JBCS

INTRODUÇAO

Com o avanço da nanotecnologia foi possível produzir nanopartículas de ferro as quais apresentam características físico-químicas diferenciadas quando comparadas às características apresentadas em micro/macroescala. Além disso, o átomo de ferro pode originar outros compostos a partir de diferentes combinaçoes, como por exemplo os óxidos de ferro.^1,2 Dentre as nanopartículas (NPs) metálicas, as de óxido de ferro se destacam no mercado devido às suas características físico-químicas, como sua grande capacidade cinética, grande área de superfície em relaçao ao volume, alta reatividade, possíveis propriedades magnéticas, além de permitirem o recobrimento com diversos tipos de ligantes específicos.^3-7

Atualmente a maioria dos estudos de NPs de óxidos de ferro (NP Fe₂O₃) na área ambiental está direcionada à remediaçao (nanorremediaçao), que consiste na utilizaçao das nanoparticulas para a descontaminaçao da água e solo.^5,8 Em relaçao a área médica, sua utilizaçao ocorre principalmente como meio de contraste em imagens por ressonância magnética, carreadores de fármacos, em pesquisas gênicas, proteômica e tratamentos anticâncer.^2,6,7,9-12 As NP Fe₂O₃ também sao utilizadas como constituintes de diferentes tipos de materiais comercializados: tintas, revestimentos, plásticos, cosméticos,¹³ nutrientes² e semicondutores.⁸ Assim, devido à ampla comercializaçao de produtos que apresentam NPs em sua composiçao, é observado como consequência um aumento do descarte das mesmas nos ambientes aquático e terrestre.^14-16

No ambiente, as NP Fe₂O₃ tendem a se agregar ou aglomerar com outros diferentes compostos dispersos no meio, podendo levar à alteraçao de suas características físico-químicas, as quais anteriormente eram consideradas estáveis devido a sua produçao em meio controlado.^14,17 Desta forma, quando descartadas no ambiente, podem tornar-se instáveis e sofrer degradaçao, oferecendo risco para os seres vivos.^5,18 Diante de tais fatores, os possíveis efeitos adversos e riscos para a saúde causados por estas nanopartículas por mecanismos relacionados à citotoxicidade e à genotoxicidade precisam ser melhor compreendidos, pois podem ser potencialmente tóxicas aos organismos, assim como apresentar novas características e se tornar carreadoras de outros compostos tóxicos.^19-21

Após a introduçao de NPs no ambiente, estas podem sofrer alteraçoes que envolvem processos biológicos, físicos e químicos, os quais dificultam sua avaliaçao e quantificaçao no ambiente, sendo difícil verificar o grau de toxicidade. Até o momento, os estudos com as NP Fe₂O₃ mostram diferentes efeitos toxicológicos, tais como alteraçao no ciclo celular, dano no DNA, alteraçoes de proteínas e dano mitocondrial,²² entretanto, o conhecimento atual sobre seus efeitos ainda é restrito. É sugerido que o mecanismo que desencadeia o estresse oxidativo pode ocasionar reaçoes inflamatórias, as quais resultam na toxicidade destas NPs.²²

Estudos sobre os efeitos ecotoxicológicos de nanopartículas em meio aquático vêm sendo realizados, como o estudo de Hao et al.,²³ no qual foram verificados danos nas membranas lipídicas de células e de organelas celulares e consequentemente disfunçao celular por formaçao de espécies reativas de oxigênio (EROs) em carpas (Cyprinus carpio) expostas a NPs de titânio. Outro estudo mostra que embrioes de zebrafish (Danio rerio) expostos a 10 mg L^-1 de NP Fe₂O₃ apresentaram malformaçao,²⁴ enquanto embrioes de medaka (Oryzias latipes) expostos a NP Fe₂O₃ nas concentraçoes 0,5; 5,0 e 50 µg mL^-1 apresentaram inibiçao da enzima superóxido dismutase (SOD) e induçao de peroxidaçao lipídica por formaçao de malondialdeido (MDA), neste estudo foi mostrado que houve a induçao de EROs apenas nas maiores concentraçoes de NPs, no entanto, nos adultos expostos às mesmas concentraçoes de NPs nao foram observados danos celulares, mostrando que as defesas antioxidantes foram eficientes.²⁵

