JBCS

INTRODUÇAO

Os materiais de referência certificados (MRCs) sao ferramentas importantes para o sistema de qualidade de um laboratório na garantia da confiabilidade de resultados e da exatidao de mediçoes químicas. Possuem uma declaraçao de sua incerteza associada e a rastreabilidade metrológica demonstrável a padroes nacionais ou internacionais.¹ A produçao de um MRC envolve muitas etapas, pois ele deve ser planejado, desenvolvido, ter a homogeneidade e a estabilidade avaliadas, além de seu valor de propriedade determinado na etapa de caracterizaçao e ter sua incerteza estabelecida. Dentre as diversas áreas que utilizam MRCs, destaca-se a área de óptica com a espectrofotometria no UV-Vis. Essa técnica é muito utilizada e o espectrofotômetro é um equipamento fundamental para a análise de diversos materiais. Por meio da espectrofotometria, compostos químicos podem ser identificados e quantificados por seus espectros característicos na faixa do ultravioleta (UV) ao visível (Vis). Como as absorbâncias associadas a diversos analitos podem ser alteradas em intervalos pequenos de comprimentos de onda, e a precisao e exatidao das medidas devem ser maximizadas, a calibraçao do espectrofotômetro é essencial. Para isto, sao utilizados MRCs específicos para calibrar a escala de comprimentos de onda do equipamento como, por exemplo, a soluçao de óxido de hólmio(III), Ho₂O₃.²

Apesar de nao haver produçao de MRCs no Brasil para a escala de comprimentos de onda, existem outros MRCs que podem ser utilizados na calibraçao e checagem da escala de comprimentos de onda de espectrofotômetros UV-Vis, como o filtro sólido de hólmio e de didímio.³ Atualmente, o MRC de Ho₂O₃ em soluçao é o material mais utilizado, já que ele pode ser utilizado na faixa do UV-Vis e seus picos de absorbância sao intrínsecos e bem resolvidos, ao contrário do filtro sólido de didímio.³ O MRC de Ho₂O₃ em soluçao provê linhas mais nítidas e menos dependentes de matriz do que o filtro sólido de hólmio.⁴ Ainda, algumas normas e farmacopeias exigem o uso da soluçao de Ho₂O₃ para a verificaçao da escala de comprimento de onda.^5,6

Este trabalho tem como objetivo apresentar os resultados da produçao do MRC de soluçao de Ho₂O₃ em ampolas de vidro, primordial para garantir a rastreabilidade e confiabilidade dos resultados das mediçoes espectrofotométricas.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais

Para a produçao e estudo do candidato a MRC, foram empregados o óxido de hólmio (Ho₂O₃) com pureza de 99,99% (Alfa Aesar, EUA), o ácido perclórico (HClO₄) P.A. (Merck, Alemanha) e a água desionizada, com condutividade menor ou igual a 1,00 µS cm^-1, obtida com purificador de água (Elga, Inglaterra). O Ho₂O₃ de pureza 99,99% foi escolhido, pois estudos preliminares⁷ indicaram que nao houve diferenças espectrais entre Ho₂O₃ de pureza 99,99% e 99,999% na regiao espectral estudada. Foram utilizados uma balança analítica digital com resoluçao de 0,1 mg (Mettler Toledo, EUA), banho termostático (Lauda, Alemanha), máquina de selagem de ampola (Rota Verpackungstechnik, Alemanha), espectrofotômetro digital UV-Vis, modelo PV-667-0 (Agilent, EUA), espectrofotômetro digital UV-Vis-NIR, modelo PR-092 (Perkin Elmer, EUA) e MRC de Ho₂O₃ - SRM-2034 (NIST, EUA).

Etapas da certificaçao do MRC de Ho₂O₃

As etapas de processamento do material, avaliaçao da homogeneidade, avaliaçao da estabilidade, caracterizaçao, avaliaçao da incerteza e atribuiçao dos valores de propriedade e suas incertezas sao discutidas a seguir.

