JBCS

INTRODUÇAO

Os produtos naturais realizam papel fundamental na descoberta de fármacos e na compreensao dos principais mecanismos de açao de uma molécula ativa, sendo o principal interesse nessas estruturas relacionado à ampla participaçao clínica que apresentam.^1,2 No último levantamento realizado por Newmann & Cragg,³ entre os anos de 1981 e 2014, foi observado que entre as 1211 micromoléculas aprovadas como fármacos pelo FDA (Food and Drug Administration), cerca de 65% possuem uma profunda correlaçao com as estruturas encontradas nos produtos naturais ou sao derivados diretos de alguma fonte biológica.

Nesse sentido, a habilidade de estender a química da natureza possibilita a alteraçao de grupos funcionais, a estereoquímica e os esqueletos naturais por aproximaçoes sintéticas e também pela manipulaçao genética de enzimas participantes da biossíntese, oferecendo múltiplas oportunidades para obtençao de análogos estruturais⁴ e, com isso, aprimorar a efetividade de um fármaco.

Entre os metabólitos com maior taxa de efetividade, aqueles oriundos das sintases de policetídeos (PKS) destacam-se por possuírem diversas aplicaçoes, atuando como redutores dos níveis de colesterol (lovastatina 1),⁵ antibióticos (eritromicina 2),⁶ antifúngicos (anfotericina 3),⁷ anti-tuberculose (avermectina 4),⁸ antineoplásicos (doxorubicina 5, salinomicina 6)^9,10 - (Figura 1). Uma característica interessante desse grupo heterogêneo de estruturas, que compreende poliéteres, polienos, polifénois, macrolídeos e enediinos, é que todos sao derivados de um dos blocos mais simples da natureza, o acetato.

Figura 1. Estruturas representativas de policetídeos com atividade biológica

Apesar do continuo esforço para a prospecçao de novos policetídeos, o re-isolamento de substâncias já conhecidas associado à baixa produçao desses alvos e o alto custo envolvido na triagem metabólica representaram fatores desestimulantes para a indústria farmacêutica.¹¹ Com o advento das técnicas de biologia molecular e da rapidez e barateamento do sequenciamento de genomas completos, a engenharia genética, aliada à biotecnologia e à síntese química, inspirou-se nas grandes bibliotecas produzidas pela química combinatória para desenvolver um conjunto de técnicas de manipulaçoes do maquinário biossintético de um organismo com o intuito de promover alteraçoes estruturais nos compostos biossintetizados naturalmente. Nesse sentido, o termo "biossíntese combinatória" remete ao potencial de rearranjar e modificar genes para a produçao de bibliotecas de produtos naturais, fundamentais para traçar o limiar entre estrutura e atividade biológica existente na concepçao de um fármaco.

Os pioneiros nessa área foram Hopwood e colaboradores¹² que em 1985, produziram modificaçoes na via de biossíntese da actinohordina (7) através da inserçao do correspondente agrupamento (cluster) biossintético em diversas espécies de Streptomyces. As alteraçoes resultaram na biossíntese dos análogos granaticina (8) e medermicina (9). Modificaçoes na linhagem nativa, através da inserçao de genes, permitiram a caracterizaçao da mederhordina A (10), di-hidrogranaticina (11) e di-hidrogranatirhodina (12), evidenciando a possibilidade de realizar modificaçoes na natureza química dos metabólitos através da manipulaçao de vias análogas (Figura 2).

Figura 2. Estruturas química dos antibióticos isocromaquinolínicos

A partir desse trabalho pioneiro, novas exploraçoes a respeito da natureza genética dos produtos naturais foram revisadas, impulsionando a biossíntese combinatória de policetídeos como uma área de pesquisa especialmente interessada em metodologias de recombinaçao homóloga para promover diversidade enzimática (e consequentemente diversidade estrutural) fazendo uso de organismos heterólogos mais sofisticados para ampliar o conhecimento sobre as PKSs. Adicionalmente, o desenvolvimento das plataformas de armazenamento, disponibilizaçao e elucidaçao funcional das sequências de genes dos clusters biossintéticos contribuiu para a evoluçao dessa área. Portanto, compreender a química envolvida nas vias de biossíntese e a biologia dos organismos produtores é de crucial importância para a obtençao de modificaçoes estruturais a partir da informaçao genética.

BIOSSINTESE DE POLICETIDEOS

Os policetídeos sao uma classe de produtos naturais biossintetizados por grandes blocos enzimáticos multimodulares, denominados sintases de policetídeos (PKS). Essas megassintases (~900 kDa) apresentam muitas características em comum com a biossíntese de ácidos graxos,¹³ nao somente no que diz respeito aos mecanismos envolvidos na condensaçao dos substratos, mas também em relaçao aos precursores empregados para construçao das cadeias, usualmente sao utilizados unidades de metilmalonil-CoA, propanoil-CoA e acetil-CoA. A principal diferença, no entanto, é que normalmente a biossíntese de ácidos graxos resulta no produto completamente reduzido a cada ciclo de extensao, já durante a biossíntese dos policetídeos, a reduçao é variável.¹⁴

As PKSs estao presentes em bactérias, fungos e plantas¹⁵ e divididas em três tipos, classificadas de acordo com sua estrutura e funcionalidade. PKSs do tipo I, normalmente encontradas em bactérias e fungos, sao amplamente estudadas e apresentam o maquinário biossintético dividido em módulos, os quais se subdividem em vários domínios. Podem atuar de modo iterativo (domínios se repetem durante a biossíntese) ou nao iterativo (canônico), onde cada ciclo de extensao da cadeia policetídica é realizado por um módulo específico e os domínios nao se repetem (Figura 3). As PKSs do tipo II, se apresentam como um complexo de proteínas dissociável e possuem um único conjunto de domínios com atividade iterativa, sendo essas muito comuns para a formaçao de compostos aromáticos em bactérias, como a doxorubicina (5). Por último, as PKSs do tipo III possuem estrutura homodimérica, açao interativa e nao sao dependentes de ACP para carregar a cadeia extensora. Estao presentes principalmente em plantas, atuando na biossíntese de flavonoides e chalconas, como a narigenina (7). Algumas bactérias e fungos também possuem essas organizaçoes do tipo III atuando na produçao de policetídeos como a flaviolina^16,17 (Figura 3).

Figura 3. Classificaçao das sintases de policetídeos com relaçao a sua estrutura (tipo I, tipo II e tipo III), do modo de condensaçao dos substratos (iterativo ou canônico) e com relaçao a colinearidade dos domínios AT (trans-AT ou cis-AT)

Um módulo usual de PKS do tipo I deve conter no mínimo 3 domínios essenciais: domínio de cetoacila sintase (KS), responsável por catalisar a formaçao de uma ligaçao C-C através de uma condensaçao descarboxilativa, um domínio de acetiltranferase (AT), responsável por recrutar uma unidade extensora e uma proteína carreadora de acila (ACP), que participa como um carregador da cadeia policetídica em formaçao. Essa classe possui também variaçoes nos domínios AT sendo trans-AT¹⁸ quando nao estao posicionados subsequente (alinhados) aos demais domínios ou cis-AT, quando alinhados. Ao final de todos os módulos, o domínio de tioesterase (TE) é responsável pela transesterificaçao do policetídeo retirando-o do complexo enzimático. Essa clivagem pode ser intramolecular, levando a formaçao de macrolactonas, ou por hidrólise, levando a formaçao de um grupo ácido carboxílico.

Outros domínios modificadores sao facultativos, tais como a cetorredutase (KR), responsável pela reduçao da carbonila ao álcool, a desidratase (DH), que elimina água levando a formaçao da olefina e a enoila redutase (ER), que converte a olefina na cadeia saturada.¹⁵ A via biossintética da eritromicina em Saccharopolyspora erythraea, completamente elucidada pelos grupos dos professores Leadlay¹⁹ e Katz²⁰ na década de 90, compreende um dos exemplos mais didáticos para o estudo dos mecanismos das PKSs do tipo I (Figura 4).