Alguns estudos toxicológicos utilizando plantas demonstraram os possíveis efeitos das NP Fe₂O₃ sobre as mesmas. Em estudo realizado com rabanete (Raphanus sativus) foi observada uma reduçao no desenvolvimento da cultura devido à adsorçao das NPs na semente e à liberaçao de íons livres de ferro.²⁶ Já em estudos realizados com tomates (Solanumlyco persicum), expostos a 100 mg L^-1 de NP Fe₂O₃, foi observado estresse hídrico e também processo de oxidaçao com formaçao de EROs, devido à agregaçao das NPs nas raízes.²⁷

Embora existam estudos que avaliem a toxicidade de NP Fe₂O₃, ainda se faz necessária a padronizaçao de testes e a compreensao da açao destas NPs nos sistemas biológicos. Nesse estudo foi realizada a caracterizaçao de uma nanopartícula de óxido de ferro (Fe₂O₃) comercial (Sigma Aldrich), em dois diferentes meios (água e meio de cultura DMEM), em seguida foi avaliada a citotoxicidade e a genotoxicidade in vitro, além do potencial genotóxico in vivo e alteraçoes bioquímicas em indivíduos adultos da espécie Danio rerio (zebrafish). Tais estudos apresentam grande relevância devido à necessidade da ampliaçao dos conhecimentos sobre as açoes nocivas das nanopartículas de óxido de ferro (Fe₂O₃), podendo contribuir assim para o conhecimento científico na área da nanotecnologia.

MATERIAL E MÉTODOS

Nanopartículas

Neste estudo foram utilizadas nanopartículas de Fe₂O₃ comercial (Sigma-Aldrich Chemistry - ≤ 100 nm; dispersao entre 15 a 25% wt; densidade 1,07 -1,27 g mL^-1; pH entre 3,4 - 4,0; 20 wt % em água).

Linhagens celulares

Para realizaçao dos testes de viabilidade celular, cometa e caracterizaçao em diferentes meios de dispersao foram utilizadas linhagens celulares padrao (American Type Colection Culture-ATCC) provenientes do Banco de células do Rio de Janeiro (A549, V79, 3T3 e HeLa). As células foram mantidas em garrafas com meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino em estufa, com atmosfera úmida, a 5% de CO₂ e em temperatura de 37 ºC.

Animais

Peixes da espécie Danio rerio (massa corpórea: 0,4 ± 0,06 mg, comprimento total: 2,9 ± 0,3 cm), obtidos na World Fish SA, Brasil, foram aclimatados durante 10 dias em aquários de 40 L em sistema semi-estático e aeraçao constante. Os animais foram alimentados "ad libitum" com raçao comercial para peixes (TetraMin Tropical Flakes). As variáveis físicas e químicas da água (temperatura: 23-25 ºC, oxigênio dissolvido: 6,19-7,82 mg L^-1, pH: 6-7, condutividade: 40-58 µS cm^-3, alcalinidade: 35-43 mg L^-1 como CaCO₃ e dureza total: 39-50 mg L^-1 como CaCO₃) foram monitoradas e se mantiveram constantes durante o período de aclimataçao e os ensaios de exposiçao.

Após o período de aclimataçao foi realizada a exposiçao dos peixes às nanopartículas, visando o estudo da ecotoxicidade das mesmas por meio de análise cometa e ensaios bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo. Os peixes foram expostos a controle, 1,96 x 10⁹ NPs mL^-1, 3,90 x 10⁹ NPs mL^-1 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1, durante 72 horas. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro aquários, em duplicata de aquários (n=15 peixes/aquário 2 L) em sistema semi-estático. Durante o período de exposiçao os animais nao foram alimentados.

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Sorocaba (protocolo 004/2012). Todos os procedimentos seguiram a resoluçao nº 1000 de 11 de março de 2012 que dispoe sobre procedimentos e métodos de eutanásia em animais e dá outras providências.

Caracterizaçao das nanopartículas

A caracterizaçao das nanopartículas foi realizada visando à obtençao dos parâmetros físico-químicos diâmetro hidrodinâmico e índice de polidispersao (PDI), através da técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS), e potencial zeta, por mobilidade eletroforética. Para essas análises as nanopartículas foram diluídas a 500 µg mL^-1 e os resultados analíticos foram obtidos a partir da média de 3 leituras realizadas a um ângulode 90º, a temperatura de 25 ºC, utilizando o equipamento Zetasizer Nano-ZS90 (MalvernInstruments). A distribuiçao de tamanho e a concentraçao das nanopartículas (NPs mL^-1) foram obtidas pela técnica de rastreamento de nanopartículas (NTA). A amostra foi diluída 20.000 vezes em água ultrapura e as leituras realizadas utilizando o equipamento NanoSight LM14 e o software NanoSight v. 2.3.