Preparo da soluçao de Ho₂O₃

O procedimento de produçao da soluçao de Ho₂O₃ foi o adotado pelo NIST, conforme Weidner et al.^7,8 A concentraçao de soluçao de Ho₂O₃ preparada foi de 4,0% (m/m) em 10% (m/m) HClO₄. Inicialmente, Ho₂O₃ foi pesado em balança analítica digital diretamente em um Erlenmeyer. Aproximadamente 1/10 da água desionizada a ser utilizada foi adicionada ao Erlenmeyer contendo o Ho₂O₃. A quantidade total de HClO₄ foi pesada em um recipiente de vidro e adicionada ao Erlenmeyer. A mistura foi colocada em banho termostático à temperatura de 80 °C, durante 1 h. Após a obtençao de uma soluçao homogênea e transparente, o Erlenmeyer foi retirado do aquecimento e deixado resfriar à temperatura ambiente.

A soluçao de Ho₂O₃ foi transferida quantitativamente para um balao de vidro, e água desionizada foi adicionada até a indicaçao da massa total de soluçao desejada. A soluçao foi homogeneizada e mantida a (20 ± 5) °C até o envase do material.

A soluçao de Ho₂O₃ preparada foi envasada em ampolas de vidro transparente de 5,0 mL. A primeira etapa do envase foi a abertura das ampolas com ajuda de uma chama da máquina de selagem. O enchimento das ampolas com a soluçao de Ho₂O₃ foi realizado utilizando um repipetador automático. Antes de fechá-las, a máquina de selagem injetou argônio na ampola, para evitar reaçoes com o oxigênio do ar. A seguir, as ampolas com a soluçao foram colocadas no carrossel da máquina de selagem para fechamento da sua parte superior. As ampolas foram identificadas com numeraçao de acordo com a ordem de envase, totalizando 60 unidades e armazenadas a (25 ± 5) °C.

Estudos de certificaçao do material de referência de Ho₂O₃

Para a certificaçao do lote de soluçao de Ho₂O₃ produzida, a espectrofotometria no UV-Vis foi utilizada na avaliaçao da homogeneidade e da estabilidade e na caracterizaçao, sendo analisados os 14 picos de máxima absorbância da soluçao de Ho₂O₃. Os parâmetros de mediçao utilizados foram: modo: Scan, faixa espectral: 235 nm a 645 nm, largura de banda espectral: 1,00 nm e velocidade de varredura: 30,0 nm min^-1. Para cada ampola analisada, foram realizados 2 ciclos de mediçao, 3 repetiçoes para cada ciclo, num total de 6 mediçoes.

Avaliaçao da homogeneidade

Para a avaliaçao da homogeneidade, utilizou-se o espectrofotômetro PV-667-0. Todas as ampolas foram medidas no mesmo dia para garantir melhor repetibilidade.

A ferramenta estatística de regressao linear foi empregada para verificar se houve tendência na seleçao das unidades.⁹ O teste estatístico ANOVA foi utilizado para avaliar a homogeneidade do lote produzido, levando em conta a variabilidade dos resultados obtidos tanto entre as ampolas quanto dentro das ampolas.¹⁰ Com a tabela ANOVA, foram obtidos os valores de MQ (média quadrática) entre e dentro das unidades, gl (graus de liberdade) entre e dentro das unidades, F_calculado e p-valor, necessários para avaliar a homogeneidade e calcular a incerteza referente a esse estudo.

Avaliaçao da estabilidade

Após a comprovaçao da homogeneidade do lote de soluçoes de Ho₂O₃, foi realizada a avaliaçao da estabilidade do lote, a curto e a longo prazos, utilizando o espectrofotômetro PV-667-0. Para análise dos dados, a ferramenta estatística de regressao linear⁹ foi empregada para verificar a tendência dos resultados de comprimento de onda com o passar do tempo.

