JBCS

INTRODUÇAO

Polissacarídeos fazem parte do nosso cotidiano e representam uma das classes de materiais mais versáteis, destacando-se principalmente nas mais diversas áreas como medicina, materiais e alimentos.¹ No setor farmacêutico, polímeros podem ser utilizados como moduladores e direcionadores da liberaçao de fármacos em sítios específicos no organismo. O que vem ser de grande importância, uma vez que medicamentos tradicionais sao caracterizados por apresentarem liberaçao imediata do fármaco.^2,3 Por outro lado, a liberaçao controlada de fármacos promovida pela encapsulaçao dos compostos ativos em micropartículas carreadoras tem se tornado uma ferramenta bastante útil no sentido de prolongar o tempo de liberaçao do fármaco no organismo.⁴

A pele é considerada o maior órgao do corpo humano, sendo o principal sítio de interaçao com o ambiente externo.⁵ Além disso, a pele serve como uma barreira protetora, sendo capaz de prevenir ou minimizar a exposiçao dos tecidos a eventos traumáticos, radiaçao ultravioleta, variaçoes de temperatura, toxinas e contato direto com microorganismos.⁶

Feridas cutâneas sao caracterizadas pelo rompimento da estrutura e funçao dos tecidos subjacentes.⁷ As feridas podem ser classificadas como agudas ou crônicas, dependendo de sua tendência para o processo de cicatrizaçao.⁸ A cicatrizaçao é descrita como um processo complexo onde múltiplas vias, de eventos fisiopatológicos e bioquímicos que ocorrem em paralelo e de forma inter-relacionada, sao ativadas e sincronizadas para induzir o reparo tecidual.⁹

Aproximadamente um terço de todos os medicamentos derivados de plantas é utilizado para o tratamento de feridas cutâneas ou outras doenças de pele, quando comparado a medicamentos convencionais de uso clínico.¹⁰ O confrei (Symphytum oficinale) é uma planta de origem europeia e asiática utilizada para no tratamento de lesoes cutâneas abertas decorrentes de queimaduras, fraturas e cicatrizaçao de feridas. As partes mais usadas do confrei, cujas propriedades terapêuticas estao relacionadas a presença da alantoína sao as folhas e raízes. A alantoína (Figura 1) é um pó branco, cristalino, de origem orgânica, que favorece a proliferaçao celular acelerando a epitalizaçao em zonas lesadas da pele ou submetidas a um grande desgaste, ou a intempéries do tempo.¹¹

 

 

Desta forma, o desenvolvimento de formulaçoes farmacêuticas envolvendo compostos bioativos encapsulados em matrizes poliméricas, objetivando a liberaçao controlada de fármacos, representa uma nova estratégia para incorporaçao de substâncias ativas e maior controle da liberaçao deste princípio ativo. Além disso, reduz efeitos colaterais indesejados uma vez que utiliza uma menor quantidade do princípio ativo, resultando em menor custo.¹² Dentre as estruturas carreadoras empregadas, incluem-se as micropartículas, as quais sao consideradas Sistemas de Liberaçao de Fármacos (SLF), formadas pela combinaçao polímero-fármaco, em que o fármaco se encontra homogeneamente disperso na matriz polimérica. Esses sistemas possuem algumas vantagens sobre os sistemas implantáveis, pois, devido ao seu tamanho, podem ser colocados diretamente no local desejado, atuando como um reservatório do fármaco e promovendo a sua lenta liberaçao.¹³

Assim, o principal objetivo do presente trabalho foi investigar a capacidade da galactomanana obtida de D. régia para encapsular a alantoína pela técnica de Spray-drying, realizar a caracterizaçao fisico-química por meio de técnicas espectroscópicas (RMN e IV), termo analíticas (TGA e DSC), Microscopia eletrônica de varredura (MEV), raios X, além de verificar a liberaçao controlada da alantoína encapsulada nas micropartículas de galactomanana.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

As sementes de Delonix regia (Hook.) Raf., Leguminosae, foram coletadas entre os meses de março a junho de 2015 no Campus da Universidade Estadual do Ceará, no Município de Fortaleza-CE. Uma exsicata da espécie encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra, do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, sob número de registro 53.140.

Materiais

Foram utilizados alantoína (C₄H₆N₄O₃; 158,121 g mol^-1) adquirida na Sigma - Brasil, e álcool etílico anidro 99,3° INPM (99,5 °GL) na VETEC - Brasil.