A caracterizaçao das NPs foi realizada no início do estudo em dispersao em água ultrapura e também em meio de cultura DMEM. Para fins de verificaçao de alteraçoes nos parâmetros físico-químicos, a caracterizaçao também foi realizada após a exposiçao dos peixes.

Avaliaçoes da citotoxicidade e genotoxicidade das NPs

Viabilidade celular

Para avaliaçao da viabilidade celular, diferentes linhagens celulares foram expostas às NP Fe₂O₃ em concentraçoes entre 1,96 x 10¹ e 1,96 x 10¹¹ NPs mL^-1. Para a análise foi utilizado o kit Tali Apoptosis - Annexin V AlexaFluor^® 488 and Propidium Iodide, conforme instruçoes do fabricante, seguida de leitura em citômetro de imagem Tali Image-Based (Invitrogen).

Ensaio Cometa

Para a análise cometa in vitro utilizando linhagens celulares, a exposiçao às nanopartículas de Fe₂O₃ foi realizada nas concentraçoes de 1,96 x 10⁷, 1,96 x 10⁸ e 1,96 x 10⁹ NPs mL^-1. Para as análises cometa in vivo com D. rerio, após o período de aclimataçao e exposiçao, os peixes foram anestesiados com 250 mg L^-1 de benzocaína e o sangue (10 µL) foi coletado por punçao da veia dorsal da nadadeira anal. Em seguida, os animais ainda anestesiados foram eutanasiados por secçao medular indolor. As brânquias foram retiradas e mantidas em soro fetal bovino a 8 ºC.

O ensaio cometa foi realizado segundo metodologia adaptada de Azqueta et al.²⁸ e Collins, Dusinka e Horska.²⁹ Logo após a exposiçao, no caso do ensaio in vitro, ou a coleta, no caso do ensaio in vivo, as células foram homogeneizadas em agarose low melting 0,8% e espalhadas em lâminas preparadas anteriormente com agarose 1,5%. Após montagem, as lâminas foram mergulhadas em soluçao de lise por 1 h, seguida de neutralizaçao. Posteriormente, as lâminas foram mantidas em tampao de eletroforese a 4 ºC por 20 minutos seguido de corrida por 20 minutos, 1,6 V cm^-1. Ao final da eletroforese, as lâminas foram secas, fixadas e coradas com soluçao de prata. As análises foram realizadas em microscópio ótico (40x) sendo consideradas aproximadamente 150 células por lâmina seguindo critério de score visual proposto por Collins, Fleming, Gedik.³⁰ O Indice de danos (ID) de cada tratamento foi calculado dividindo-se o score de cada lâmina pelo número de células analisadas.

Ensaio Allium cepa

A avaliaçao por Allium cepa foi realizada após exposiçao das raízes às nanopartículas de Fe₂O₃ por 24 h nas concentraçoes 1,9 x 10⁹; 3,9 x 10⁹; 19,6 x 10⁹ e 39 x 10⁹ NPs mL^-1. Após o tempo de contato as raízes foram fixadas em Carnoy (Acido acético e etanol 1:3) por 24 h, seguida por hidrólise ácida (Acido Clorídrico 1 mol/L) a 60 ºC. Após a hidrólise, as raízes foram coradas em reativo de Schiff por 2 h. As lâminas foram montadas por esmagamento da regiao meristemática banhada em uma gota de Carmin Acético 2%.

Foi entao realizada análise microscópica por meio da contagem de 1000 células por lâmina (triplicata). O índice de alteraçoes (IA) foi calculado, sendo IA = Número de células com alteraçoes cromossômicas/Total de células em divisao.

Análises bioquímicas

Após a exposiçao dos peixes, foi realizada a coleta dos órgaos cérebro, coraçao, fígado, pele e músculo, os quais foram dissociados em PBS 7,2 (1:10 w/v) e centrifugados por 20 min a 10.500 rpm, -4 ºC. Após este procedimento o sobrenadante foi imediatamente acondicionado em freezer -80 ºC.

