JBCS

INTRODUÇAO

A nanotoxicologia é um ramo da toxicologia dedicado ao estudo dos efeitos toxicológicos de nanomateriais em diferentes sistemas biológicos, incluindo células, tecidos e organismos vivos.¹ Uma década de pesquisa envolvendo a nanotoxicologia tem mostrado que as interaçoes entre os nanomateriais com células, animais, seres humanos e meio ambiente sao extremamente complexas.² Atualmente, os pesquisadores ainda estao tentando entender, em detalhes, como as propriedades físico-químicas e morfológicas dos nanomateriais podem influenciar essas interaçoes, e assim determinar o impacto final dos nanomateriais na saúde e no meio ambiente.³ Toxinas sao compostos químicos naturais ou sintéticos capazes de causar efeitos adversos ou danos (toxicidade) nos sistemas biológicos. Entretanto, esses efeitos sao dependentes da dose. Em geral, a dose é definida como a massa de um composto químico por unidade de peso corporal (g/kg de peso corporal).⁴ As propriedades morfológicas e físico-química dos nanomateriais causam grande impacto na interaçao do nanomaterial com as células, em meio biológico, e dessa forma impactam sua toxicidade. Entretanto, apesar da nanotoxicologia estudar os efeitos tóxicos de nanomateriais, os efeitos de tamanho dos materiais sao importantes ao compará-los com materiais em escala microscópica ou macroscópica. Logo, o conceito de dose para nanotoxicologia se baseia em diferentes parâmetros, como: tamanho da partícula e sua área superficial, morfologia, composiçao, química da superfície, estado de aglomeraçao/agregaçao, etc.^3,5 De fato, todos estes parâmetros influenciam criticamente na determinaçao da dose das nanopartículas e, consequentemente, na avaliaçao precisa da sua toxicidade. Singh et al.⁴ resumiram esses conceitos na emergente área da nanotoxicologia. Contudo, deve-se ter em mente que humanos sao animais, portanto, proteçao contra a toxicidade de agentes externos e determinaçao de valores máximos de exposiçao seriam impossíveis de serem determinados sem a possibilidade de estudar seus efeitos sobre animais de laboratório. Existem já algumas estratégias para estudos de interaçao de nanopartículas e sistemas biológicos.⁶

Nas próximas sessoes desse trabalho, serao demonstrados os conceitos aplicados à nanotoxicologia considerando algumas das nanopartículas mais estudadas nos últimos anos e utilizadas comercialmente: as nanopartículas de prata (NPs de Ag).

O que sao nanopartículasde prata (NPs de Ag)?

Existem várias definiçoes segundo as agências envolvidas com nanotecnologia e nanopartículas. A recomendaçao atual (desde 2016) para definir um nanomaterial, de acordo com a Comunidade Européia é: "um material natural, incidental ou manufaturado contendo partículas, em estado nao agregado ou agregado, no qual 50% ou mais das partículas na distribuiçao de tamanho numérico, uma ou mais dimensoes externas estiverem na faixa de tamanho 1 nm - 100 nm" (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/nanotech/faq/definition_en.htm).

As NPs de Ag sao um dos nanomateriais mais estudados atualmente. Sao as nanopartículas mais utilizadas do ponto de vista industrial e comercial graças às suas propriedades características, como estabilidade química, maleabilidade, flexibilidade, elevada condutividade elétrica e térmica, atividade catalítica, relativo baixo custo de produçao e principalmente potente açao antimicrobiana frente a bactérias, vírus, fungos e protozoários. Dessa forma, as NPs de Ag sao amplamente utilizadas em várias aplicaçoes como agentes antibacterianos, antifúngicos, antivirais, anti-inflamatórios, antitumorais, regeneradores, biossensores e catalisadores. Elas estao presentes em produtos na indústria de alimentos, têxtil, perfumaria, farmacêutica, agrícola, higiene, produtos de limpeza, tintas, eletroeletrônicos, entre outras.^7-17 Possuem uma ampla aplicabilidade, como por exemplo, em medicina, cosmetologia, no recobrimento de dispositivos médicos, na confecçao de nanogéis, nanoloçoes, na preparaçao de materiais para recobrimento de lesoes cutâneas.^11-14

Importância das NPs de Ag na pesquisa e no mercado

Ao se realizar uma busca em plataformas de busca de artigos científicos, como o Web of Science - ISI, pode-se encontrar numerosas citaçoes em funçao de vários parâmetros. A Figura 1A mostra as referências obtidas utilizando-se como palavras chaves na busca: "silver nanoparticles" e "toxicology" (6962 citaçoes). A Figura 1B mostra que usando as palavras "AgNPs" e "nanotoxicology" na busca, aparece um valor de 9359 citaçoes.