Extraçao da galactomanana

As galactomananas foram obtidas a partir do endosperma de 200 g de sementes por extraçao aquosa, seguido por uma precipitaçao com etanol.¹⁴

Preparaçao das micropartículas

Para a preparaçao das micropartículas, 3,2 g de galactomanana atomizada foram pesadas e dissolvida em 800 mL de água destilada em agitaçao constante (700 rpm) e aquecimento de 40 °C por 24 horas. Após decorrer este período, foram adicionados 320 mg de alantoína em agitaçao por 1 hora. Logo após, a soluçao foi atomizada em aparelho spray dryer Buchi-290 do Laboratório de Polímeros Naturais - LABPIN da Universidade Federal do Ceará, usando temperatura de entrada de 120 °C; temperatura de saída de 90 °C; eficiência do exaustor de 90% e fluxo de bomba de 30%.

Eficiência de Encapsulamento

Curva Padrao

Para a construçao da curva padrao analítica, foi preparada uma soluçao estoque aquosa de alantoína em uma concentraçao de 200 µg mL^-1. Diferentes alíquotas desta soluçao foram transferidas para baloes volumétricos de 10 mL e o volume completado com água destilada a fim de obter soluçoes de diferentes concentraçoes (40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 e 5 µg mL^-1). A absorbância das soluçoes foi determinada por espectrometria na regiao UV-Vis em 194 nm, usando água destilada como branco. Com a curva de calibraçao obtivemos a equaçao 1 de regressao linear entre os valores das absorbâncias e a concentraçao da alantoina em µg ml^-1.

Quantificaçao de alantoína nas micropartículas por espectrofotometria UV-Vis

Foram separadas 30 mg de micropartículas para diferentes condiçoes ambientais [temperatura 25 °C, 60 °C e sob açao da luz (λ)] por sete dias. Após decorrer este tempo, para cada amostra das determinadas condiçoes, foram dissolvidos 2 mg em 10 mL de água destilada para obter soluçoes de 200 µg mL^-1 em 10 frascos diferentes, os quais foram analisadas em espectrômetro na regiao UV-Vis a 194 nm. A concentraçao do fármaco foi determinada usando a curva padrao e a eficiência de encapsulamento foi calculada de acordo com a equaçao 2:

sendo EE= eficiência de encapsulaçao; QTD= quantidade de fármaco determinado no sistema polimérico; QTA= quantidade de fármaco teoricamente adicionado no sistema polimérico.

Para calcular o teor de alantoina encapsulada foi utilizada a equaçao 3:

sendo TA (%)= teor de alantoina encapsulada; TTA (%)= teor teórico de alantoina encapsulada; EE= eficiência de encapsulaçao.

Caracterizaçao da galactomanana

Análise por Ressonância Magnética Nuclear do hidrogênio (RMN ¹H)

Foram preparadas soluçoes das amostras da galactomanana (D. regia) em D₂O na concentraçao de 27 mg 600 µL^-1, sendo as amostras deixadas em D₂O nessa concentraçao por 24 horas sob agitaçao constante e a temperatura de 80 °C. Os espectros de ressonância magnética nuclear do hidrogênio (RMN ¹H) foram obtidos por meio do espectrômetro Bruker Spectrometers, modelo Avance DRX-500, com transformada de Fourier, no Centro Nordestino de Aplicaçao e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN), operando na frequência do hidrogênio a 500 MHz e utilizando uma sonda dual de 5 mm. Os espectros foram registrados à temperatura de 80 °C. Foi usado como padrao interno nas amostras o mesmo solvente de sua diluiçao (D₂O). Para os espectros de RMN ¹H, sao integrados os sinais dos hidrogênios pertencentes aos carbonos anoméricos da amostra. Através das integraçoes desses dois sinais, em torno de 5,19 e 5,47 ppm, foi calculada a razao manose:galactose (M:G) da galactomanana da D. regia.

Espectroscopia de absorçao na regiao do infravermelho

Os espectros de absorçao na regiao do infravermelho (IV) foram obtidos utilizando um espectrofotômetro modelo FTIR Spectrometer Frontier, marca Perkin Elmer. Foi utilizado um acessório de reflectância total (ATR) atenuada com um cristal de seleneto de zinco (ZnSe). As amostras foram trituradas com brometo de potássio de grau espectroscópico (KBr) em pó para obtençao das pastilhas. A mediçao IV foi feita no intervalo de números de onda de 500-4.000 cm^-1, resoluçao de 4 cm^-1 e varredura de 16 scans, na Central Analítica da Universidade Federal da Bahia.

Morfologia das micropartículas

A morfologia das amostras de alantoína, galactomanana e micropartículas de galactomanana/alantoína foram visualizadas nas micrografias produzidas pelo Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV), modelo Zeiss DSM 940A operando a 15 kV. As amostras foram preparadas em stubs, camada metálica de platina (60 nm de espessura) no evaporador EMS, na Central Analítica da Universidade Federal do Ceará.