Figura 4. Modelo de biossíntese proposto para a eritromicina em Saccharopolyspora erythraea^19,20

Inicialmente, devemos notar que apenas 3 genes completos sao responsáveis pela formaçao do núcleo aglicona (6-deoxieritronolídeo B), esses genes foram intitulados eryA-I, eryA-II e eryA-III e codificam as proteínas (DEBSI, DEBSII e DEBSIII) que atuam de forma linear na biossíntese da eritromicina. A primeira unidade inserida no módulo iniciador é o propanoil-CoA e cada unidade AT subsequente é responsável pela incorporaçao de um substrato, que nesse caso em específico é uma unidade de metilmalonil-CoA. Os modificadores mais comuns encontrados sao as cetorredutases (KR), que promovem de forma estereosseletiva a reduçao do grupo carbonila ao álcool correspondente e o módulo 4 apresenta o maior número de domínios modificadores, levando a reduçao completa do grupo carbonílico. No último módulo, o domínio TE é responsável pela transesterificaçao intramolecular e formaçao do núcleo macrolactônico.

PRIMEIRAS EXPERIENCIAS UTILIZANDO A BIOSSINTESE COMBINATORIA EM POLICETIDEOS

Inicialmente, a biossíntese combinatória foi realizada em policetídeos microbianos visando estudar principalmente PKSs bem estabelecidas e que se utilizavam de substratos simples da via metabólica do acetato, como malonatos, propanoatos e derivados. O que realmente incitou os pesquisadores foi a linearidade (módulos e domínios) presente na "montagem" das PKSs do tipo I. Essa característica modular propiciou uma série de pesquisas envolvendo a manipulaçao genética desses módulos na tentativa de promover alteraçoes estruturais nos esqueletos dos policetídeos.

A primeira demonstraçao da viabilidade de engenharia genética para a produçao de macrolídeos estruturalmente modificados foi apresentada pelo grupo do Katz,²⁰ que inibiu o domínio de KR, presente no módulo 5, por alteraçao da sequência primária, levando ao produto 5-ceto (14) em vez do original 5-hidróxi. Esse novo produto nao apresentou atividade antibiótica, mas experimentalmente forneceu a primeira evidência de que novos produtos naturais policetídicos poderiam ser produzidos por engenharia genética (Figura 5A).

Figura 5. Diversidade estrutural obtida por biossíntese combinatória para a produçao de análogos da eritromicina: A) Modificaçao no domínio de cetorredutase do quinto módulo levou a produçao do macrolídeo ceto; B) Reposicionamento da TE no final do segundo módulo levou a produçao da lactona tricetídica prevista; C) Substituiçao de um domínio AT específico para malonato oriundo da biossíntese da rapamicina levou a produçao de uma lactona tricetídica com uma metila a menos como previsto

O próximo desafio, a partir de entao, surgiu da motivaçao de provar que seria possível reposicionar domínios TE para a produçao de policetídeos de cadeias menores.^21,22 Isso envolveu a adiçao de uma cópia do domínio TE (DEBSIII) ao final da sequência de DEBSI. O mutante resultante (DEBSI-TE) foi capaz de produzir uma lactona tricetídica (15) em vez do macrolídeo original de 14-membros (Figura 5B).

Outras estratégias para modificar os domínios funcionais das PKSs foram propostas na tentativa de alterar os substratos inseridos no esqueleto principal dos policetídeos, a partir da transferência de um domínio AT de outra PKS para formar uma sintase quimérica. O encorajamento surgiu do fato que as PKSs do tipo I possuem estruturas próximas umas das outras e seguem os mesmos princípios de operaçao. O primeiro exemplo de produçao de uma PKS quimérica envolveu a substituiçao de um domínio de AT (específico para malonato) oriundo da PKS responsável pela biossíntese de rapamicina na DEBSI-TE.²³ O mutante resultante foi capaz de produzir a lactona tricetídica (16) com um substituinte metila a menos na posiçao prevista (Figura 5C).

Nesse contexto, centenas de produtos "nao-naturais" foram projetados, principalmente àqueles provenientes das PKSs do tipo I. Os trabalhos em biossíntese combinatória apoiaram-se na manipulaçao do substrato inserido nas "linhas de montagem", utilizando as mais variadas técnicas de biologia molecular, incluindo a fusao de genes, inativaçao de genes, substituiçao genética, alteraçao dos domínios enzimáticos e troca de módulos de forma a produzir diversidade estrutural²⁴ e até mesmo demonstrar aspectos evolutivos das PKSs do tipo I. Sugimoto e colaboradores²⁵ exploraram a engenharia da biossíntese da luteroreticulina (17). Nesse exemplo, o grupo partiu de uma PKS análoga responsável pela biossíntese da aurethina (18) e por deleçoes e inserçoes gênicas nos módulos previstos foi possível modificar a produçao de aurethina para luteoreticulina, além da obtençao de análogos em organismos heterólogos (Figura 6).

Figura 6. Biossíntese de aurethina e análogos por manipulaçao dos domínios enzimáticos²⁵

EXPANDINDO A DIVERSIDADE ENZIMATICA PARA A PRODUÇAO DE POLICETIDEOS

Até o início dos anos 2000, o maior obstáculo para a área de biossíntese combinatória era a baixa disponibilidade de sequências de DNA, menos de 20 clusters de genes de PKSs haviam sido devidamente sequenciados até a virada do milênio.²⁶ Dessa forma, o conhecimento da diversidade biossintética além de caro era muito escasso e dispendioso, levando a evoluçoes lentas. No entanto, o avanço das técnicas de sequenciamento de DNA permitiu que a área de biossíntese combinatória alcançasse um conhecimento inesperado com relaçao ao conteúdo biossintético presente nos organismos.

A actinobactéria Streptomyces coelicolor foi a primeira a ser sequenciada,²⁷ sendo identificado uma quantidade maior de clusters biossintéticos presentes no genoma desse microrganismo em comparaçao aos metabólitos que eram observados em condiçoes de cultivo. Até o sequenciamento, apenas quatro metabólitos eram conhecidos, sendo três antibióticos e um pigmento. Porém, a informaçao codificada no genoma sequenciado apresentou mais de 20 clusters que direcionavam para os mais diversos tipos de entidades relacionadas ao metabolismo secundário.^28,29 Essa informaçao apresentada pelo genoma de S. coelicolor revelou um potencial para a presença de genes biossintéticos que estavam codificados no genoma, porém nao eram completamente acessados sob as condiçoes de cultivo, ou se apresentavam silenciados.²⁹

A evoluçao dos métodos de sequenciamento completo de genomas resultou na descoberta exponencial de clusters de genes crípticos ou órfaos, ou seja, grupos de genes que nao possuem entidade identificada ou associada. O número de agrupamentos de genes sequenciados e anotados tem propiciado um crescimento no repertório de módulos e domínios enzimáticos, bem como na descoberta de diferentes arquiteturas de PKSs, como as que apresentam domínios trans-AT.³⁰

Com o objetivo de ampliar o conhecimento por rotas biossintéticas responsáveis pela produçao de produtos naturais desconhecidos, inúmeras plataformas de depósito e pareamento de genes,³¹ tais como o antiSMASH³² (antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell (bactérias, fungos e plantas)), SMURF (Secondary Metabolite Unique Regions Finder (fungos)),³³ MIBiG (Minimal Information about Biosynthetic Gene Cluster) e PRISM3 (Prediction Informatics for Secondary Metabolomes),³⁴ se desenvolveram de maneira a viabilizar ferramentas de retrobiossíntese³⁵ (Figura 7A). Nessas plataformas, os dados de um sequenciamento total de genoma sao comparados com dados depositados anteriormente e sao apresentados hits para os prováveis clusters responsáveis pelo metabolismo secundário. A medida que um cluster é associado a um metabólito, a base de dados renova e armazena essa informaçao. Dessa maneira, é possível conectar os genes às funçoes biossintéticas e aos metabólitos codificados, permitindo, por exemplo, estudar a diversidade estrutural entre os organismos nas mais diferentes regioes do globo, além de auxiliar no desenvolvimento da engenharia genética, uma vez que é possível desenhar um circuito de genes in silico com base nas combinaçoes dos módulos, o qual posteriormente é transferido para uma célula viva.