Figura 1. Resultados da busca de trabalhos na plataforma Web of Science, usando como palavras chaves "silver nanoparticles" e "toxicology" (A) e resultados da busca de trabalhos usando como palavras chaves "AgNPs" e "nanotoxicology" (B). Data da busca: 12 junho de 2018

A Figura 2 apresenta uma tendência do Mercado Global baseado uso de NPs de Ag em aplicaçoes eletroeletrônicas, na área da saúde, das indústrias de alimentos, bebidas e têxtil. O mercado global de NPs de Ag foi analisado desde 2012 com perspectivas até 2022, destacando a utilizaçao em toneladas dessas nanopartículas. (Publicado: Maio 2015, ISBN Code: 978-1-68038-413-0 (http://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/silver-nanoparticles-market) (Figura 2). Uma análise importante foi realizada pela "Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks" (SCENIHR) mostrando que as NPs de Ag sao utilizadas em aproximadamente 243 produtos comerciais.¹⁸

Figura 2. Mercado e produçao em toneladas de NPs de Ag. (Fonte: https://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/silver-nanoparticles-market, acessado em 24 de maio de 2018)

Em vista do numeroso uso das AgNPs (Figura 2), a Agência de Proteçao Ambiental dos EUA (EPA), recentemente, começou a exigir que os fabricantes de NPs de Ag registrem seus produtos, indicando que as nanopartículas podem trazer riscos diferentes do que a prata regular (nao nanométrica). Entretanto, existem alguns questionamentos a respeito deste ponto. Os clientes, por sua vez, muitas vezes nao podem verificar se os produtos contêm prata de tamanho nanométrico, já que nao há obrigaçao de se informar no rótulo do produto a presença de nanomaterais. A França foi um dos primeiros países a exigir este tipo de notificaçao nas bulas de cosméticos.⁵ A Figura 3A mostra o aumento do número de produtos comerciais com nanomateriais no período de 2005-2013, enquanto que a Figura 3B mostra a porcentagem de produtos associados a um específico material no ano de 2013.

Figura 3. Mercado e produçao em toneladas de NPs de Ag. (A): o aumento do número de produtos comerciais com nanomateriais no período de 2005-2013. (B): Porcentagem de elementos químicos associados a produtos comerciais no ano de 2013. http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consultations/public_consultations/scenihr_consultation_17_en.htm.

É possível observar que no ano de 2013 mais de 50% dos nanomateriais produzidos foram baseados em NPs de Ag. Outras prediçoes baseadas nos conhecimentos do mercado relatam que a comercializaçao de produtos contendo NPs de Ag poderia chegar a movimentar 1.9 bilhoes de dólares em 2020. Isto significaria uma expansao a uma velocidade de crescimento anual (Compound Annual Growth Rate-CAGR) de 15.4% entre 2014 e 2020. (http://www.transparencymarketresearch.-com/pressrelease/global-nanosilver-market.htm). Assim, as informaçoes e projeçoes na produçao e aplicaçao de NPs de Ag sao enormes, e isso indica o quao importante sao os aspectos de segurança e avaliaçao dos seus riscos para saúde humana e ambiental.^18-23

ROTAS DE SINTESE DE NPS DE AG

Embora existam diversificados métodos de produçao de NPs de Ag, duas rotas sao as mais utilizadas: a síntese por reduçao química (tradicionalmente empregada) e a síntese biogênica ou biológica, desenvolvida mais recentemente devido a sua rapidez, simplicidade e sustentabilidade.²¹ Ambas as rotas sao baseadas na reduçao de íons prata (Ag⁺) a Ag⁰, formando as NPs de Ag.