Análises térmicas

As propriedades térmicas das amostras de alantoína, galactomanana e micropartículas de galactomanana/alantoína foram determinadas usando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) e análise termogravimétrica (TGA). As curvas de DSC foram realizadas em um equipamento Shimadzu modelo DSC 50, utilizando cadinho de platina e atmosfera de nitrogênio, com uma vazao de 50 mL min^-1 no intervalo de temperatura de 25-500 °C, a uma taxa de aquecimento de 10 °C min^-1 e a massa das amostras foi de 5 mg. As curvas termogravimétricas das amostras foram obtidas por um equipamento Shimadzu modelo TGA 50, usando um cadinho de platina, atmosfera de ar sintético, com 50 mL min^-1, entre as bandas de temperatura de 25-800 °C, com taxas de aquecimento de 10 °C min^-1, e a massa inicial das amostras analisadas foi de 10 mg. Estas análises foram realizadas no Laboratório de análises térmicas da Universidade Federal do Ceará.

Difraçao de Raios-X

As amostras de alantoína, galactomanana e micropartículas de galactomanana/alantoína foram analisadas em difratômetro Panalytical, Xpert Pro MPDdo Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará, utilizando radiaçao CoKα, uma tensao de 40 kV e uma corrente de 40 mA. A taxa de varredura empregada foi de 0,5° min^-1 em regiao de 3° a 90° de ângulo de difraçao (2θ). As amostras foram trituradas para obtençao de um pó fino antes da análise.

Ensaio de liberaçao in vitro com dispersao direta no meio

Cerca de 10 mg de alantoína e 120 mg de micropartciculas de galactomanana/alantoína exatamente pesados, foram dispersos em 250 mL de água destilada a 37 ± 0,5 °C, sob condiçoes sink, durante 6 horas, utilizando dissolutor (Erweka, modelo DT 800), com aparato II (pá), velocidade de agitaçao de 50 rpm. A metodologia foi adaptada a partir do método descrito pela USP (2007) para cápsulas de liberaçao prolongada de teofilina (teste 3). Foram retiradas alíquotas de 5 mL do meio de dissoluçao em tempos previamente determinados (15, 30, 60, 120, 180, 240, 300 e 360 minutos). As amostras foram diluídas em água destilada e as leituras foram realizadas em espectrofotômetro Genesys, modelo 10 na regiao UV-Vis a 194 nm. O ensaio foi realizado em triplicata.¹⁵

 

RESULTADOS E DISCUSSAO

Caracterizaçao da galactomanana

A proporçao de D-manose e D-galactose foi estimada em 4:1 pela medida direta das áreas relativas aos sinais de ¹H (Man) e ¹H (Gal). Este resultado está de acordo com trabalhos anteriores para outras galactomananas, incluindo a goma da D. regia.¹⁶ Com base no assinalamento dos sinais de hidrogênios anoméricos foram identificados os sinais de H de α-D-manose (5,26 ppm) e de β-D-galactose (5,54 ppm) (Figuras 2 e 3).

 

 

 

 

Eficiência de encapsulamento

De acordo com os resultados observa-se que a eficiência de encapsulamento da alantoína com a galactomanana foi na proporçao 10:1 (galactomanana:alantoína) e o teor de alantoína incorporado ao sistema polimérico em diferentes condiçoes (Tabela 1). Os referidos dados estao de acordo com os de Carlos Souza e colaboradores quando relataram que a microencapsulaçao do ácido L-ascórbico utilizando galactomanana como agente encapsulante foi de aproximadamente 96%.¹⁶

 

 

Espectroscopia de absorçao na regiao do Infravermelho (IV)

A espectroscopia na regiao do infravermelho foi realizada a fim de verificar possíveis interaçoes entre o fármaco e os componentes da matriz polimérica. A análise espectral indicou que as absorbâncias específicas das amostras GLM e GAL apresentaram uma grande semelhança nos seus espectros de IV, o que mostra que as absorbâncias específicas dos grupos funcionais da GAL na superfície das micropartículas têm quase as mesmas características químicas da GAL pura (Figura 4). As frequências de absorçoes estao de acordo com as estruturas típicas de galactomanana de D. regia e de outras espécies.¹⁷ Por meio da análise dos espectros percebe-se que nao houve interaçao química entre a alantoína e polímero, uma vez que nao há o surgimento de novas bandas de absorçao, o que é útil nos processos de microencapsulaçao, denotando que a galactomanana de D. Régia se apresenta como um bom carreador de bioativos, atóxico e sustentável.