A estabilidade a curto prazo é associada a qualquer efeito devido ao transporte do material, na qual simula-se condiçoes às quais o material possa vir a ser exposto durante o transporte. Os estudos de estabilidade a curto prazo foram realizados de modo isócrono (garantindo melhor repetibilidade), com duraçao de 35 dias (5 semanas), nas temperaturas 50 °C, 25 °C e 4 °C.

A estabilidade a longo prazo é associada a qualquer efeito devido ao armazenamento do material, na qual simula-se condiçoes de prateleira. Os estudos de estabilidade a longo prazo foram realizados pelo modo clássico (garantindo uma precisao intermediária), com duraçao de 9 meses consecutivos.

Caracterizaçao

Após a avaliaçao da estabilidade a curto prazo, foi realizada a caracterizaçao do candidato a MRC produzido. Os resultados foram obtidos através da caracterizaçao do mensurando utilizando 2 métodos independentes em 2 laboratórios,¹⁰ através do ensaio realizado pelo Laboratório de Radiometria e Fotometria (Laraf) do Inmetro (com utilizaçao do espectrofotômetro PR-092), como também por medidas realizadas pelo Laboratório de Optica da Visomes (com utilizaçao do espectrofotômetro PV-667-0).

Os métodos utilizados para se determinar os comprimentos de onda do Ho₂O₃ foram independentes, e com a declaraçao da incerteza-padrao associada pelos 2 laboratórios. A compatibilidade dos resultados dos laboratórios foi verificada através de análise pelo índice zeta.¹¹ Após os resultados serem comprovadamente compatíveis, os valores de propriedade do comprimento de onda dos picos de máxima absorbância da soluçao de Ho₂O₃ produzida foram atribuídos por meio de média ponderada,¹² considerando os valores obtidos pelos laboratórios e suas incertezas padrao associadas à etapa de caracterizaçao.

Avaliaçao da incerteza

Para avaliar a incerteza expandida (U_MRC) da soluçao de Ho₂O₃ produzida, levaram-se em consideraçao os resultados obtidos em cada um dos estudos de certificaçao do material: homogeneidade, estabilidade e caracterizaçao. As incertezas padrao referentes à homogeneidade (u_hom), à estabilidade a curto prazo (u_ec) e à estabilidade a longo prazo (u_el) foram calculadas conforme ISO Guide 35,¹³ e aquela referente à caracterizaçao (u_car) foi calculada por ponderaçao das incertezas obtidas de cada laboratório. Levando em consideraçao as fontes citadas, a incerteza expandida do MRC produzido foi calculada conforme Equaçao (1).

em que U_MRC é a incerteza expandida do MRC e k é o fator de abrangência (de valor igual a 2,00 para 95% de probabilidade de abrangência).

 

RESULTADOS E DISCUSSAO

O espectro de absorbância da soluçao de Ho₂O₃ preparada (Figura 1) inclui os 14 picos de máxima absorbância utilizados para calibraçao de espectrofotômetros na faixa espectral de 240 nm a 640 nm identificados por números.

 

 

Homogeneidade do candidato a MRC

Com as 10 ampolas selecionadas para a avaliaçao da homogeneidade, verificou-se que nao houve tendência na seleçao das unidades utilizando a regressao linear. A análise da homogeneidade dentro e entre as unidades se baseou na ANOVA, obtendo-se os valores de F_calculado e p-valor. Para α = 0,05, gl_entre = 9 e gl_dentro = 50, o F_crítico é de 2,12. Para que o lote seja considerado homogêneo, o F_crítico deve ser maior que F_calculado, e o p-valor deve ser maior que 0,05 (probabilidade de 95% de abrangência). Os dados de F_calculado e p-valor para os 14 picos da soluçao de Ho₂O₃ produzida encontram-se na Tabela 1.

 

 

Como F_crítico > F_calculado e p-valor > 0,05 para os 14 picos analisados, o lote da soluçao de Ho₂O₃ foi considerado homogêneo.

