Perkin-Elmer. Para que essa etapa seja completada, os arquivos devem ter os nomes pellet.fsm, sacarose.fsm, amido.fsm, sio2.fsm e cetoprofeno.fsm ou a referência a eles nas linhas de comando.

>>[DADOS(1).cubo,~,~,SIZE.zAxis,~] = fsmload('pellet.fsm');

>>DADOS(2).cubo=fsmload('sacarose.fsm');

>>DADOS(3).cubo=fsmload('amido.fsm');

>>DADOS(4).cubo=fsmload('sio2.fsm');

>>DADOS(5).cubo=fsmload('cetoprofeno.fsm');

(3) As matrizes de dados criadas possuem três dimensoes, sendo duas delas relacionadas com as dimensoes espaciais e a terceira, com a dimensao espectral. Para o pellet, tem-se a dimensao 52x52x476 e para os demais compostos puros, 12x12x476. Porém, para poder ser resolvido pelo MCR, os cubos de dados devem ser desdobrados em matrizes de duas dimensoes, o que é feito com a rotina reshape.

>>[SIZE.nX,SIZE.nY,SIZE.nZ] = size(DADOS(1).cubo);

>>DADOS(1).brutos = reshape(DADOS(1).cubo,SIZE.nX*SIZE.nY,SIZE.nZ);

>> [SIZE.nx,SIZE.ny,SIZE.nz] = size(DADOS(2).cubo);

>>DADOS(2).brutos = reshape(DADOS(2).cubo,SIZE.nx*SIZE.ny,SIZE.nz);

>>DADOS(3).brutos = reshape(DADOS(3).cubo,SIZE.nx*SIZE.ny,SIZE.nz);

>>DADOS(4).brutos = reshape(DADOS(4).cubo,SIZE.nx*SIZE.ny,SIZE.nz);

>>DADOS(5).brutos = reshape(DADOS(5).cubo,SIZE.nx*SIZE.ny,SIZE.nz);

(4) Os dados brutos podem ser graficados em figuras, conforme descrito abaixo. O mesmo tipo de rotina é empregado para a geraçao das demais figuras no artigo, com adequaçoes nas matrizes e dimensoes de cada caso.

>> [~,SIZE.k] = size(DADOS);

>>for i=1:SIZE.k;

>> subplot(1,ceil(SIZE.k),i);plot(SIZE.zAxis,DADOS(i).brutos');

>> xlabel ('Número de onda (cm^{-1})','FontSize',12.5, 'FontWeight','bold');

>> ylabel ('Reflectância', 'FontSize',12.5, 'FontWeight','bold');

>> if SIZE.zAxis(1) > SIZE.zAxis(2)

>> set(gca, 'XDir', 'reverse')

>> end

>> axis square

>> axis tight

>> h = title([(DADOS(i).nomes) ' Brutos']);

>> set(h,'Color','black', 'FontSize',12.5, 'FontWeight','bold')

>> set(gca,'FontWeight','bold','FontSize',12)

>>end

>>clear i h

Os espectros para os dados brutos do pellet, em valores de reflectância, podem ser vistos na Figura 1. Os demais espectros, para as substâncias puras, sao apresentados na seçao Material Suplementar (Figura 1S).

 

 

(5) Para o tratamento dos dados espectrais de NIR, normalmente realiza-se uma etapa de conversao dos valores de reflectância (R) para log 1/R, que é conhecida como pseudoabsorbância. Isso é necessário para que se possa relacionar a concentraçao diretamente com a intensidade do sinal medido, numa forma análoga à lei de Beer-Lambert. Porém, como essa lei é válida somente para materiais homogêneos e transparentes à radiaçao, Kubelka e Munk,^16,54 desenvolveram um tratamento matemático que consegue relacionar valores de reflectância difusa com as concentraçoes das espécies presentes em uma determinada amostra. O tratamento matemático é bastante rigoroso, mas pode ser simplificado uma vez que na maioria das aplicaçoes há um comportamento linear do sinal com a concentraçao. Nesses casos, passa a ser válida a aproximaçao log 1/R.