 

 

Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A imagem MEV da alantoína (ALA) indica a presença de cristais de forma nao definida (similar a um elipsoide). A micrografia da galactomanana (GAL) revela partículas de aparência esférica dispostas de forma aleatória, com variaçao de tamanho e espessura. Enquanto que, a imagem das micropartículas de galactomanana/alantoína(GLM) revelam um formato regular, permitindo ainda uma boa indicaçao de tamanho (tamanho médio de 2,84 ± 0,41 µm). Também foi observado que a superfície das microcápsulas esféricas se mostrou lisa e regular (Figura 5).

 

 

A morfologia da superfície de sistemas poliméricos tem um papel importante no seu processo de degradaçao e de liberaçao dos fármacos neles presentes, pois a presença de poros ou canais na matriz pode permitir uma difusao do fármaco possivelmente nao controlada pela velocidade de degradaçao do polímero. A quase ausência de cristais adsorvidos na superfície das microcápsulas esféricas de galactomanana/alantoína (GLM) sugere uma boa e efetiva encapsulaçao do princípio ativo. Embora a concentraçao teórica seja de 10%, raros sao os casos em que 100% do fármaco é efetivamente encapsulado durante a formaçao de microesferas poliméricas, podemos considerar uma eficiência de encapsulamento (EE) bastante satisfatória, uma vez que apresentou 84% do ativo incorporado ao polímero, o que está de acordo com a literatura, cujos dados demostram uma eficiência de encapsulaçao de 86% para bixina encapsulada em goma arábica/sacarose (95:5), 82,2% de EE para o licopeno encapsulado em gelatina/sacarose (3:7), 90,2% de EE para a bixina em caseinato de sódio e 55,9 ±5,6% de EE para a vitamina B₂ encapsulada com nanopartículas de alginato/quitosana.^18-21

Vale ressaltar que a literatura comercial relata uma concentraçao de 0,2 a 2% de alatoína pura em formulaçoes tópicas,²² portanto, de acordo com os nossos estudos, seria necessário adicionar aproximadamente 2,4% das micropartículas de alantoína/galactomanana em uma formulaçao tópica para obter o proporcional à 0,2% de alantoína pura mais estável e de liberaçao gradual.

Análises térmicas

O termograma DSC da alantoína mostrou um pico forte endotérmico de 230 °C na temperatura correspondente ao seu ponto de fusao, o que explica a sua cristalinidade. Já o termograma DSC da galactomanana apresenta picos típicos de polissacarídeo natural com eventos endotérmicos na faixa de temperatura entre 150 °C e 1175 °C, aproximadamente, o que pode ser explicado pela evaporaçao da água. Resultados semelhantes foram observados em outras galactomananas.²³ A ausência do pico endotérmico forte da ALA nas micropartículas de GLM atribuído a temperatura de fusao da regiao cristalina é sugestivo da perda da sua estrutura cristalina original resultante do processo de encapsulamento. A ausência do pico de fusao de ALA é também um indicativo de que a alantoína pode ter sido completamente encapsulada (Figura 6), o que está de acordo com a literatura, cujos dados revelam um comportamento similar no desenvolvimento de micropartículas de aciclovir com quitosana, no microencapsulamento da hesperidina e ao encapsular a vitamina C.^24,25

 

 

Conforme o perfil de degradaçao da amostra de galactomanana (GAL), dois eventos característicos de perda de massa foram observados. O primeiro, em torno de 50 °C, apresentou 11,50% de perda de massa e pode ser explicado pela desidrataçao da amostra bem como água adsorvida na superfície da amostra. O segundo evento, próximo a 300 °C, exibiu perda de massa por volta de 82,44 % e pode ser atribuído à degradaçao do polissacarídeo.²⁶

Já o TGA no perfil das micropartículas de galactomanana/alantoína sob açao da temperatura, a maior perda de massa dos compostos ocorre pouco depois do processo de fusao, em torno de 250-330 °C. Comparando as curvas obtidas para galactomanana e micropartículas de galactomanana/alantoína observa-se que nao foram detectadas mudanças significativas no valor do termograma. Observa-se, ainda, que as amostras foram estáveis na faixa de 15-230 °C e tiveram perda significativa de massa na faixa de 250-330 °C (Figura 7).

 

 

Difraçao de Raios-X (DRX)

Na análise do DRX da galactomanana (GAL), observa-se picos largos nao definidos, o que mostra que esta substância nao apresenta cristais, portanto possui estrutura amorfa.²⁷ O estado cristalino da alantoína (ALA) foi evidenciado no difratograma de DRX; o perfil exibiu vários picos bem definidos em 2θ. O difratograma das micropartículas de galactomanana/alantoína (GLM) apresentou picos semelhantes do biopolímero puro, indicando que o fármaco pode estar encapsulado no sistema, na forma amorfa (Figura 8).