A determinaçao da concentraçao de proteína nas amostras dos órgaos foi realizada de acordo com o método descrito por Bradford.³¹

A atividade da Catalase (CAT) foi avaliada pelo decaimento da concentraçao de H₂O₂ de acordo com o método descrito por Beutler.³² A atividade da Glutationa Peroxidase (GPx) foi determinada pela oxidaçao de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) em presença de t-butyl de acordo com o método descrito por Beutler.³³ A atividade da Glutationa-S-Transferase (GST) foi realizada utilizando como substrato o reagente 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) de acordo com o método descrito por Keen et al.³⁴ A atividade específica de cada enzima foi expressa em unidades internacionais por micrograma (µg) de proteína (UI/mg de proteína).

Análise Estatística dos resultados

A estatística foi realizada utilizando a análise de variância (One-way, ANOVA com teste posterior de Tukey-Kramer), o programa utilizado foi o GraphPadPrism 7.0, significância definida como p <0,05.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Caracterizaçao físico-química das nanopartículas de Fe₂O₃ dispersas em diferentes meios

A caracterizaçao físico-química das NPs de Fe₂O₃ dispersas em água ultra pura e meio de cultura DMEM foi realizada 24 horas após a dispersao. A concentraçao das NPs para a análise foi de 500 µg mL^-1, concentraçao correspondente a 1,96 x 10¹¹ NPs mL^-1 (Figura 1)

Figura 1. Diâmetro médio (A), índice de polidispersao (B) e potencial zeta (C) ± desvio padrao das nanopartículas de óxido de ferro na concentraçao de 1,96 x 10¹¹ NPs mL^-1 nos seguintes meios dispersantes: água ultra pura, meio de cultura DMEM

As NP Fe₂O₃ dispersas em meio DMEM apresentaram maior diâmetro quando comparadas às NP Fe₂O₃ dispersas em água (Figura 1A). Provavelmente este resultado é devido à formaçao de corona que ocorre quando as NPs sao dispersas em meio contendo proteínas, podendo ocorrer o processo de adsorçao das mesmas pela superfície metálica, e a consequente alteraçao no diâmetro das NPs pode alterar suas características físico-químicas.^35-37

Os resultados de PDI (Figura 1B) indicam a homogeneidade das NPs tanto em água como em meio de cultura, já o potencial zeta (Figura 1C) apresentou variaçoes nos diferentes meios, sendo que a dispersao em meio de cultura alterou o valor de positivo para negativo. Isso se deve, provavelmente, à carga negativa das proteínas presentes na corona.³⁸

Caracterizaçao físico-química das nanopartículas Fe₂O₃ na água após exposiçao dos peixes

Para avaliar a possibilidade de alteraçao nos parâmetros físico-químicos, as nanopartículas dispersas em água foram avaliadas após a exposiçao dos peixes por 72 h, isto foi realizado uma vez que, a literatura mostra que estas podem interagir com substâncias do ambiente e alterar suas características e consequentemente sua toxicidade. As análises mostraram alteraçoes das características das nanopartículas quando comparadas aos parâmetros obtidos anteriormente à exposiçao, sendo possível observar maior tamanho, consequência de possível agregaçao, maior polidispersao, resultado da perda de homogeneidade, e aumento do potencial zeta, provavelmente em consequência da formaçao de corona proteica através da interaçao com o ambiente (Tabela 1).

Os dados referentes a diâmetro, polidispersao e potencial zeta das nanopartículas após a exposiçao em culturas celulares mostrou que estas apresentam pequena alteraçao após exposiçao, mostrando maior estabilidade quando comparadas à exposiçao em água com peixes, porém é necessário considerar que o ambiente foi controlado, existindo apenas metabólitos resultantes das células em exposiçao. Situaçao diferente da exposiçao em água com peixes, as quais estavam expostas a dejetos, os quais podem ter colaborado para a agregaçao.