Na rota química de preparaçao de NPs de Ag, os agentes redutores de Ag⁺ mais utilizados sao o citrato de sódio e borohidreto de sódio (Figura 4A).²² Além disso, a síntese química também apresenta versatilidade e outros agentes redutores utilizados sao o poli (álcoolvinílico) (PVA) e poli (etilenoglicol) (PEG), polímeros biocompatíveis que também atuam como agente estabilizantes.^11,23 Em geral, a síntese química forma NPs de Ag com considerável reprodutibilidade, permitindo o controle do tamanho e dispersao das nanopartículas, controlando os parâmetros experimentais. Destaca-se que a síntese química permite o maior controle do tamanho das NPs obtidas. As sínteses químicas apresentam versatilidade e algumas rotas podem empregar meio aquoso, ausência de reagentes tóxicos e condiçoes experimentais brandas. Entretanto, em algumas rotas sintéticas químicas empregam-se reagentes tóxicos, podendo gerar sub-produtos tóxicos, alguns protocolos requerem a presença de atmosfera inerte ou controle da temperatura. Além disso, a após a síntese das NPs de Ag pela rota química, a superfície das mesmas deve ser recoberta a fim de evitar a oxidaçao as nanopartículas e sua aglomeraçao.

Figura 4. Síntese química (A) e biogênica de NPs de Ag (B) (modificado a partir das referências 22, com permissao da American Chemical Society, e 26, artigo de acesso livre distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License: http://creativecommons.org/licenses/by/2.0)

Alternativamente, a rota biogênica vem ganhando considerável importância nos últimos anos (Figura 4B).^24-27 Trata-se de uma opçao economicamente e ecologicamente viável para a produçao de nanopartículas metálicas, incluindo as NPs de Ag. A síntese biogênica é considerada simples, de baixo custo, sustentável e pode ser realizada sob temperatura e pressao ambientes, sem uso de agentes estabilizantes externos.^14,28,29 As desvantagens da síntese biogênica podem ser elencadas como a maior dificuldade de escalonamento e rendimento das nanopartículas e, portanto, mais estudos sao necessários para o seu desenvolvimento. A síntese biogênica é realizada por extratos vegetais, fungos, bactérias, algas e leveduras.³⁰ Destaca-se que na síntese biogênica o agente redutor também é responsável pelo revestimento da superfície da nanopartículas obtidas, aumentando sua estabilidade e evitando sua aglomeraçao.

A Figura 4 representa esquematicamente a síntese química (A) e biogênica (B) de NPs de Ag. Na síntese química, a reduçao dos íons Ag⁺ foi realizada pelo borohidreto de sódio (NaBH₄). Na Figura 4B a reduçao dos íons Ag⁺ ocorre a partir de redutases presentes no extrato do fungo Fusarium oxysporum e transferência de elétron. Ressalta-se que na síntese biogênica de nanopartículas, os agentes biológicos responsáveis pela reduçao dos íons agem também como agentes pacificadores das nanopartículas metálicas obtidas, aumentando a estabilidade da suspensao coloidal de nanopartículas, evitando a oxidaçao e aglomeraçao das partículas. Além disso, a presença desses agentes biológicos na superfície das nanopartículas obtidas também pode oferecer alguma funcionalidade à nanopartícula.^31,32 Em relaçao à síntese de NPs de Ag, recentemente vários trabalhos importantes foram publicados.^8,33-38 Contudo, é importante destacar que as NPs de Ag produzidas por diferentes métodos apresentaram diferentes características físico-químicas e morfológicas e, portanto, diferentes interaçoes no meio biológico resultando em diferentes toxicidades.

PARAMETROS IMPORTANTES QUE INFLUENCIAM A TOXICIDADE DAS NPS DE AG

Cada nanopartícula (incluindo-se outras nanopartículas além das NPs de Ag) é única, em funçao da sua rota de preparaçao, tamanho, estado de agregaçao, estabilidade em meio biológico, natureza química do revestimento, carga superficial, etc. Destaca-se que tal variabilidade no processo de síntese de nanopartículas, incluindo as NPs de Ag, poderia ser um problema para o uso comercial das mesmas. O controle nos parâmetros de síntese de NPs de Ag é necessário para garantir a reprodutibilidade de sua produçao. Nesse sentido, nesta seçao serao abordados alguns fatores importantes que influenciam a toxicidade das NPs de Ag em células de humanos e animais.