 

 

Comportamento semelhante foi observado no trabalho de Devkar e colaboradores,²⁸ os quais produziram carreadores nanoestruturados por freeze dried e também observaram que houve reduçao da intensidade dos picos de DRX da droga, sugerindo a conversao da forma cristalina para a forma amorfa.

Ensaio de liberaçao in vitro com dispersao direta no meio

A velocidade de liberaçao de fármacos a partir de sistemas microparticulados pode ser influenciada pela combinaçao de diversos fatores, como características da matriz polimérica (espessura, porosidade, capacidade de intumescimento), tamanho das micropartículas, localizaçao do ativo no interior das partículas, das propriedades físico-químicas do fármaco e do polímero.²⁹

Os resultados apresentados demonstraram que o ensaio feito com as micropartículas galactomanana/alantoína configuraram uma liberaçao controlada, uma vez que os desvios-padroes obtidos foram valores bem abaixo dos valores que a Farmacopeia Brasileira preconiza que é correspondente a 5%.²⁹ Com estes resultados, pode-se inferir que as amostras de micropartículas galactomanana/alantoína foram bem elaboradas e, além da liberaçao gradual, tem a vantagem de aumentar o tempo de estabilidade da alantoína. Outro aspecto relevante que se deve inferir com estes resultados é que, ao final das 6 horas do ensaio de liberaçao, o teor final de liberaçao chegou aos 100%, valor este que está de acordo com o intervalo estipulado e permitido pela Farmacopeia Brasileira, os quais podem variar em 85% a 120%.³⁰ Observa-se, ainda, que ocorreu a liberaçao controlada do ativo alantoína através da parede polimérica das micropartículas, ao longo das 6 horas de ensaio, pois a mesma liberou este ativo de forma bastante gradual. Já o ensaio das amostras de alantoína pura chegou à 100% em até 5 minutos (Figura 9).

 

 

Considerando tudo o que foi apresentado acima, pode-se concluir que a produçao destas micropartículas, além de promover a proteçao do ativo, aumentando sua estabilidade e vida útil, também permite que este material possa ser administrado como fármaco, uma vez que a microencapsulaçao ajudou a controlar a liberaçao da alantoina.

 

CONCLUSOES

A produçao de microcápsulas de alantoína revestidas com galactomanana extraída da espécie D. regia através da técnica de secagem por atomizaçao por spray drying, juntamente com a caracterizaçao físico-química, a eficiência de encapsulaçao e a liberaçao controlada foram relevantes para o composto alantoína. As informaçoes obtidas no espectro de IV sugeriram a formaçao da parede polimérica da cápsula contendo alantoína. As micropartículas apresentaram morfologia com intervalo de tamanho de partícula média 2,84 ± 0,41 µm, observadas através da análise do MEV. A difraçao de raios X mostrou a perda de cristalinidade do ativo após a encapsulaçao e a calorimetria explanatória diferencial exibiu a perda do seu pico de fusao. A eficiência de encapsulaçao para as micropartículas foi de aproximadamente 84% para as diferentes condiçoes ambientais, como temperaturas de 25 °C e 60 °C, e sob açao da luz (λ). A liberaçao controlada das microcápsulas e somente do ativo alantoína apresentaram os resultados de acordo com a Farmacopeia Brasileira 2010, mostrando-se uma liberaçao gradual da alantoína presente nas micropartículas ao longo do tempo estipulado para analise em comparaçao a liberaçao do ativo puro, a qual foi muito rápida. Este resultado permitiu inferir que a produçao destas micropartículas, além de promover a proteçao do ativo, aumentando sua estabilidade e vida útil, também permite que este material possa ser administrado como fármaco de uso tópico em pacientes que necessitem tratamento de regeneraçao celular cutânea. O conjunto dos resultados obtidos neste trabalho é relevante e credencia o sistema desenvolvido como uma possível alternativa para formaçao de fármacos naturais encapsulados.

 

AGRADECIMENTOS

A FUNCAP, ao CNPq e à CAPES pelas bolsas e apoio financeiro, ao Mestrado Acadêmico em Recursos Naturais da UECE, ao Laboratório de Polímeros e Inovaçao da UFC, ao Laboratório de Química de Produtos Naturais da UECE, ao CEAUREM, à Central Analítica da UFC, ao Departamento de Física da UFC, ao Laboratório de Controle de Qualidade da Farmácia Escola da UFC e à Central Analítica da UFBA.

 

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