Figura 7. Visao geral das funçoes dos programas voltados ao armazenamento de dados genéticos e do GNPS respectivamente

Outros repositórios com funçoes semelhantes estao surgindo nesse cenário, como é o caso das plataformas voltadas para a desreplicaçao dos dados de espectrometria de massas. O GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking)³⁶ consiste em uma plataforma online que organiza e classifica inúmeros espectros de MS/MS de diferentes fontes, além de possibilitar o compartilhamento e comparaçao desses dados. O uso das ferramentas de desreplicaçao (MS/MS) auxiliam na obtençao de um conhecimento prévio do perfil do metabolismo secundário por comparaçao aos espectros de entidades já depositadas (Figura 7B). Nessa plataforma, o cientista solicitante envia os espectros de suas análises e o programa é capaz de comparar semelhanças no perfil de fragmentaçao. Para alimentar a base com novos produtos naturais, o cientista solicitante deposita o espectro de MS/MS, realiza a anotaçao e uma parcela da comunidade avalia a acurácia dos dados obtidos e os novos produtos sao integrados à plataforma. Na última atualizaçao publicada haviam mais de 18 mil compostos com alta acurácia (classificados como ouro) no banco de dados principal, enquanto que o conjunto de dados públicos ultrapassava 220 mil (classificados como bronze).

Além disso, é disponibilizado o tratamento de dados por meio de uma rede molecular (molecular networking).³⁷ Nessa aplicaçao os dados de MS/MS sao categorizados de acordo com suas perdas de massas relativas formando grupos de íons que apresentam, portanto, similaridade estrutural. Dessa forma, estruturas correlatas podem ser identificadas.

O potencial biossintético de microrganismos nao cultiváveis em condiçoes laboratoriais também tem sido explorado com o intuito de aumentar o arsenal desconhecido das policetídeos sintases. Estima-se que seja necessário cultivar 10⁷ microrganismos para encontrar uma nova classe de metabólitos naturais bioativos³⁸ e, portanto, as fontes nao cultiváveis podem representar uma interessante reserva de diversidade estrutural ainda nao explorada.^39,40

Existem diversos meios de acessar as sequências codificadas em microrganismos nao cultiváveis em laboratórios. A clonagem de grandes fragmentos de DNA, por exemplo, possibilita o acesso das sequências totais de um determinado nicho biológico. O metagenoma ("genoma total") facilita o acesso às moléculas biossintetizadas por organismos nao cultiváveis em laboratório. As bibliotecas de grandes fragmentos de DNA sao transferidas para microrganismos cultiváveis, como Escherichia coli e podem ser mais facilmente replicadas e triadas seguindo metodologias classificadas em 2 categorias: 1) baseadas em sequência; ou 2) baseadas em funçoes. Como o nome sugere, a categoria baseada em sequência depende da triagem da biblioteca metagenômica por homologia a sequência genética de interesse, facilitando a identificaçao de clusters biossintéticos. Nos métodos baseados em funçao, a triagem dos clones é realizada a partir de uma funçao de interesse, como atividade antibiótica, transformaçao bioquímica ou etapa biocatalítica. Após identificado o recombinante de interesse, a informaçao genética pode ser transferida para outros organismos heterólogos e estudada com maior profundidade. Geralmente, é realizada a transformaçao em actinobactérias que apresentam algumas vantagens em relaçao a organismos mais simples, como a presença de blocos de biossíntese essenciais para que PKSs sejam ativadas (Figura 8).

Figura 8. Visao geral da metodologia de extraçao e avaliaçao do metagenoma

Os policetídeos nosperina (19)⁴¹ e arimetamicinas (20 e 21),⁴² isolados de organismos do solo, e o sideróforo vibrioferrina (22),⁴³ oriundos de ecossistemas marinhos, sao exemplos de metabólitos isolados por exploraçao do metagenoma (Figura 9).

Figura 9. Estrutura química dos metabólitos guiados pela metodologia de metagenômica

ESTRATÉGIAS DE ENGENHARIA GENÉTICA EM POLICETIDEOS

Várias estratégias podem ser adotadas com o intuito de gerar diversidade estrutural utilizando-se da colinearidade observada entre gene, proteína e produto policetídico obtido ao longo da biossíntese. É possível alterar a ordem dos domínios e módulos funcionais das PKS, a estereoquímica (KR), manipular o nível de oxidaçao do carbono da subunidade condensada (KR, DH, ER), o comprimento da cadeia policetídica e ainda promover a incorporaçao de substratos diferentes da via policetídica natural (AT).^44,45 Muitas das modificaçoes pós-traducionais, podem também ser manipuladas, retirando-as da biossíntese ou modificando elementos já presentes. Geralmente, essas transformaçoes envolvem glicosilaçoes⁴⁶ ou prenilaçoes⁴⁷ e nao se apresentam em linha com a PKS. Muitas enzimas pós-traducionais sao testadas também quanto a promiscuidade dos substratos para utilizaçao em biocatálise e sao capazes de gerar novos produtos naturais.⁴⁸

Uma metodologia final que pode ser adicionada para gerar diversidade estrutural é denominada mutassíntese. Nesse sistema a engenharia genética é utilizada para manipular as PKSs e torná-las hábeis a interagir com a química orgânica sintética.⁴⁹ Essa estratégia é baseada na alteraçao de uma pequena porçao da via biossintética, seja pelo aumento da promiscuidade de uma enzima envolvida na incorporaçao de um precursor (AT), ou pela modificaçao de um domínio de cetosintase (KS). A modificaçao genética para promover inserçao de unidades nao naturais tem sido alvo de estudos para gerar estruturas nao naturais na biossíntese de policetídeos. Vale ressaltar que essas modificaçoes devem ser minimamente invasivas para que o módulo em questao nao perca a sua funçao e interrompa a produçao por completo.⁵⁰ Um exemplo de modificaçao bem-sucedida resultou na obtençao de análogos propargilados da eritromicina. Auxiliado pelo docking molecular, foi observado que um resíduo de valina presente na AT do sexto módulo poderia ser modificado para aumentar sua aceitaçao por diferentes substratos. O mutante (Val295Ala) foi capaz de incorporar o substrato nao natural 2-propargilmalonil-SNAC e produzir 2-propargileritromicina A (23).⁵¹

No passado, o termo mutassíntese se referia a promoçao de diversidade estrutural simplesmente pela oferta de precursores semelhantes aos originais, explorando a promiscuidade das PKSs.⁵² Como exemplo, o domínio AT do módulo 4 do imunossupressor FK506 (24) aceita naturalmente resíduos de metilmalonil-, etilmalonil-, propilmalonil- e alilmalonil-CoA, assim como, derivados dessas estruturas aciladas, que podem ser suplementadas ao meio de cultivo. O uso desses precursores modificados tem levado ao isolamento de estruturas com atividade imunossupressora mais elevada em comparaçao ao produto natural (Figura 10).⁵³

Figura 10. Estruturas de policetídeos obtidas por mutassíntese

PLANEJAMENTO E USO DO ORGANISMO NATIVO OU HETEROLOGO

Antes de entender como sao realizadas as manipulaçoes genéticas para gerar diversidade em PKSs, devemos considerar alguns aspectos relevantes que auxiliam na modificaçao desses sistemas. Ao planejar uma manipulaçao genética devemos questionar o uso do organismo nativo como alvo da modificaçao ou, também, o uso de um organismo heterólogo.