Preparaçao da suspensao

Park et al.³⁹ avaliaram a toxicidade de uma suspensao comercial de NPs de Ag recobertas com citrato de sódio, preparada a partir de diferentes métodos. Os resultados mostram que a suspensao fracionada (agitada e sedimentada) foi menos tóxica para o organismo aquático modelo Daphnia (13,8 µg L^-1), em comparaçao com a suspensao coloidal (6.1 µg L^-1) sem tratamento algum, sugerindo que o método de preparaçao da suspensao de NPs de Ag foi um fator crítico na determinaçao da toxicidade das nanopartículas (Tabela 1).

Entretanto, as diferenças de toxicidade causadas pela suspensao de NPs de Ag nao foram observadas em peixe (Oryzias latipes). Análises de microscopia eletrônica de transmissao (TEM) mostraram que no caso da Daphnia, a suspensao coloidal é mais tóxica que a fracionada. Esse resultado pode ser explicado devido à maior agregaçao que se observa na suspensao coloidal em relaçao à suspensao fracionada. No caso da Daphinia, a toxicidade das suspensoes de NPs de Ag foi menor em comparaçao à toxicidade dos íons Ag⁺ (nitrato de prata (AgNO₃). As NPs de Ag possam liberar íons Ag⁺, o que geraria toxicidade. Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que o método utilizado para preparar a suspensao de AgNPs pode afetar a toxicidade das nanopartículas. Além disso, a Tabela 1 também mostra que as mesmas suspensoes de nanopartículas, preparadas pelos métodos iguais, podem causar diferentes toxicidades em diferentes organismos.³⁹

Ressalta-se que o impacto do envelhecimento das suspensoes coloidais de nanopartículas na toxicidade das mesmas ainda é pouco investigado devido à falta de metodologias adequadas. Entretanto, recentemente, um estudo demonstrou este efeito na toxicidade aguda de nanopartículas em matrizes reais e complexas, que provavelmente está associado à dissoluçao da amostra.⁴⁰

Química de superfície das nanopartículas

Considerando que a interaçao de NPs de Ag com o meio biológico, por exemplo, uma bactéria, ocorre por interaçao direta da nanopartículas com a entidade biológica, a química de superfície do nanomaterial é de grande importância para a açao biológica da nanopartícula. Dessa forma, a natureza química do revestimento da superfície da nanopartículas terá uma interaçao direta com a bactéria, ou outro microorganismo, desempenhando um papel importante na toxicidade da NP de Ag. Nesse sentido, estudos mostram como o revestimento da superfície de NPs de Ag pode atuar de forma diferente na toxicidade de NPs de Ag.^16,36 A natureza química do revestimento da superfície de NPs de Ag pode impactar significativamente sua toxicidade. A fim de avaliar esse parâmetro, foi realizado um estudo de exposiçao oral por 28 dias em ratos expostos a NPs de Ag (tamanho < 20 nm), NPs de Ag recobertas com polivinil pirrolidona (PVP) (NPs de Ag-PVP) (tamanho < 15) ([Ag]= 90 mg kg^-1 peso do rato) e AgNO₃ ([Ag]= 9 mg kg^-1 de peso do rato), em uma soluçao única.⁴¹ Após dissecaçao dos animais foi encontrada prata em todos os órgaos, destacando-se altas quantidades no fígado e baço. A concentraçao da prata nos órgaos correlacionou-se com a quantidade de Ag⁺ na suspensao de NPs de Ag, indicando que principalmente Ag⁺, e uma menor extensao NPs de Ag, passou ao intestino do rato exposto. Em todos os grupos estudados, a prata foi removida da maioria dos órgaos após 8 semanas após a dosagem. Entretanto, após esse período, ainda houve a presença de prata no cérebro e dos testículos dos animais, em todos os grupos tratados. Todos os biomarcadores nao relevaram hepatotoxicidade ou imunotoxicidade devido à exposiçao à prata. Portanto, a exposiçao oral dos animais a NPs de Ag parece ser muito similar à exposiçao com íons Ag⁺. Entretanto, a longa permanência da prata no cérebro e testículos dos animais deve ser considerada na avaliaçao de potencial risco das NPs de Ag.⁴¹