>>DADOS(1).absorbancia = (log10(1. /(DADOS(1).brutos. /100)));

>>DADOS(2).absorbancia = (log10(1. /(DADOS(2).brutos. /100)));

>>DADOS(3).absorbancia = (log10(1. /(DADOS(3).brutos. /100)));

>>DADOS(4).absorbancia = (log10(1. /(DADOS(4).brutos. /100)));

>>DADOS(5).absorbancia = (log10(1. /(DADOS(5).brutos. /100)));

Dessa forma, sao obtidos os seguintes perfis dos espectros de pseudoabsorbância sobrepostos para a amostra do pellet (Figura 2). Na seçao Material Suplementar (Figura 2S), sao apresentadas as imagens dos espectros em pseudoabsorbância para as substâncias puras.

 

 

(6) Uma etapa importante para o bom desenvolvimento do modelo MCR é o pré-tratamento dos dados, com ferramentas que resolvem problemas intrínsecos das análises instrumentais. Em análises com NIR, possíveis efeitos de espalhamento da radiaçao e alteraçoes causadas pelo tamanho de partículas podem proporcionar variaçoes nos sinais, como aumentos na linha de base. Para tanto, aplica-se a padronizaçao normal de sinal (SNV), que minimiza esses efeitos. Outra consideraçao é sobre o ruído instrumental causado, por exemplo, por variaçoes de temperatura no detector e oscilaçoes eletrônicas, que podem ser corrigidas através de alisamento. Nesse estudo, aplicou-se o filtro Savitzky-Golay, com janela de 19 pontos. As funçoes para o SNV e alisamento estao disponíveis no pacote HYPER-Tools e sao, respectivamente, htsnv e filpoly. As instruçoes para uso podem ser consultadas com o comando open htsnv ou open filpoly.

>>DADOS(1).snv = htsnv(DADOS(1).absorbancia);

>>DADOS(1).alisamento= filpoly(DADOS(1).snv,[],[-9 9],2,0,[0 0 0]);

>>DADOS(2).snv = htsnv(DADOS(2).absorbancia);

>>DADOS(2).alisamento= filpoly(DADOS(2).snv,[],[-9 9],2,0,[0 0 0]);

>>DADOS(3).snv = htsnv(DADOS(3).absorbancia);

>>DADOS(3).alisamento= filpoly(DADOS(3).snv,[],[-9 9],2,0,[0 0 0]);

>>DADOS(4).snv = htsnv(DADOS(4).absorbancia);

>>DADOS(4).alisamento= filpoly(DADOS(4).snv,[],[-9 9],2,0,[0 0 0]);

>>DADOS(5).snv = htsnv(DADOS(5).absorbancia);

>>DADOS(5).alisamento= filpoly(DADOS(5).snv,[],[-9 9],2,0,[0 0 0]);

Com o pré-tratamento, os espectros do pellet passaram a apresentar o perfil visualizado na Figura 3 e os das demais substâncias podem ser vistos na seçao Material Suplementar, na Figura 3S.

 

 

(7) Após os dados serem processados, o passo seguinte é criar a matriz de estimativas que será usada para iniciar o modelo MCR. Para tanto, deve-se fazer a média dos 144 espectros obtidos instrumentalmente para cada uma das 4 substâncias puras, gerando 4 espectros médios (Figura 4), cada um deles em uma linha dessa matriz de estimativas.

 

 

>>DADOS(1).estimativa=[mean(DADOS(2).alisamento);mean(DADOS(3).alisamento);mean(DADOS(4).alisamento);mean(DADOS(5).alisamento)];

(8) Uma vez criada a matriz de estimativas para iniciar o modelo, é conveniente realizar uma última etapa de tratamento dos dados experimentais. Quando a regiao escolhida é mapeada, além da superfície do pellet, há uma área vizinha à amostra que gera sinal da lâmina de vidro e da fita adesiva. Se o modelo fosse criado com todo o sinal, ao menos uma componente adicional seria necessária para descrever essa regiao, o que aumentaria a complexidade do sistema e até mesmo poderia comprometer a capacidade de descrever a informaçao de interesse. Nesse momento, realiza-se uma PCA com os dados brutos centrados na média e, através dos valores dos escores, seleciona-se uma faixa que represente apenas o sinal da amostra, removendo-se o sinal que nao é de interesse. Esse procedimento pode ser realizado com o uso da rotina htmaskingtool, disponibilizada gratuitamente no pacote HYPER-Tools. ⁵⁰ Cabe ressaltar que, para o perfeito funcionamento do pacote HYPER-Tools, o pacote Image Processing Toolbox, que é comercializado pela Mathworks, deve estar instalado no MATLAB^®. Caso isso nao seja possível, a única alternativa é a de se escolher a regiao pelos valores dos escores da PCA, como indicado a seguir (as opçoes que devem ser utilizadas estao indicadas em negrito). De qualquer forma, essa opçao é capaz de gerar uma seleçao dos pixels muito eficiente.