A vantagem de se utilizar o organismo nativo é que a sequência completa da PKS está presente e intacta para a modificaçao. Nao é necessário isolar o cluster biossintético e despender esforços para transferi-lo a outro organismo capaz de traduzir a sequência desejada. Além disso, o detentor da PKS geralmente apresenta todos os elementos necessários para expressar funcionalmente essas sintases, carregando, por exemplo, os principais blocos de construçao dos policetídeos e grupos prostéticos necessários para ativar as enzimas (holo-forma), como a fosfopanteteína (reaçao catalisada pela fosfopanteteína transferase Ppant).⁵⁴

Já os organismos heterólogos visam suprir alguma necessidade que o nativo nao possui ou é debilitado. Por exemplo, existem organismos portadores das PKSs que apresentam ciclos de crescimento longos, produzem metabólitos em baixas concentraçoes, apresentam condiçoes de preparo difíceis, nao sao cultiváveis em laboratório (metagenômica) ou o cluster de interesse encontra-se silenciado, tornando a expressao em heterólogo uma alternativa atraente.

Além disso, o uso de organismos heterólogos pode oferecer algumas vantagens, como a presença de promotores induzíveis, metabolismo secundário de algumas vias de biossíntese silenciados (o que auxilia na identificaçao do metabólito) e pode ainda possuir indutores globais de biossíntese. Ambas as estratégias de modificaçao, tanto em organismo nativo quanto em heterólogo, sao baseadas nos sistemas de recombinaçao dos bacteriófagos⁵⁵ e a escolha pelo organismo ideal para engenharia genética sao ditadas basicamente pelas características do organismo nativo.

ENGENHARIA GENÉTICA NO ORGANISMO NATIVO

A maioria das modificaçoes realizadas nos organismos nativos utiliza-se dos eventos de recombinaçao homóloga para gerar mutaçoes. Usualmente, ela é realizada a partir de um duplo crossover que consiste na construçao de um vetor "suicida" que apresenta regioes de homologia com a sequência desejada (podendo ser incorporado entre elas deleçoes, substituiçao de sequências ou inserçoes) e nao possui origem de replicaçao no organismo nativo, tornando-o instável na ausência de um marcador de resistência específico (normalmente é utilizado a resistência a algum antibiótico ou a temperatura). O vetor também possui sítios de integraçao (int, derivados do sítio fC31 do fago) ao genoma do organismo nativo em sítios específicos de reconhecimento (attP).⁵⁶

O microrganismo depende de dois eventos distintos, o primeiro envolve a inserçao do fragmento de DNA mediado pela integrase φC31 e mantido através do marcador de resistência e o segundo evento ocorre na ausência do marcador, que inutiliza o segmento por conta da ausência da origem de replicaçao. Nesse caso, o microrganismo pode retornar a linhagem selvagem ou entao pode incorporar a mutaçao envolvendo o uso da recombinase (Cre e FLP),⁵⁵ que reconhece as regioes de homologia inseridas e promove a substituiçao dos genes, levando ao organismo modificado (Figura 11). Essa metodologia é aplicada principalmente em actinobactérias, para as quais esses elementos foram amplamente estudados. As restriçoes encontram-se na modificaçao de fragmentos maiores que 15 kbp.

Figura 11. Visao geral sobre a manipulaçao genética de microrganismos nativos utilizando o duplo "crossover"

Metodologias mais modernas de ediçao de genomas como o sistema CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) também podem auxiliar na biossíntese combinatória, facilitando modificaçoes por deleçoes genéticas, alteraçoes de sequências e inserçoes de genes. O CRISPR/Cas9 é uma ferramenta baseada em um antigo mecanismo de defesa natural encontrado nas bactérias para proteger seu conteúdo genético de DNA exógeno.⁵⁷ Esse mecanismo consiste em um agrupamento de repetiçoes palindrômicas curtas, regularmente interespaçadas, que mantém próximas sequências reconhecidas pela endonuclease denominada Cas9.^58,59

Especificamente, à medida que a regiao palindrômica é preenchida com DNA viral, ela se torna um acessório para atacar o vírus, pois o microrganismo pode traduzir o material genético em cada espaçador (crRNA - CRISPR RNAs) e formar o complexo Cas9-crRNA-tracRNA (trans-activating crRNA e trans-encoded RNA) que desliza sobre o DNA viral. A formaçao do híbrido crRNA-tracRNA guia a endonuclease Cas9 que hidrolisa o DNA exógeno, impedindo a replicaçao do vírus.

Evidências recentes revelam que a clivagem do DNA ocorre na presença de um pequeno segmento viral (protospacer) próximo a regiao 3' do DNA de interesse (NGG - N qualquer base, seguido de 2 guaninas). Essa pequena sequência, denominada PAM, permite o uso do sistema CRISPR/Cas9 nos mais variados organismos, como células humanas,⁶⁰ S. cerevisiae,⁶¹ E. coli⁶² e diferentes espécies de Streptomyces,⁶³ possibilitando qualquer mutaçao direcionada a partir da informaçao inserida entre os espaçadores do sistema CRISPR/Cas9. Ao passo que a clivagem é realizada pela Cas9, a polimerase reparadora reconstrói a clivagem podendo ser inserido pequenas mutaçoes na sequência (Figura 12). Existe também a possibilidade de inserir um DNA molde que compartilhe homologia com a sequência clivada. O resultado dessa etapa, viabiliza a ediçao desse fragmento a partir da recombinaçao homóloga.

Figura 12. Mecanismo de operaçao do sistema CRISPR/Cas9 (single guide sgRNA)

Esse sistema tem sido eficientemente aplicado para ativar clusters biossintéticos em diversas linhagens de Streptomyces. Além disso, através do seu uso foi possível adicionar alguns promotores de biossíntese (ermp* e kasO*p), levando a produçao de novos policetídeos aromáticos do tipo II em Streptomyces viridochromogenes.⁶⁴

ENGENHARIA GENÉTICA EM ORGANISMO HETEROLOGO

Os avanços recentes em biologia sintética possibilitam aos químicos de produtos naturais montar e reorganizar grandes clusters de genes biossintéticos de maneira rápida e precisa,⁶⁵ além de viabilizar uma série de organismos otimizados para a expressao heteróloga. Esses avanços proporcionam tanto o incremento da produçao de um determinado produto natural como gerar diversidade estrutural. Métodos baseados em ligaçao de sequências homólogas têm sido extensivamente utilizados para a montagem de grandes fragmentos de DNA e clonagem em uma única etapa de clusters biossintéticos.^66,67

A recombinaçao Red/ET (exonuclease/polimerase) consiste em uma metodologia de pareamento de regioes homólogas realizado in vivo por uma E. coli que contem os genes que codificam para o sistema de recombinaçao dos fagos, Redα/Redβ. Esse sistema é utilizado para recombinar um vetor circular e um fragmento linear, transformados em E. coli (Linear-plus-Circular Homologous Recombination, LCHR). O resultado desse processo é um plasmídeo circular que carrega o cluster de interesse proveniente do DNA genômico e um marcador de resistência (antibiótico) que pode ser facilmente selecionado.^68,69 Idealmente, o vetor pode conter as informaçoes necessárias para a integraçao ao sistema do organismo heterólogo e se tornar funcional para a expressao das vias biossintéticas. Red/ET foi utilizado com sucesso na definiçao dos genes essenciais para a biossíntese de asukamicinas (25) em Streptomyces nodosus (subsp. asukaensis)⁷⁰ e da fostriecina (26) de Streptomyces pulveraceus.⁷¹

Apesar do sucesso em reconstruir grandes clusters biossínteticos para expressao heteróloga, o sistema de recombinaçao Red/ET falha quando é necessário associar mais de um fragmento devido a contínua necessidade de adicionar um marcador de resistência. Mais recentemente foi relatada uma variante dessa metodologia, utilizando o sistema RecE/RecT em sua composiçao completa. Esse sistema é utilizado para a recombinaçao homóloga de fragmentos lineares (Linear-Linear Homologous Recombination, LLHR) que apresentam regioes flanqueadoras homólogas.⁷² O LLHR é mediado por um sistema de recombinaçao derivado do prófago RAC, composto por RecE (exonuclease), RecT (DNA polimerase - fita única), RecA (proteína reparadora - corrige erros de sequência) e Recγ (inibidor de RecE).