Resultados apresentados em estudos referentes à agregaçao de nanopartículas de ferro mostram que estas podem ocasionar efeitos tóxicos em organismos aquáticos. Amde et al.,³⁹ em revisao realizada sobre NPs de óxidos metálicos relatam que devido as características físico-químicas das NPs pode ocorrer agregaçao/aglomeraçao, o que pode induzir à deposiçao deste material no sedimento, com consequente diminuiçao da concentraçao de NPs metálicas em suspensao ao longo do tempo, em contraponto ao aumento ocorrido nos sedimentos. Outro fator a ser considerado é que no ambiente as NP Fe₂O₃ podem sofrer dissociaçao levando à liberaçao de íons, fato que pode interferir na toxicidade nos sistemas biológicos.

Em estudo realizado com embrioes de D. rerio, Zhu et al.²⁴ demonstraram que agregados resultantes da sedimentaçao de NPs Fe₂O₃ causaram adiantamento na eclosao dos ovos quando em concentraçoes maiores que 10 mg L^-1. Foi observado também o aparecimento de malformaçoes como ulceraçoes na pele, edemas, assim como danos articulares. Em concentraçoes de 50 e 100 mg L^-1 ocorreu a morte dos peixes, fato que contribui para a compreensao do potencial tóxico das NPs liberadas no ambiente. Em outro estudo com mexilhoes expostos a NPs de óxido ferro foi verificado que a toxicidade é induzida nas concentraçoes de 10 e 50 mg mL^-1, sendo estas internalizadas nos hemócitos levando ao aumento de EROs e aumento de danos no DNA.⁴⁰

Avaliaçao da toxicidade utilizando ensaios in vitro

A avaliaçao da viabilidade celular mostrou que as linhagens V79 e HeLa foram mais sensíveis à exposiçao das nanopartículas, atingindo, respectivamente, 69 e 60% de viabilidade celular na maior concentraçao testada 1,96 x10¹¹. Como já mostrado em diversos estudos a linhagem V79 apresenta alta sensibilidade, o que provavelmente resultou em maior morte celular. Em relaçao à linhagem Hela, por se tratar de uma linhagem tumoral provavelmente nao obteve sucesso no reparo de danos que ocorreram no DNA devido à exposiçao às nanopartículas. Entretanto, as linhagens A549 e 3T3, na mesma concentraçao, apresentaram viabilidade acima de 90% (Figura 2A). O fato da linhagem A549 nao apresentar morte celular, mesmo se tratando de uma linhagem tumoral, pode ser explicada devido ao fato desta nao ter sofrido tantos danos como a linhagem HeLa, como mostrado na Figura 2B.

Figura 2. Avaliaçao da toxicidade - ensaio in vitro - em linhagens celulares: A549, V79, 3T3 e HeLa expostas às concentraçoes de 0,0 NP mL_-1, 1,96 x 10₇; 10₈e 10₉ NPs mL_-1. a) viabilidade celular por citometria de imagem; b) Danos de DNA pelo ensaio cometa. Números iguais nao apresentam significância estatística (p > 0,05) e números diferentes apresentam significância estatística (p < 0,05). Indicaçoes a(controle x tratamento); b (entre tratamentos) e c (entre linhagens)

As análises de genotoxicidade (ensaio cometa) com as linhagens celulares A549, V79, 3T3 e HeLa expostas às NPs de Fe₂O₃ por uma hora em diferentes concentraçoes mostraram que em maiores concentraçoes ocorreram os menores índices de danos no DNA, o que pode ser explicado pela provável agregaçao das NPs em altas concentraçoes (Figura 2B).

Variaçoes na resposta de linhagens celulares em relaçao à toxicidade de NPs de Fe₂O₃ sao encontradas na literatura,² sendo estes resultados explicados pela diversidade metabólica apresentada pelas diferentes linhagens. Chusei et al.⁴¹ verificaram aproximadamente 100% de viabilidade da linhagem celular A549 pelo ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil Tetrazolium) nas concentraçoes de 0-100 µg mL^-1 de NPs Fe₂O₃. Rajiv et al.¹² em estudos realizados com linfócitos humanos mostraram que estes foram sensíveis às NPs Fe₂O₃, apresentando viabilidade em torno de 50% em exposiçao a 100 µg mL^-1.