Estabilidade a curto prazo do candidato a MRC

Para o estudo de estabilidade a curto prazo, inicialmente, os resultados foram analisados pela técnica estatística de regressao linear, na qual obteve-se o valor do coeficiente angular (β₁) e do erro padrao (sβ₁). Para indicar estabilidade, o valor de β₁(em módulo) deve ser menor que o produto entre o sβ₁ e o valor de t_st(t-student, considerando aproximadamente 95% de confiança).

Na Tabela 2, sao apresentados os valores de |β₁| e sβ₁ t_st. Verifica-se que, para 8 picos de máxima absorbância da soluçao de Ho₂O₃(assinalados com a letra a na Tabela 2), a condiçao |β₁| < sβ₁ t_st nao foi atendida.

 

 

Com isso, foi necessário verificar se a tendência apresentada nesse estudo foi tecnicamente significativa, utilizando a Equaçao (2). Estipulou-se que a diferença entre Y_estimado e Y₀ deveria ficar menor que 30% da incerteza alvo de 0,15 nm para que a tendência encontrada no estudo nao fosse considerada significativa.

em que Y_estimado equivale ao comprimento de onda obtido pela regressao linear estimando um tempo de 5 semanas (duraçao do estudo) e Y₀ é valor médio de comprimento de onda obtido nas leituras da primeira ampola. As diferenças relativas obtidas resultaram em valores menores que 30%, indicando que a inclinaçao da reta nao gerou instabilidade suficiente para que o valor de comprimento de onda saísse da faixa de incerteza da soluçao. Ou seja, para um prazo de 35 dias esses picos foram considerados estáveis. Por meio desse estudo, as temperaturas máxima e mínima de transporte do material puderam ser definidas como 50 °C e 4 °C, respectivamente, sendo que o material pode ficar exposto às temperaturas limites por até 5 semanas, o tempo total de estudo.

Estabilidade a longo prazo do candidato a MRC

A avaliaçao da estabilidade a longo prazo foi realizada durante 9 meses consecutivos. Os dados passaram por regressao linear, na qual obtiveram-se os valores de β₁ e sβ₁. Para indicar estabilidade, o β₁(em módulo) deve ser menor que o produto sβ₁ t_st. Na Tabela 3, encontram-se os valores de |β₁| e sβ₁ t_st.

 

 

Para o estudo de estabilidade a longo prazo, verifica-se que, para todos os 14 picos de máxima absorbância do Ho₂O₃ analisados, |β₁| ficou menor que sβ₁ t_st, indicando que nao houve tendência e demonstrando estabilidade por 9 meses, se mantido e armazenado à temperatura de 25 °C.

Verificou-se que o estudo de estabilidade a curto prazo foi mais crítico que a estabilidade a longo prazo, apresentando uma tendência nos resultados devido às diferenças de temperatura extremas.

Caracterizaçao do candidato a MRC

Nesta etapa, foram distribuídas 3 ampolas do lote contendo a soluçao produzida para cada laboratório, portanto, 6 ampolas foram analisadas para obtençao do valor da caracterizaçao.

Os resultados de caracterizaçao dos 2 laboratórios foram analisados quanto à compatibilidade através do índice zeta, no qual, para todos os picos, ficou confirmado que todos ficaram compatíveis. Dessa forma, os resultados dos laboratórios foram combinados por média ponderada,⁹ cujos valores constam na Tabela 4.

 

 

Estimativa da incerteza do MRC de Ho₂O₃

As incertezas padrao de cada estudo foram calculadas conforme ISO Guide 35.¹³ Para o estudo de estabilidade a longo prazo, a incerteza foi extrapolada em mais 3 meses, resultando num total de 12 meses. Dessa forma, o prazo de validade da soluçao de Ho₂O₃ foi estimado para 1 ano após a produçao.

Os valores de cada incerteza padrao referentes aos estudos de certificaçao e a incerteza expandida do MRC estao apresentados na Tabela 5.