Um procedimento convencional para utilizar esse sistema consiste na digestao do DNA genômico (sem clivar a regiao de interesse) e adicionar o vetor contendo regioes flanqueadoras nas extremidades (amplificado por PCR) em uma transformaçao única em E. coli. O sistema RecE/RecT irá parear as regioes homólogas e ligar ao vetor linear. Esse novo plasmídeo carreador do cluster desejado pode ser transferido para organismo heterólogo para avaliar a produçao, além de possibilitar manipulaçoes, como deleçoes, inserçoes e substituiçoes genéticas. Essa metodologia possibilitou a clonagem direta do cluster responsável pela biossíntese dos policetídeos luminamicina A (27) e do peptídeo nao ribossomal luminamida (28), produzidos por Photorhabdus luminescens (Figura 14).⁷²

Figura 13. Metodologias de recombinaçao para clonagem de vias biossintéticas (adaptado de Kim e colaboradores)⁴

Figura 14. Estruturas de produtos naturais produzidos por expressao heteróloga ou manipulaçao de vias biossintética orientado principalmente para produçao de policetídeos

Embora o LLHR permita eficientemente a clonagem direta de um cluster biossintético a partir do DNA genômico, a eficácia dessa metodologia é limitada pelo tamanho do fragmento a ser clonado, sendo necessário, eventualmente, a divisao do cluster em fragmentos ou realizar a ligaçao em várias etapas. Para a reconstituiçao da biossíntese da salinomicina (6) (106 kbp) foram necessárias três etapas de recombinaçao para posterior expressao em Streptomyces coelicolor A3.⁷³

Adicionalmente, metodologias que permitem a recombinaçao de fragmentos maiores têm sido desenvolvidas para suprir as necessidades de clonar grandes clusters biossintéticos. Nesse sentido a recombinaçao associada a transformaçao (TAR) é uma metodologia desenvolvida no início dos anos 90, mas que foi sendo aprimorada durante os anos, permitindo a recombinaçao de até 250 kbp de informaçao.⁷⁴ A metodologia TAR utiliza a levedura Saccharomyces cerevisiae que possui seu próprio maquinário para promover recombinaçao in vivo de fragmentos, tornando-se uma alternativa aos sistemas bacterianos.

Devido a robustez para grandes fragmentos, essa metodologia foi associada inicialmente a metagenômica para remontar clones de cosmídeos com regioes de sobreposiçao, levando a adutos de biossíntese mais sofisticados como as fluostatinas F, G e H (29)⁷⁵ e a rabelomicina (30),⁷⁶ e um pentaciclo (31) derivado de uma PKS do tipo II, produzidos em organismo heterólogo, Streptomyces albus.

Novos vetores, como o pCAP01,⁷⁷ foram desenvolvidos para utilizaçao no sistema TAR e clonagem direta do DNA genômico. Esse novo vetor possui elementos de 3 hospedeiros: origem de replicaçao em S. cerevisiae (Arsh4/Cen6); origem de replicaçao em E. coli (pUC ori), baseada em cosmídeos para alta taxa de multiplicaçao e manutençao do vetor quando transferido para E. coli; e o sítio fC31 de integraçao ao genoma de actinobactérias (int e attp). Em alguns planejamentos é possível ainda integrar um promotor que direciona a produçao de metabólitos secundários.

Adotando o vetor pCAP01 foi possível clonar e ativar o cluster biossintético (67 kbp) associado a produçao do lipopeptídeo taromicina A presente na actinobactéria marinha Saccharomonospora sp. CNQ-490. Além desse metabólito, foi possível promover a biossíntese do marinopirrol (32) (30 kbp), utilizando como hospedeiro a Streptomyces coelicolor. ⁷⁸

O sistema de recombinaçao em leveduras também permite a construçao de vetores a partir de vários fragmentos amplificados por PCR que compartilhem regioes de homologia entre si, o que possibilita a reconstruçao completa de clusters biossintéticos, como é o caso da alpiniamida A (33) obtidas de Streptomyces sp. CBMAI 2042 (dado nao publicado). Além disso é possível desenhar deleçoes e inserçoes de domínios, tornando o TAR uma metodologia aplicável para a biossíntese combinatória de policetídeos. Shao e colaboradores⁷⁹ construíram um vetor via TAR para produzir os policetídeos do tipo I aurethina (11) e spectinabilina (34) (49 kb), de Streptomyces thiolatus. O plasmídeo de recombinaçao foi construído com base em 7 fragmentos amplificados por PCR e recombinados em S. cerevisiae. Além disso, foram realizadas modificaçoes nos próprios primers de PCR para gerar mutaçoes sítio-dirigidas. Adotando essa estratégia, a DH presente em AurB foi inativada pela construçao do duplo mutante H964A/D1131A levando a produçao do análogo hidroxilado (35, Figura 14).

Até o momento, todas as metodologias de recombinaçao apresentadas necessitam de um organismo vivo. Porém, existe um método muito bem consolidado que descarta a necessidade de um sistema vivo para realizar a recombinaçao resultando em um vetor circular. Esse método é conhecido como SLIC (Sequence Ligation Independent Cloning)^80,81 e pode ser realizado com kits comerciais baseados nas metodologias isotérmicas de Gibson⁸² (Gibson Assembly) e algumas variantes que executam as mesmas funçoes encontradas in vivo.

O vetor linear e os fragmentos obtidos via PCR ou restriçao do genoma podem ser recombinados em uma reaçao isotérmica a 50 ºC baseada na açao de uma T5 exonuclease, que degrada a sequência de DNA na direçao 3' - 5' gerando as terminaçoes protuberantes 3' que podem reanelar por complementaridade a outra sequência. Uma DNA polimerase preenche as sequências restantes e a DNA ligase sela as regioes de ligaçao. Esse vetor construído é imediatamente transformado em E. coli para manutençao e preservaçao do mesmo, que posteriormente pode ser transferido para o organismo produtor. A vantagem de se utilizar esse sistema de recombinaçao em detrimento da ligaçao tradicional de fragmentos é a presença do braço de homologia que é criado capaz de estabilizar a recombinaçao de grandes fragmentos de DNA.⁸²

A metodologia SLIC foi utilizada em biossíntese combinatória de policetídeos na obtençao de derivados da premonensina (36, Figura 14).⁸³ Fragmentos amplificados por PCR carregando uma deleçao foram ligados ao plasmídeo pKC1139 utilizando o SLIC-mix. Esse plasmídeo possui todos os elementos de integraçao ao genoma de Streptomyces (int e attP), uma origem de replicaçao sensível a temperatura (repT) e marcador de resistência a apramicina (apr). Em um primeiro evento, o plasmídeo foi adicionado a Streptomyces cinnamonensis e as linhagens resistentes a apramicina selecionadas. Posteriormente, essas colônias foram cultivadas a 40 ºC para favorecer o segundo evento de recombinaçao, no qual o fragmento adicionado pode ser expulso (retornando a cepa nativa) ou incorporado por recombinaçao homóloga, originando a linhagem mutante. Utilizando essa metodologia de duplo crossover, foi possível manipular 22 derivados de premonensina com diferentes graus de reduçao na cadeia policetídica, sendo que alguns apresentaram um aumento de atividade antimicrobiana frente a Pseudomonas aeruginosa.⁸³

Embora o sistema SLIC descarte o uso de um sistema in vivo para a recombinaçao, muitos questionamentos foram levantados quanto ao tamanho de fragmento passível de ser clonado por essa metodologia. Um procedimento interessante descrito por Zhou e colaboradores⁸⁴ propoe a clonagem em uma única etapa de 41 kbp do cluster biossintético responsável pela biossíntese de conglobatina (37), em Streptomyces conglobatus. O procedimento proposto, consiste na digestao do DNA genômico (HindIII e XhoI) e amplificaçao do vetor por PCR adicionando braços de homologia com as regioes terminais do cluster. A metodologia isotérmica de Gibson foi utilizada para reorganizaçao in vitro e o plasmídeo resultante foi transformado em E. coli. Utilizando esse método foi possível construir e transferir esse cluster para Streptomyces coelicolor, sem a necessidade de amplificar por PCR o agrupamento de interesse. A Figura 13 apresenta uma visao geral das técnicas utilizadas para reconstruçao e ampliaçao da diversidade estrutural em policetídeo sintases apresentadas nessa revisao.