>>MCR(1).mascara=htmaskingtool(reshape(DADOS(1).brutos,SIZE.nX,SIZE.nY,SIZE.nZ),[])

>>Masking using PCA and histograms --> 1

>>Masking using ROI in one area --> 2

>>Masking using ROI in more than one area --> 3

>>Please, select the type of masking and press enter 1

>>Based on PCA --> 1

>>Based on average image --> 2

>>Please, select the method and press enter 1

>>Mean center, press --> 1

>>NO mean center, press --> 0

>>Do you want to mean center the spectra? 1

>><SPACE>

>>Select component for masking 1

>><ENTER>

Seleciona-se a regiao de interesse observando-se os valores correspondentes ao pellet na barra de cores da imagem superior. Para o caso específico, essa regiao deve começar na regiao inicial, à esquerda, e ir até próximo a 30 na escala do gráfico inferior. Se a regiao escolhida estiver correta, finaliza-se o processo clicando na barra de espaço e respondendo à pergunta abaixo com o número 1. Caso seja necessário repetir a seleçao, deve-se responder à questao com 0 e escolher nova regiao, até que a escolha seja adequada.

>><SPACE>

>>Are you happy with the treshold? yes (1) / no(0) 1

A regiao é, portanto, selecionada graficamente e as etapas descritas acima podem ser visualizadas nas Figuras 4S e 5S, disponíveis no Material Suplementar.

(9) Escolhidos os pixels referentes à amostra, o passo a seguir é construir uma matriz com os espectros selecionados. Isso causa uma diminuiçao da dimensao da matriz dos dados, que originalmente era composta de 2704 espectros e, após a etapa de seleçao, passa a ter 1158 linhas, cerca de 40%. Se por um lado a quantidade total de informaçao diminui, por outro lado essa informaçao é mais seletiva, já que corresponde apenas ao pellet. Isso reduz a complexidade da informaçao a ser modelada e facilita a sua interpretaçao ao final do processo. Os espectros selecionados podem ser vistos na Figura 5.

 

 

(10) Criada a estimativa inicial com os sinais instrumentais das substâncias puras (passo 7) e selecionados os espectros referentes ao pellet (passo 8 e 9), o modelo MCR pode ser executado através da rotina disponibilizada por Tauler em http://www.mcrals.info/ . Essa é uma etapa onde devem ser informadas algumas condiçoes, como a matriz de dados originais (MCR(1).pixelintotal), a matriz com a estimativa inicial (DADOS(1).estimativa), o número de iteraçoes do modelo (100) e o valor máximo permitido para a falta de ajuste (0,1%)

>>[MCR(1).copt,MCR(1).sopt]=als(MCR(1).pixelintotal,DADOS(1).estimativa,1,100,0.1);

Ao se executar a linha de comando acima, a rotina pedirá que sejam informadas as opçoes e restriçoes do modelo MCR, indicadas em negrito nas linhas abaixo:

>>INPUT TYPE OF CONSTRAINTS TO BE APPLIED

>>None (0)

>>Non-negativity (1)

>>Unimodality (2)

>>Closure (3)

>>Equality (known) / Lower than (selectivity) constraints in conc profiles (4)

>>Equality (known) / Lower than (selectivity) constraints in spectra profiles (5)

>>Shape constraints (6)

>>Three-way data structure constraints (7)

>>Enter a vector with the selected constraints, e.g. [1,3,5]

>>Enter the constraints to be applied in the optimization: 1

>>Enter the non-negativity constraints (1=conc / 2=conc and spectra / 3=spectra ): 1

>>Enter the selected algorithm for conc (0 = forced to zero / 1 = nnls / 2 = fnnls): 2