Embora os resultados mostrem a presença de danos de DNA (análise cometa) quando as células foram expostas às NPs, em análise de viabilidade celular as mesmas nao apresentaram morte celular, logo existe a sugestao de que o meio intracelular pode apresentar respostas de reparo do material genético, o que faz com que a célula seja tolerante a este tipo de NPs.^42,43 Estudos mostram que o mecanismo de açao das NP Fe₂O₃ está ligado à geraçao de espécies reativas de oxigênio (EROs) podendo resultar em processos inflamatórios nas células e consequente ruptura na membrana das mitocôndrias, danos no DNA e morte celular programada por apoptose.^2,7,42-44 Entretanto, as reaçoes causadas pelos íons de ferro gerados pela dissociaçao das NPs no citoplasma celular sao controladas por um complexo de proteínas que podem fazer o transporte ou armazenamento deste nanocomposto, justificando a tolerância celular às NPs de Fe₂O_3.^7,42,43

Análises de Genotoxicidade em Allium cepa

No ensaio Allium cepa foram observados maiores índices de alteraçoes (IA) nas maiores concentraçoes testadas (19,6 e 39 x 10⁹ NPs mL^-1) (Figura 3).

Figura 3. Resultados das análises de genotoxicidade em teste de Allium cepa por índices de alteraçoes (IA) após exposiçao a diferentes concentraçoes de NP Fe₂O₃: 0,00; 1,96; 3,9; 19,6 e 39 x 10⁹ NPs mL^-1. Números iguais nao apresentam significância estatística (p > 0,05) e números diferentes apresentam significância estatística (p < 0,05)

Saquib et al.⁴⁵ ao utilizarem modelo vegetal Raphanus sativus demonstraram que o potencial genotóxico da NPs de Fe₂O₃ está relacionado à concentraçao. Os autores relatam que as NPs agem no interior da célula, liberando íons tóxicos e ocasionando o estresse oxidativo, levando à alteraçao do funcionamento mitocondrial e danos ao DNA. Estes danos no material genético comprovam a necessidade de aprofundamento nos estudos sobre a toxicidade destas NPs.^26,45,46 Desta forma, é importante a investigaçao e diversificaçao dos estudos com plantas e o conhecimento dos mecanismos intracelulares das NPs no metabolismo celular.

Avaliaçao da toxicidade em zebrafish (Danio rerio)

Ensaio cometa em células sanguíneas e branquiais de D. rerio

Os resultados das análises de genotoxicidade em células sanguíneas e branquiais mostraram diferença significativa em concentraçoes mais elevadas quando comparadas ao controle. As células branquiais apresentaram maior sensibilidade (3,902; 19,6 x10⁹ NPs mL^-1) que as células sanguíneas quando em concentraçao 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1 (Figura 4).

Figura 4. Resultados da genotoxicidade em células sanguíneas e branquiais de D. rerio indicados por índice de relativos de danos após exposiçao a diferentes concentraçoes de NPs de óxido de ferro: 0,0 (controle); 1,96; 3,90; 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1. Números iguais nao apresentam significância estatística e números diferentes apresentam significância estatística

Esses resultados sao condizentes com a literatura, visto que em estudos realizados com peixes foram observados maiores índices de danos no DNA de células branquiais. Os autores justificam que estes órgaos podem adsorver as NPs de Fe₂O₃, pois estao em contato direto com as NPs presentes no ambiente.^21,47,48

Diversos estudos realizados em peixes demonstram o potencial genotóxico de diferentes nanocompostos e a sensibilidade do ensaio cometa, lembrando que este é considerado um pré-teste. Em estudo realizado com D. rerio expostos por 96 h a 200 mg L^-1 a NPs de vermiculite esfoliada magnética e NPs vermiculite esfoliada com tamanho médio de 150 nm, foi possível observar, pelo ensaio cometa com eritrócitos, que estes apresentaram índice de danos significativo em relaçao ao controle.⁴⁹ Em outro estudo realizado com fêmeas de Poedilia reticulata expostas a NPs γ-Fe₂O₃ com tamanho médio de 4 nm (0,3 mg/L) foi observada genotoxicidade nas exposiçoes entre 3 e 7 dias, e genotoxicidade e mutagenicidade (teste de micronúcleo) em exposiçoes por mais 14 e 21 dias.⁵⁰

Avaliaçao bioquímica dos efeitos das nanopartículas de óxido de ferro nos diferentes tecidos de D. rerio