CONCLUSOES E PERSPECTIVAS

Os policetídeos representam umas das classes de produtos naturais mais promissoras para a descoberta de novos candidatos a fármacos. O repertório biossintético revela uma impressionante habilidade da natureza em produzir compostos estruturalmente sofisticados, a partir de estruturas simples, como o acetato.¹⁴

Com o intuito de aumentar a diversidade metabólica que megassintases como as PKSs, a engenharia genética evoluiu um conjunto de técnicas de manipulaçoes para modificar os módulos e domínios enzimáticos presentes nessas enzimas, possibilitando a produçao de um grande número de novas estruturas dirigidas pelo conhecimento em biossíntese.

Para a descoberta de novos fármacos, usualmente grandes bibliotecas de compostos sao obtidas para triagem, mas no caso da aplicaçao de metodologias baseadas em biossíntese combinatória de produtos naturais nao sao produzidas bibliotecas numerosas, visto que as modificaçoes sao sempre guiadas. No entanto, vale ressaltar que a efetividade que essas estruturas apresentam reduz o tempo e o capital despendido, fatores bastante atrativos na prospecçao de um candidato a fármaco.

Combinar a biossíntese e a química orgânica sintética permite ampliar ainda mais o arsenal de estruturas, tornando a área mais versátil devido a diferentes modificaçoes que podem ser obtidas por reaçoes enzimáticas. Adotar a biossíntese permite, por exemplo, ampliar o número de compostos com centros estereoquímicos altamente controlados e especializados para otimizaçao da relaçao estrutura/atividade biológica. Uma cooperaçao maior entre as duas áreas pode prover ferramentas que possibilitem a síntese de estruturas cada vez mais complexas, se comparado ao uso independente dos métodos.

Embora as pesquisas aqui demonstradas tenham uma orientaçao maior para a biossíntese de policetídeos, que por conta de sua organizaçao modular facilitou até mesmo os primeiros estudos de biossíntese combinatória (amplamente executada no início dos anos 90), existe a possibilidade de gerar diversidade estrutural em todos os produtos naturais e isso representa um desafio recente para todos os que se relacionam com a área. Para isso, é necessário concentrar conhecimento em como manipular a informaçao genética das enzimas que catalisam a biossíntese dos produtos naturais. Nesse sentido, um dos pontos incide sobre a diversidade de sequências que conhecemos do metabolismo secundário. Quanto mais sequências conhecidas, mais substâncias podem ser descobertas e mais combinaçoes podem ser planejadas. Isso é um importante fator que tem impulsionado o uso de ferramentas de bioinformática e de metodologias (como o metagenoma e evoluçao dirigida).⁸⁵

Um dos desafios remanescentes para a área, recai sobre a produçao desses metabólitos modificados por biossíntese combinatória em escala industrial. A maior parte dos metabólitos produzidos por biossíntese combinatória sofre de baixa produtividade, sendo que para um fármaco ser autorizado e comercializado é necessário utilizar uma quantidade considerável do composto para testes clínicos. Nesse sentido, muitos avanços foram alcançados no desenvolvimento de promotores^86,87 e sítios de ligaçao do ribossomo.⁸⁸

Algumas aplicaçoes em técnicas conhecidas como chem-bio-chem surgiram para demonstrar que muitos esqueletos complexos podem ser derivatizados da natureza para tornar o processo factível. Um exemplo disso, é o antimalárico artemesinina produzido nas cascas de Artemesia annua. Em 2010 aproximadamente 655.000 mil mortes eram contabilizadas por conta da malária, sendo que o único fármaco altamente eficaz para o tratamento era produzido apenas em pequenas quantidades pela planta e a rota sintética era muito dispendiosa. A soluçao encontrada, foi transferir e aprimorar toda biossíntese do ácido artemesínico (intermediário) em S. cerivisiae. A partir desse precursor avançado o número de rotas sintéticas caiu drasticamente e a produçao em larga escala do fármaco foi viabilizada.⁸⁹

Com relaçao a biologia sintética, alcançamos um patamar em que várias alternativas podem ser adotadas, cada uma com um tipo diferente de limitaçao, cabe ao cientista ponderar qual aplicaçao é propícia para seu objetivo. Além disso, existem outras metodologias promissoras que estao começando a ser aderidas, como é o caso da técnica de ediçao de genomas utilizando o sistema CRISPR/Cas9, o que aumenta ainda mais a pletora de ferramentas que possuímos para manipular as sequências presentes nas enzimas.

O campo de biossíntese combinatória está pronto para novos desafios, onde o objetivo mais marcante é que o uso das sequências biossintéticas permite ao químico de produtos naturais influir sobre a natureza de suas estruturas.

AGRADECIMENTOS

Os autores expressam agradecimentos à FAPESP (2014/12727-5 e 2014/50249-8 (L.G.O); 2013/12598-8 e 2015/01013-4 (R.S.)) e ao CNPq (140824/2017-0 (B.S.P.) e 313492/2017-4 (LGO)).

REFERENCIAS

1. Bérdy, J.; J. Antibiot. 2012, 58, 385.

2. Bérdy, J.; J. Antibiot. 2005, 58,1.

3. Newman, D. J.; Cragg, G. M.; J. Nat. Prod. 2016, 79, 629.

4. Kim, E.; Moore, B. S.; Yoon, Y. J.; Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 649.

5. Goswami, S.; Vidyarthi, A. S.; Bhunia, B.; Mandal, T.; J. Biochem. Technol. 2012, 4, 581.

6. Jeli, D.; Antolovic, R.; Antibiotics 2016, 5, 1.

7. Lewis, R. E.; Kontoyiannis, D. P.; Darouiche, R. O.; Raad, I. I.; Prince, R. A.; Antimicrob. Agents. Chemother. 2002, 46, 3499.

8. Lim, L. E.; Vilchèze, C.; Carol, N G.; Jacobs, W. R.; Santiago, R. G.; Thompson, J.; Antimicrob. Agents. Chemother. 2013, 57, 1040.

9. Patel, J. M.; J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 61, 123.

10. Zhou, S.; Wang, F.; Wong, E. T.; Fonkem, E.; Hsieh, T. C.; Wu, J. M.; Wu, E.; Curr. Med. Chem. 2013, 20, 4095.

11. Luo, Y.; Cobb, R. E.; Zhao, H.; Curr. Opin. Biotechnol. 2014, 30, 230.

12. Hopwood, D. A.; Malpartida, F.; Kieser, H. M.; Ikeda, H.; Duncan, J.; Fujii, I.; Rudd, B. A. M.; Floss, H. G.; Omura, S.; Nature 1985, 314, 642.

13. Smith, S.; Tsai, S. C.; Nat. Prod. Rep. 2007, 24, 1041.

14. Hertweck, C.; Angew. Chem. 2009, 48, 4688.

15. Dewick, P. M.; Medicinal Natural Products A biosynthetic approach, 3^rd ed., Wiley: Nottingham, 2009.

16. Shen, B.; Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7, 285.

17. Cortés, J. Velasco, J.; Foster, G.; Blackaby, A. P.; Rudd, B. A. M.; Wilkinson, B.; Mol. Microbiol. 2002, 44, 1213.

18. Fu, C.; Auerbach, D.; Li, Y.; Scheid, U.; Luxenburger, E.; Garcia, R.; Irschik, H.; Rolf, M.; Angew. Chem. 2017, 56, 2192.