>>normalization 0, 1 or 2?: 0

>>Do you want graphic output during the ALS optimization (y/n)? y

>>Is all the input information correct (y/n)? y

Nesse ponto, a rotina irá fornecer algumas informaçoes, que deverao ser copiadas manualmente, já que nao sao salvas de forma automática. As principais figuras de mérito sao a porcentagem de variância explicada (%R²) e a porcentagem de falta de ajuste (%LOF) e sao elas que indicam a qualidade do modelo criado. A porcentagem de variância explicada está relacionada com o quanto da informaçao original, na forma do sinal instrumental, está sendo descrita pelo modelo MCR. Quanto maior for a variância explicada, ou seja, quanto mais próximo de 100% for o valor calculado, mais fiel será o modelo criado em relaçao aos sinais originais. No caso calculado, o valor foi de 99,91% e indica que apenas uma pequena parcela da informaçao original nao pode ser expressa e está contida na matriz de resíduos (E). A mesma tendência é verificada pela porcentagem de falta de ajuste, que demonstra a diferença entre a matriz de dados originais (D) e a matriz reproduzida pelo modelo MCR (matriz D^* ou CS^T). ³⁵ Como esses valores devem ser inferiores a um e os menores possíveis, o valor de 0,00726 garante que a informaçao recuperada pelo modelo é similar ao sinal original.

(11) Agora podemos comparar os perfis espectrais das substâncias puras com aqueles recuperados pelo MCR, que nos permitirá a possibilidade de identificar os componentes do sistema. Um parâmetro que auxilia nessa verificaçao é o coeficiente de correlaçao (r²), que é relacionado com a matriz de covariância de cada espectro, ou seja:

 

 

>>a=corrcoef(MCR(1).sopt(1,:),DADOS(1).estimativa(1,:));

>>b=corrcoef(MCR(1).sopt(2,:),DADOS(1).estimativa(2,:));

>>c=corrcoef(MCR(1).sopt(3,:),DADOS(1).estimativa(3,:));

>>d=corrcoef(MCR(1).sopt(4,:),DADOS(1).estimativa(4,:));

>>MCR(1).coeficientes=[a(1,2) b(1,2) c(1,2) d(1,2)];

>>clear a b c d

Pelos resultados, podemos afirmar que há uma excelente correlaçao entre os perfis para os componentes sacarose (r² = 0,9867), amido (r² = 0,9861) e cetoprofeno (r² = 0,9970), com bandas coincidentes e altos valores de coeficiente de correlaçao, conforme visto na Figura 6.

 

 

Para o dióxido de silício, nao existem tantas bandas coincidentes, mas sim uma tendência de similaridade entre os perfis. Esse comportamento pode ser atribuído a uma baixa concentraçao do componente no pellet e também à sua natureza química. O dióxido de silício coloidal apresenta baixa densidade, de 0,029 a 0,042 g cm^-3,⁴¹ o que faz com que grande parte da radiaçao seja difundida em seu interior, nao retornando ao detector e dificultando sua identificaçao. Isso se reflete no menor valor obtido para o coeficiente de correlaçao, de 0,9522.

(12) Como a matriz de dados foi desdobrada para a realizaçao do tratamento quimiométrico (passo 3), uma vez terminado o modelo MCR devemos retomar a dimensao original dos dados, recolocando os espectros selecionados pela máscara (passo 8) em sua posiçao original.

>>[SIZE.nx,SIZE.ny]=size(MCR(1).copt);

>>MCR(1).novo_copt=nan(SIZE.nX*SIZE.nY,SIZE.ny);

>>for i=1:MCR(1).comprimento;

>>MCR(1).novo_copt(MCR(1).mascara.pixelintotal(i,1),:)=MCR(1).copt(i,:);

>>end

>>clear i

(13) Dessa forma, imagens com 52 x 52 pixels podem ser construídas para cada um dos componentes resolvidos no modelo MCR-ALS, como indicado abaixo (Figura 7).