 

 

Atribuiçao do valor de propriedade

O valor de propriedade da soluçao de Ho₂O₃ produzida foi apresentado para cada um dos 14 picos de máxima absorbância, nos comprimentos de onda certificados, sendo a média ponderada dos valores obtidos pelos 2 laboratórios. A incerteza da soluçao a ser considerada foi estabelecida como a maior incerteza encontrada dentre os 14 picos certificados: apenas um valor de incerteza expandida foi apresentado para os 14 picos. Os valores de propriedade dos 14 picos de máxima absorbância da soluçao de Ho₂O₃ produzida sao apresentados na Tabela 6.

 

 

CONCLUSAO

Uma metodologia para preparo e envase em ampolas de vidro do material foi desenvolvida, e realizada a avaliaçao da homogeneidade e da estabilidade a curto e longo prazo, na qual a soluçao de Ho₂O₃ produzida demonstrou-se homogênea e estável por 9 meses. Com a avaliaçao da estabilidade a curto e a longo prazos foi demonstrado que o material se manteve estável durante o transporte por até 5 semanas em temperaturas elevadas, atingindo 50 °C e temperaturas mais baixas de até 4 °C, além de poder ser armazenado à temperatura ambiente por até um ano. O material produzido foi caracterizado por meio de mediçoes utilizando métodos independentes realizados em 2 laboratórios, de acordo com a Norma ABNT NBR ISO 17034, sendo obtidos os valores de propriedade dos 14 picos de máxima absorbância da soluçao de Ho₂O₃. A partir da combinaçao das incertezas padrao referentes à homogeneidade, estabilidade e da caracterizaçao, a incerteza expandida do MRC foi estimada em 0,12 nm, para um fator de abrangência (k) igual a 2,00, em uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%.

 

AGRADECIMENTOS

APDA e TOA agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq.

 

REFERENCIAS

1. Augusto, C. R.; Monteiro, T. M.; Rodrigues, J. M.; Cunha, V. S.; Congresso Interno do Inmetro, Rio de Janeiro, Brasil, 2010.

2. Gonçalves, D. E. F.; Dissertaçao de Mestrado, Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, Brasil, 2018.

3. Travis, J. C.; Acosta, J. C.; Andor, G.; Bastie, J.; Blattner, P.; Chunnilall, C. J.; Crosson, S. C.; Duewer, D. L.; Early, E. A.; Hengstberger, F.; Kim, C. S.; Liedquist, L.; Manoocheri, F.; Mercader, F.; Monard, L. A. G.; Nevas, S.; Mito, A.; Nilsson, M.; Noël, M.; Rodriguez, A. C.; Ruíz, A.; Schirmacher, A.; Smith, M. V.; Valencia, G.; van Tonder, N.; Zwinkels, J.; J. Phys. Chem. Ref. Data 2005, 34, 41.

4. International Accreditation New Zealand; Technical Guide, Nova Zelândia, 2005.

5. European Pharmacopoeia; Ph.Eur., 9^th ed., França, 2017.

6. The United States Pharmacopoeia; National Formulary 35, 40, EUA, 2017.

7. Weidner, V. R.; Mavrodineanu, R.; Mielenz, K. D.; Velapoldi, R. A.; Eckerle, K. L.; Adams, B.; NBS Special Publications 1986, 260-102, 69.

8. Weidner, V. R.; Mavrodineanu, R.; Mielenz, K. D.; Velapoldi, R. A.; Eckerle, K. L.; Adams, B.; J. Res. Natl. Bur. Stand. 1985, 90, 115.

9. Miller, J. N.; Miller, J. C.; Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5^a ed., Person: Inglaterra, 2005.

10. ABNT NBR ISO 17034; Requisitos gerais para a competência de produtores de material de referência, 1ª ed., Rio de Janeiro, 2017.

11. ISO 13528; Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparison, 2^a ed., França, 2015.

12. Cox M. G.; Advanced Mathematical and Computational Tools in Metrology IV 2000, 53, 45.

13. ISO Guide 35; Reference materials - Guidance for characterization and assessment of homogeneity and stability; 4^a ed., França, 2017.