A análise das enzimas ligadas ao mecanismo antioxidante, CAT e GPx, e ao processo de biotransformaçao de xenobióticos, GST, nos diferentes tecidos de D. rerio expostos às NPs de Fe₂O₃ nas concentraçoes de 1,96; 3,902 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1 durante 72 horas sao apresentadas na Figura 5. Os resultados das análises bioquímicas mostraram que a CAT aumentou no cérebro e no músculo, em todas as concentraçoes utilizadas, no coraçao (em 1,96 x 10⁹ NPs mL^-1) e no fígado (em 3,902 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1) quando comparadas com o controle (Figura 5A). Entretanto, a atividade da CAT foi mais elevada no fígado em relaçao aos outros órgaos. A maior atividade da CAT no fígado confirma o papel deste órgao nos processos de desintoxicaçao e que este órgao é capaz de eliminar o peróxido de hidrogênio (H₂O₂). Além da desintoxicaçao, o fígado também está envolvido no processo de filtraçao como o baço e o rim e, neste sentido, é um órgao alvo em peixes expostos a NPs.⁵¹ Ademais, a atividade aumentada da CAT demonstra também uma resposta adaptativa dos diferentes órgaos às NPs, na tentativa de neutralizar as EROs. De acordo com Hermes-Lima,⁵² maiores atividades da CAT sao observadas quando há elevaçao da peroxidaçao lipídica.

Figura 5. Atividade das enzimas catalase (CAT) (A), glutationa peroxidase (GPx) (B) e glutationa S-transferase (GST) (C) em Danio rerio expostos às nanopartículas Fe₂O₃ pelo período de 72 h, nas concentraçoes de 1,96; 3,90 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1. Números iguais nao apresentam significância estatística (p>0,05) e números diferentes apresentam significância estatística (p < 0,05)

O mecanismo de defesa antioxidante funciona de forma complexa a partir da açao de diversas enzimas no combate à produçao de EROS. As enzimas CAT e SOD sao as primeiras a agir na inativaçao de EROs,^53,54 a SOD desmuta os radicais superóxidos (O₂ ^.-) em H₂O₂ que poderao ser decompostos pela CAT e GPx. A CAT decompoe o H₂O₂ em água e oxigênio. Este sistema irá realizar a desintoxicaçao do organismo evitando os danos celulares.^42,55

A atividade da GPx (Figura 5B) diminuiu significativamente no cérebro nas concentraçoes 1,96; 3,902 x 10⁹, porém aumenta na maior concentraçao 19,6 x 10⁹, no coraçao é observado aumento da atividade de acordo com o aumento da concentraçao, na pele (em 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1) ocorreu uma queda na atividade quando esta é comparada com o controle. É possível também observar que a atividade da GPx aumentou significativamente em relaçao ao controle no coraçao (em 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1), no fígado, em todas as concentraçoes testadas, no músculo (em 3,902 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1), assim como na pele (em 1,96 e 3,902 x 10⁹ NPs mL^-1). O aumento da GPx pode indicar que esta enzima está compensando a atividade diminuída da CAT⁵⁶ e mostra também maior susceptibilidade dos peixes às NPs, evidenciando que as mudanças no ambiente podem resultar em alteraçoes bioquímicas no interior das células, o que por sua vez, modulam a atividade destas enzimas. A diminuiçao da atividade na pele na concentraçao mais alta pode indicar a agregaçao da nanopartícula no meio e por consequência nao resposta da pele.

Embora nao tenha sido avaliado o acúmulo das NPs nos tecidos, o ferro liberado das NP Fe₂O₃ pode ser tóxico quando se acumula em um nível inadequado. Como descrito por Halliwell e Gutteridge⁵³ e Jeong e Connolly⁵⁷ o ferro livre, incluindo Fe (II) e Fe (III), pode participar da reaçao de Fenton e gerar radicais hidroxílicos citotóxicos. Neste sentido, a produçao de EROs ativa os sistemas de defesa antioxidantes que protegem as células dos danos oxidativos. Por outro lado, a diminuiçao na atividade da GPx em D. rerio pode estar relacionada à produçao de O₂, à açao direta das NP Fe₂O₃ sobre a síntese desta enzima e também pode ser um sinal de toxicidade associada à produçao de EROs induzida pela presença das NPs. A GPx catalisa a reduçao do H₂O₂ e peróxidos orgânicos a seus correspondentes alcoóis às custas da conversao da GSH (glutationa reduzida) a GSSG (glutationa oxidada). Portanto, a diminuiçao da atividade da GPx pode estar relacionada também à escassez de GSH nos tecidos. Os níveis de GSH dependem, principalmente, do equilíbrio entre a taxa de síntese de GSH, a taxa de conjugaçao (por GSTs), taxa de oxidaçao (nao enzimática ou por GPx), e reduçao da GSSG para GSH (via glutationa redutase, GR).^58,59 A GSH é a molécula redox mais abundante nas células e, portanto, desempenha um papel importante na desintoxicaçao de eletrófilos e na prevençao do estresse oxidativo celular (Hermes-Lima, 2004, Latha e Pari, 2004). Outra via metabólica possível para a homeostase de metais na célula se faz por meio da quelaçao de íons metálicos, que poderá formar complexos protéicos nas mitocôndrias, diminuindo ou até mesmo inibindo o estresse oxidativo⁵⁵.