 

 

>>[SIZE.k,~] = size(DADOS(1).estimativa);

>>for i=1:SIZE.k;

>>subplot(1,ceil(SIZE.k),i);imagesc(reshape(MCR(1).novo_copt(:,i),SIZE.nX,SIZE.nY,1));

>>axis square

>>h = title(DADOS(i+1).nomes);

>>set(h,'Color','black', 'FontSize',12.5, 'FontWeight','bold')

>>set(gca,'FontWeight','bold','FontSize',12)

>>end

>>clear h k i

A avaliaçao das imagens geradas para a distribuiçao das espécies recuperadas pelo modelo deixa evidente que existem regioes bastante distintas no pellet. Na área central da amostra, há um núcleo inerte contendo sacarose e amido. O uso de um pellet inerte como partida para a deposiçao dos compostos de interesse é uma prática usual na indústria farmacêutica. ^41,55,56 Imediatamente após esse núcleo inerte, há uma camada composta basicamente pelo API cetoprofeno, o que está indicado na imagem como uma regiao com coloraçao vermelha intensa. Por fim, a última espécie estudada é o dióxido de silício, que aparentemente está distribuído mais externamente na amostra, talvez como uma camada de revestimento ou proteçao. Porém, como as condiçoes de obtençao de sinal instrumental para esse composto nao é tao ideal quanto para os demais, há de se ter certo cuidado com os resultados para esse componente. Essas informaçoes nao poderiam ser obtidas em análises por NIR de forma convencional, em que apenas as informaçoes químicas estariam disponíveis, mas nao sua distribuiçao espacial. Técnicas como cromatografia líquida poderiam identificar e quantificar esses compostos, mas de forma global na amostra. Isso indica o quao útil o emprego da técnica de NIR-CI pode ser aos pesquisadores para casos semelhantes.

 

CONCLUSAO

No estudo apresentado, foi proposto um experimento didático que permite o ensino da quimiometria para além dos métodos mais usualmente abordados, como PCA e PLS. O uso de espectroscopia NIR e imagem hiperespectral com MCR-ALS, pelas suas características, pode ser aplicado em disciplinas de graduaçao, pós-graduaçao e também para profissionais que nao possuam experiência com a técnica, expandindo o uso da espectroscopia no infravermelho próximo. Como as etapas de preparo de amostras e de aquisiçao dos dados instrumentais sao bastante simples e rápidas, isso proporciona ao docente a oportunidade de se dedicar à discussao dos conceitos envolvidos em todo o experimento. Nesse momento, pode-se ressaltar as vantagens do uso da espectroscopia de imagem em relaçao às análises convencionais por NIR, bem como descrever o passo-a-passo da técnica de MCR-ALS, para que os alunos entendam perfeitamente seu funcionamento. A presença de todos os comandos e procedimentos descritos de forma detalhada e com o uso de rotinas de acesso livre na internet facilitam a aplicaçao do experimento. Para a avaliaçao do aprendizado dos alunos, além do relatório que é normalmente exigido, indica-se a eventual aplicaçao de um formulário online para inferir o real nível de entendimento dos alunos sobre o tema proposto.

Uma vez compreendido o funcionamento do experimento proposto, a técnica pode ser aplicada a comprimidos que possuam camadas distintas ou preparaçoes farmacêuticas em cremes ou suspensoes, entre tantas outras classes distintas de amostras. A única condiçao é que essas amostras possuam regioes com características distintas, que possam ser discriminadas pelo modelo.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

No material suplementar a esse artigo, que está disponível para download livre, na forma de arquivo PDF, em http://quimicanova.sbq.org.br , sao apresentadas figuras dos sinais dos excipientes amido, sacarose e dióxido de silício, além do princípio ativo cetoprofeno. A Figura 1S mostra os espectros como obtidos pelo equipamento, em reflectância e sem nenhum tratamento prévio. Esses espectros convertidos em valores de pseudoabsorbância sao vistos na Figura 2S e, após serem normalizados e alisados, na Figura 3S. A etapa de seleçao dos pixels referentes ao pellet é detalhada nas Figuras 4S e 5S. A Figura 4S apresenta como é feita a escolha dos valores dos escores da PCA, para a seleçao da regiao de interesse, enquanto na Figura 5S, a regiao efetivamente selecionada em comparaçao com a imagem original. Além disso, todos os passos realizados no estudo estao reunidos no Quadro 1S, o que permite que seja copiado e colado no editor do programa MATLAB^® para que possa ser facilmente utilizado.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem às agências de fomento Capes e CNPq pelo auxílio financeiro e ao técnico do Laboratório de Quimiometria em Química Analítica (LAQQA), H. D. Machado, pelo apoio às atividades do projeto.

 

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