19. Cortes, J.; Haydock, S. F.; Roberts, G. A.; Bevitt, D. J.; Leadlay, P. F.; Nature 1990, 348, 176.

20. Donadio, S.; Staver, M. J.; McAlpine, J. B.; Swanson, S. J.; Katz, L.; Science 1991, 252, 675.

21. Cortes, J.; Wiesmann, K. E.; Roberts, G. A.; Brown, M. J.; Staunton, J.; Leadlay, P. F.; Science 1995, 268, 1487.

22. Kao, C. M.; Khosla, C.; Luo, G.; Cane, D. E.; Katz, L.; J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9105.

23. Oliynyk, M.; Brown, M. J. B.; Cortes, J.; Staunton, J.; Leadlay, P. F.; Chem. Biol. 1996, 3, 833.

24. McDaniel, R.; Ebert, K. S.; Hopwood, D. A.; Khosla, C.; Science 1993, 262, 1546.

25. Sugimoto, Y.; Ding, L.; Ishida, K.; Hertweck, C.; Angew. Chem. 2014, 53, 1560.

26. Wong, F. T.; Khosla, C.; Curr. Opin. Chem. Biol. 2012, 16, 117.

27. Bentley, S. D.; Chater, K. F.; Cerdeno, T. A. M.; Challis, G. L.; Thomson, N. R.; James, K. D.; Harris, D. E.; Quail, M. A.; Kieser, H.; Harper, D.; Bateman, A.; Brown, S.; Chandra, G.; Chen, C. W.; Collins, M.; Cronin, A.; Fraser, A.; Goble, A.; Hidalgo, J.; Hornsby, T.; Howarth, S.; Huang, C. H.; Kieser, T.; Larke, L.; Murphy, L.; Oliver, K.; O'Neil, S.; Rabbinowitsch, E.; Rajandream, M. A.; Rutherford, K.; Rutter, S.; Seeger, K.; Saunders, D.; Sharp, S.; Squares, R.; Squares, S.; Taylor, K.; Warren, T.; Wietzorrek, A.; Woodward, J.; Barrell, B. G.; Parkhill, J.; Hopwood, D. A.; Nature 2002, 417, 141.

28. De Oliveira, L. G.; Pupo, M. T.; Vieira, P. C.; Quim. Nova 2013, 36, 1577.

29. Zotchev, S. B.; Sekurova, O. N.; Katz, L.; Curr. Opin. Biotechnol. 2012, 23, 941.

30. Piel, J.; Nat. Prod. Rep. 2010, 27, 996.

31. Medema, M. H.; Raaphorst, R. V.; Takano, E.; Breitling, R.; Nat. Microbiol. 2012, 10, 191.

32. Weber, T.; Blin, K.; Duddela, S.; Krug, D.; Kim, H. U.; Bruccoleri, R.; Lee, S. Y.; Fischbach, M. A.; Muller, R.; Wohlleben, W.; Breitling, R.; Takano, E.; Medema, M. H.; Nucleic. Acids. Res. 2015, 43, 1.

33. Khaldi, N. Seifuddin, F. T.; Turner, G.; Haft, D.; Nierman, W. C.; Wolfe, K. H.; Fedorova, N. D.; Fungal Genet. Biol. 2010, 47, 736.

34. Skinnider, M. A.; Dejong, C. A.; Rees, P. N.; Johnston, C. W.; Li, H.; Webster, A. L. H.; Wyatt, M. A.; Magarvey, N. A.; Nucleic Acids Res. 2015, 43, 9645.

35. Dejong, C. A. Chen, G. M.; Li, H.; Johnston, C. W.; Edwards, M. R.; Rees, P. N.; Skinnider, M. A.; Webster, A. L. H.; Magarvey, N. A.; Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 1007.

36. Wang, M. Jeremy J.; Phelan, V. V.; Sanchez, L. M.; Garg, N.; Peng, Y.; Nguyen, D. Duy.; Watrous, J.; Kapono, C. A.; Luzzatto, K. T.; Porto, C.; Bouslimani, A.; Melnik, A. V.; Meehan, M. J.; Liu, W. T.; Crüsemann, M.; Boudreau, P. D.; Esquenazi, E.; Sandoval, C. M.; Kersten, R. D.; Pace, L. A.; Quinn, R. A.; Duncan, K. R.; Hsu, C. C.; Floros, D. J.; Gavilan, R. G.; Kleigrewe, K.; Northen, T.; Dutton, R. J.; Parrot, D.; Carlson, E. E.; Aigle, B.; Michelsen, C. F.; Jelsbak, L.; Sohlenkamp, C.; Pevzne, P.; Edlund, A.; McLean, J.; Piel, J.; Murphy, B. T.; Gerwick, L.; Liaw, C. C.; Yang, Y. L.; Humpf, H. U.; Maansson, M.; Keyzers, R. A.; Sims, A. C.; Johnson, A. R.; Sidebottom, A. M.; Sedio, B. E.; Klitgaard, A.; Larson, C. B.; Boya, C. A.; Torres, M. D.; Gonzalez, D. J.; Silva, D. B.; Marques, L. M.; Demarque, D. P.; Pociute, E.; O'Neill, E. C.; Briand, E.; Helfrich, E. J. N.; Granatosky, E. A.; Glukhov, E.; Ryffel, F.; Houson, H.; Mohimani, H.; Kharbush, J. J.; Zeng, Y.; Vorholt, J. A.; Kurita, K. L.; Charusanti, P.; McPhail, K. L.; Nielsen, K. Fog.; Vuong, L.; Elfeki, M.; Traxler, M. F.; Engene, N.; Koyama, N.; Vining, O. B.; Baric, R.; Silva, R. R.; Mascuch, S. J.; Tomasi, S.; Jenkins, S.; Macherla, V.; Hoffman, T.; Agarwal, V.; Williams, P. G.; Dai, J.; Neupane, R.; Gurr, J.; Rodríguez, A. M. C.; Lamsa, A.; Zhang, C.; Dorrestein, K.; Duggan, B. M.; Almaliti, J.; Allard, P. M.; Phapale, P.; Nothias, L. F.; Alexandrov, T.; Litaudon, M.; Wolfender, J. L.; Kyle, J. E.; Metz, T. O.; Peryea, T.; Nguyen, D. T.; VanLeer, D.; Shinn, P.; Jadhav, A.; Müller, R.; Waters, K. M.; Shi, W.; Liu, X.; Zhang, L.; Knight, R.; Jensen, P. R.; Palsson, B. O.; Pogliano, K.; Linington, R. G.; Gutiérrez, M.; Lopes, N. P.; Gerwick, W. H.; Moore, B. S.; Dorrestein, P. C.; Bandeira, N.; Nat. Biotechnol. 2016, 34, 828.

37. Yang, J. Y. Sanchez, L. M.; Rath, C. M.; Liu, X. ; Boudreau, P. D.; Bruns, N.; J. Nat. Prod. 2013, 76, 1686.

38. Baltz, R. H.; Microbe 2007, 2, 125.

39. Stewart, E. J.; J. Bacteriol. 2012, 194, 4151.

40. Milshteyn, A.; Schneider, J. S.; Brady, S. F.; Chem. Biol. 2014, 21, 1211.

41. Kampa, A.; Gagunashvili, A. N.; Gulder, T. A. M.; Morinaka, B. I.; Daolio, C.; Godejohann, M.; Miao, V. P. W.; Piel, J.; Andrésson, O. S.; Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 2013, 110, 3129.

42. Kang, H.; Brady, S. F.; Angew. Chem. 2013, 52, 11063.

43. Fujita, M. J. Kimura, N.; Sakai, A.; Ichikawa, Y.; Hanyu, T.; Otsuka, M.; Ujita, M. J. F.; Imura, N. K.; Akai, A. S.; Chikawa, Y. I.; Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011, 75, 2283.