A atividade da GST aumentou significativamente no coraçao e no fígado nas concentraçoes de 3,902 x 10⁹ NPs mL^-1 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1, quando comparados com seus respectivos controles. Entretanto, quando comparada com os órgaos estudados, a atividade da GST foi menor no coraçao e cérebro. Por outro lado, a atividade da GST no cérebro, músculo e pele, em todas as concentraçoes estudadas, apresentou semelhança à apresentada pelos controles (Figura 5B). O aumento da atividade da GST indica que o organismo está passando por um processo de desintoxicaçao.⁵⁹ A GST juntamente com a GPx tem a funçao de reduzir os peróxidos evitando danos no DNA.⁶⁰

Estudos realizados com NP Fe₂O₃ em peixes demonstram que em adultos a defesa antioxidante e a eliminaçao das NPs sao mais eficientes do que em embrioes.²¹ Contudo, em medaka adultos, Oryzias latipes, expostos por 14 dias a 50 µg/mL de NP Fe₂O₃(30 nm) houve induçao do estresse oxidativo no fígado e cérebro, no início da exposiçao, sendo o equilíbrio fisiológico restaurado com o tempo.²⁵ O mesmo comportamento foi observado em D. rerio expostos a 4 e 10 mg L^-1 de NP Fe₂O₃ (140-160nm) por 28 dias, com sangramento e mudança na cor da pele, acúmulo de NPs nos animais nos primeiros dias de exposiçao por adsorçao e ingestao e eliminaçao das NPs após 24 dias.²¹ Zhang et al.²¹ sugeriram em seu estudo que houve retençao de uma parte destas NPs no sistema gastrointestinal e nas brânquias, e que os íons de ferro induziram o estresse oxidativo nos primeiros dias de exposiçao.

Em nosso estudo as alteraçoes nas atividades enzimáticas indicam a mudança do funcionamento dos órgaos e induçao de estresse oxidativo pelas NPs de Fe₂O₃. Ademais, cada órgao respondeu de maneira distinta às diferentes concentraçoes de NPs devido às suas capacidades metabólicas. Esta variaçao de resposta nos diferentes tecidos também foi observada em tilápias, Oreochromis niloticus, expostas as NPs de óxido de ferro, onde foi verificado acúmulo, distribuiçao fisiológica e eliminaçao das NPs.⁵¹

CONCLUSAO

As NPs Fe₂O₃ tiveram suas características físico-químicas alteradas dependendo do meio dispersante; o potencial genotóxico foi dose dependente nos estudos in vitro e nos estudos in vivo os resultados mostraram que estas apresentaram genotoxicidade também em células branquiais e sanguíneas de Danio rerio. Em relaçao as análises bioquimicas foram observadas alteraçao nas atividades das enzimas CAT, GPx e GST nos tecidos de Danio rerio e estas podem ser utilizadas como biomarcadores de estresse oxidativo e para monitoramento ambiental. Análises de toxicidade de nanomateriais devem ser melhor investigadas, pois mesmo em baixas concentraçoes, em caso de nanopartículas metálicas, a exposiçao pode ser por períodos longos de tempo, fator que pode resultar em efeitos semelhantes aos de exposiçao a concentraçoes elevadas por um curto período de tempo. Desta forma é necessário ter cautela no uso das NPs de Fe₂O₃, principalmente devido à possibilidade da modificaçao de suas propriedades físico-químicas dependente do meio em que estao dispersas, fato que pode influenciar sua toxicidade em diferentes ambientes

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