NPs de Ag sao responsáveis por diminuir as atividades das enzimas antioxidantes e desequilibrar o estado oxidativo nas células, entretanto, a funcionalizaçao da superfície dessas nanopartículas com albumina do soro bovino (BSA) e polietileno glicol (PEG) ajuda a proteger o efeito adverso de NPs de Ag nas células, indicando que a modificaçao da superfície das nanopartículas é fator importante na sua toxicidade.⁴² Ressalta-se que outro aspecto relevante na modificaçao da superfície das NPs de Ag em meio biológico sao as proteínas corona, que podem mudar completamente sua a atividade e toxicidade das nanopartículas.⁴³

Tamanho da nanopartícula

A toxicidade de nanopartículas pode ser afetada pelo tamanho de nanopartículas. Por exemplo, de maneira geral, reporta-se que nanopartículas menores apresentam uma tendência a maior habilidade de penetraçao celular e consequentemente, efeitos de toxicidade. Apesar de haver exceçoes, nanopartículas menores tendem a ser mais tóxicas em funçao da maior área superficial, promovendo uma maior área de contato e interaçao entre a nanopartículas e a entidade biológica, como por exemplo, uma bactéria. Ressalta-se que o tamanho da nanopartícula nao é o único fator que caracteriza a toxicidade da nanopartícula.^16,36 A toxicidade em funçao do tamanho das NPs de Ag foi avaliada em camundongos tratados com diferentes tamanhos de nanopartículas, numa dose única de 1 mg kg^-1 por 14 dias por administraçao oral.³⁹ As NPs de Ag de menores tamanhos que foram estudadas (22-71 nm) foram encontradas em diferentes órgaos incluindo cérebro, pulmao, fígado, rins e testículos, entretanto, as nanopartículas de tamanho maiores (323 nm) nao foram detectadas nos tecidos. Os níveis de marcadores bioquímicos aumentaram significativamente no soro dos animais tratados com as nanopartículas menores, entretanto, o mesmo nao foi observado para as nanopartículas maiores. Em experimentos usando doses repetidas de NPs de Ag (tamanho médio de 42 nm), durante 28 dias, em diferentes doses, foram observados efeitos adversos sobre o fígado e rins somente na dose alta (1,00 mg kg^-1). Baseado nestes resultados, sugere-se que a administraçao oral repetida de NPs de Ag pode causar hepatotoxicidade e resposta inflamatória em camundongos. Além disso, nanopartículas menores tendem a ser mais tóxicas e a se concentrar em diversos órgaos/tecidos.

Liu e coautores avaliaram os efeitos citotóxicos de NPs de Ag comercias de diferentes tamanhos (5 nm, 20 nm e 50 nm) recobertas com PVP frente a diferentes linhagens de células humanas, a saber: A549, SGC-7901, HepG2 e MCF-7. Os autores observaram maiores efeitos citotóxicos com as nanopartículas menores, ou seja, de 5 nm, em comparaçao com as nanopartículas maiores (20 nm e 50 nm). Além disso, houve uma maior internalizaçao das nanopartículas menores. Esses resultados indicam a relaçao entre tamanho e toxicidade das nanopartículas, para nanopartículas com um mesmo revestimento.⁴⁴

No entanto, recentemente, um estudo usando como modelo o mexilhao Mytilus galloprovincialis destacou que nao só o tamanho da nanopartícula é importante para impactar sua toxicidade, como também os diferentes mecanismos de internalizaçao das mesmas poderiam ser fatores-chaves que afetam o potencial do nanomaterial no meio para induzir a imunomodulaçao.⁴⁵

Morfologia da nanopartícula

Tak et al. sintetizaram NPs de Ag com diferentes morfologias, a partir de uma soluçao de borohidreto de sódio (agente redutor) na presença de citrato de sódio, como agente estabilizador.⁴⁶ Os autores obtiveram nanopartículas com morfologias triangulares, esféricas e de bastoes (Figura 5). As nanopartículas em forma de bastoes apresentaram um tamanho de 50 nm de comprimento e 20 nm de diâmetro, enquanto que as nanopartículas esféricas apresentaram um tamanho médio de 50 nm e as nanopartículas triangulares apresentaram uma espessura equilateral de 2 nm e um comprimento de 2 nm. Foram realizados ensaios in vivo em ratos SKH-1. Após 5 dias, foi retirado sangue do coraçao do animal, que foi analisado por ICP-MS para quantificaçao de prata. Observou-se que houve uma maior permeaçao de NPs de Ag com na forma de varas (105,57 ± 5,43 ng mL^-1), comparados com uma permeaçao de 50 ± 2,50 ng mL^-1 e 39,29 ± 1,96 ng mL^-1 de nanopartículas esféricas e triangulares, respectivamente. Os autores explicam que o tempo de exposiçao (5 dias) pode ter fornecido tempo suficiente para que as NPs de Ag penetrem lentamente o stratum corneum, epiderme e as camadas da derme.⁴⁶ Além disso, a interaçao das NPs de Ag com as bactérias é dependente da morfologia das NPs. De fato, NPs de Ag na forma triangular, as quais apresentam um plano de rede (111) como o plano basal exibiu a açao biocida mais significativa, em comparaçao com nanopartículas esféricas e em forma de bastoes, as quais apresentam predominantemente um plano de rede (100).⁴⁶