44. Baerga-ortiz, A. Popovic, B.; Siskos, A. P.; Hare, H. M. O.; Spiteller, D.; Williams, M. G.; Campillo, N.; Spencer, J. B.; Leadlay, P. F.; Chem. Biol. 2006, 13, 277.

45. Li, Y.; Fiers, W. D.; Bernard, M.; Smith, J. L.; Aldrich, C. C.; Fecik, R. A.; ACS Chem. Biol. 2014, 9, 2914.

46. Nguyen, H. C.; Karray, F.; Lautru, S.; Gagnat, J.; Lebrihi, A.; Duong, T.; Huynh, H.; Pernodet, J. L.; Antimicrob. Agents. Chemother. 2010, 54, 2830.

47. Sanchez, J. F.; Entwistle, R.; Hung, J. H.; Yaegashi, J.; Chiang, Y.; Wang, C. C. C.; Oakley, B. R.; J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 4010.

48. Chooi, Y.; Wang, P.; Fang, J.; Li, Y.; Wu, K.; Wang, P.; Tang, Y.; J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 9428.

49. Weissman, K. J.; Trends. Biotechnol. 2007, 25, 139.

50. Floss, H. G.; J. Biotechnol. 2006, 124, 242.

51. Sanchez, G. E.; Schulz, F.; ACS Chem. Biol. 2013, 8, 443.

52. Cane, D. E.; Kudo, F.; Kinoshita, K.; Khosla, C.; Chem. Biol. 2002, 9, 131.

53. Mo, S.; Kim, O. D. H.; Lee, O. J. H.; Park, J. W.; Basnet, D. B.; Ban, Y. H.; Yoo, Y. J.; Chen, S. W.; Park, S. R.; Choi, E. A.; Kim, E.; Jin, Y. Y.; Lee, S. K.; Park, J. Y..; Liu, Y.; Lee, M. O.; Lee, K. S.; Kim, S. J.; Kim, D.; Park, C.; Lee, S. G.; Kwon, H. J.; Suh, J. W.; Moore, B. S.; Lim, S. K.; Yoon, Y. J.; J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 976.

54. Lambalot, R.; Gehring, A. M.; Fluge, R. S.; Zuber, P.; Lacelle, M.; Marahie, M. A.; Reid, R.; Khosia, C.; Walsh, C. T.; Chem. Biol. 1996, 3, 923.

55. Nafissi, N.; Slavcev, R.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 2841.

56. Sun, Y.; Hong, H.; Samboskyy, M.; Mironenko, T.; Leadlay, P. F.; Haydock, S. F.; Microbiology 2006, 152, 3507.

57. Deveau, H.; Garneau, J. E.; Moineau, S.; Annu. Rev. Microbiol. 2010, 64, 475.

58. Koonin, E. V.; Makarova, K. S.; RNA Biol. 2013, 10, 679.

59. Barrangou, R.; Marraffini, L. A.; Mol. Cell. 2014, 54, 234.

60. Cong, L.; Ran, F. A.; Cox, D.; Lin, S.; Barretto, R.; Habib, N.; Hsu, P. D.; Wu, X.; Jiang, W.; Science 2013, 339, 819.

61. Bao, Z. Xiao, H.; Liang, J.; Zhang, L.; Xiong, X.; Sun, N.; Si, T.; Zhao, H.; ACS Chem. Biol. 2015, 4, 585.

62. Jiang, W.; Bikard, D.; Cox, D.; Zhang, F.; Marraffini, L. A.; Nat. Biotechnol. 2013, 31, 233.

63. Cobb, R. E.; Wang, Y.; Zhao, H.; ACS Synth. Biol. 2015, 4, 723.

64. Zhang, M. M.; Wong, F. T.; Wang, Y.; Luo, S.; Lim, Y. H.; Heng, E.; Yeo, W. L.; Cobb, R. E.; Enghiad, B.; Ang, E. L.; Zhao, H.; Nat. Chem. Biol. 2017, 13, 607.

65. Editorial. Meeting Report for Synthetic Biology for Natural Products 2017: The Interface of (Meta)Genomics, Machine Learning, and Natural Product Discovery. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 737.

66. Cobb, R. E.; Ning, J. C.; Zhao, H.; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2014, 41, 469.

67. Gibson, D. G.; Nat. Methods 2014, 11, 521.

68. Zhang, Y.; Muyrers, J. P. P.; Stewart, A. F.; Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1314.

69. Ongley, S. E.; Bian, X.; Neilan, B. A.; Muller, R.; Nat. Prod. Rep. 2013, 30, 1121.

70. Pospís, S.; Rui, Z.; Yang, Y.; Chen, C. Y.; Tsai, S. F.; Floss, H. G.; Petr, M.; J. Biol. Chem. 2010, 285, 24915.

71. Su, C. Zhao, X.; Qiu, R.; Tang, L.; Su, C. ; Zhao, X. ; Qiu, R. ; Tang, L.; Pharm. Biol. 2015, 53, 269.

72. Fu, J.; Bian, X.; Hu, S.; Wang, H.; Huang, F.; Seibert, P. M.; Plaza, A.; Xia, L.; Müller, R.; Stewart, A. F.; Zhang, Y.; Nat. Biotechnol. 2012, 30, 440.

73. Yin, J.; Hoffmann, M.; Bian, X.; Tu, Q.; Yan, F.; Xia, L.; Nature 2015, 5, 1.

74. Kouprina, N.; Larionov, V.; Nature 2006, 7, 805.

75. Feng, Z.; Kim, J. H.; Brady, S. F.; J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 11902.

76. Feng, Z.; Kallifidas, D.; Brady, S. F.; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011, 108, 12629.

77. Nah, H.; Pyeon, H. R.; Kang, S. H.; Choi, S. S.; Kim, E. S.; Kim, E. S.; Front. Microbiol. 2017, 8, 1.

78. Yamanaka, K.; Reynolds, K. A.; Kersten, R. D.; Ryan, K. S.; Gonzalez, D. J.; Nizet, V.; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014, 111, 1957.

79. Shao, Z.; Zhao, H.; Mol. Biosyst. 2011, 7, 1056.

80. Li, M. Z.; Elledge, S. J.; Nat. Methods 2007, 4, 251.

81. Jeong, J.; Yim, H. S.; Ryu, J. Y.; Lee, H. S.; Lee, J. H.; Seen, D. S.; Kang, S. G.; Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 5440.

82. Gibson, D. G. Young, L.; Chuang, R. Y.; Venter, J. C.; Hutchison, C. A.; Smith, H. O.; Nat. Methods 2009, 6, 343.

83. Kushnir, S.; Sundermann, U.; Yahiaoui, S.; Brockmeyer, A.; Janning, P.; Schulz, F.; Angew. Chem. 2012, 51, 10664.

84. Zhou, Y. Murphy, A. C.; Samborskyy, M.; Prediger, P.; Dias, L. C.; Leadlay, P. F.; Chem. Biol. 2015, 22, 745.

85. de Oliveira, L. G.; Mantovani, S. M.; Quim. Nova 2009, 32, 742.

86. Bibb, M. J.; Janssen, G. R.; Ward, J. M.; Gene 1985, 38, 215.

87. Li, S.; Wang, J.; Li, X.; Yin, S.; Wang, W.; Yang, K.; Microb. Cell. Fact. 2015, 14, 1

88. Salis, H. M.; Mirsky, E. A.; Voigt, C. A.; Nat. Biotechnol. 2009, 27, 946.

89. Ro, D. K.; Paradise, E. M.; Ouellet, M.; Fisher, K. J.; Newman, K. L.; Ndungu, J. M.; Ho, K. A.; Eachus, R. A.; Ham, T. S.; Kirby, J.; Chang, M. C. Y.; Withers, S. T.; Shiba, Y.; Sarpong, R.; Keasling, J. D.; Nature 2006, 440, 940.