Figura 5. Imagens de microscopia eletrônica de transmissao de NPs de Ag nas formas esféricas, triangulares e de bastonetes, obtidas por diferentes protocolos sintéticos, (modificada a partir da referência 46, artigo de acesso livre distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution 4.0 International License: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0)

Efeito da dose

No estudo de toxicidade oral de NPs de Ag (tamanho de 56 nm) em ratos (F344) por 90 dias de exposiçao (0-500 mg kg^-1), observou-se uma diminuiçao significativa no peso corporal dos ratos machos, sem mudanças no consumo de alimentos ou água durante o período de exposiçao. A conclusao dos autores é que o órgao alvo das NPs de Ag foi o fígado, tanto nos ratos machos como nas fêmeas. O índice nao observável de efeito adverso (do inglês "no observable adverse effect level") foi de 30 mg kg^-1 e o menor nível observável de efeito adverso (do inglês "lowest observable adverse effect level") foi de 125 mg kg^-1.⁴⁷

Pinzaru e coautores sintetizaram quimicamente NPs de Ag utilizando citrato de sódio e dodecil sulfato de sódio como agentes estabilizantes. Em seguida, as nanopartículas foram recobertas com PEG. Os efeitos tóxicos das nanopartículas de Ag com e sem o revestimento de PEG foram avaliadas in vitro frente a cultura de células de queratinócitos humanos (HaCat) e in vivo em testes nao invasivos em camundongos sem pêlo SKH-1 com peso entre 30-35g. Foi administrada uma dose de 10 mg kg^-1 de nanopartículas, diariamente durante 6 dias. Os resultados dos testes in vitro mostraram que em concentraçoes entre 0,1 e 3,0 µmol L^-1 o número de células viáveis nao foi afetada após a adiçao da suspensao de nanopartículas durante diferentes períodos (24, 48 e 72 h). As concentraçoes de 10 e 50 µmol L^-1 mostraram um efeito citotóxico induzido pelas nanopartículas, onde no tempo de 48 e 72 h o efeito foi mais significativo. Nos testes in vivo, foi avaliado o peso corpóreo dos camundongos. Foi possível observar que a via de injeçao intraperitoneal nao induziu sintomas nocivos aos camundongos na dose testada de 10 mg kg^-1.⁴⁸

Efeito dos íons Ag⁺

As NPs de Ag podem liberar íons Ag⁺, quando sao expostas a água e oxigênio, situaçao encontrada no meio biológico. A toxicidade das NPs de Ag está relacionada com a sua área superficial, uma maior área superficial pode promover uma maior liberaçao de íons Ag⁺, os quais estao relacionados à toxicidade e açao antimicrobiana das nanopartículas. Discute-se que parte considerável da toxicidade de NPs de Ag se deva à formaçao de íons Ag⁺ no meio biológico. Assume-se que NPs de Ag podem ser internalizadas, e no interior das células liberar íons Ag+ causando estresse oxidativo, o qual pode promover a morte celular.^16,36 Ressalta-se que o mecanismo exato de toxicidade as NPs de Ag ainda é tema de debate.³⁶

LIMITES CRITICOS DE EXPOSIÇAO

Os limites de exposiçao de componentes de prata nos Estados Unidos mostraram valores variados dependendo da fonte de informaçao, como mostrado na Tabela 2. Entretanto, no Brasil, a legislaçao estabelece nas águas potáveis um limite de 0,010 mg L^-1 ou 10 µg L^-1 de (Ag total).⁴⁹

Alguns exemplos de exposiçao e doses internas de nanomateriais a base de prata

• Em 1979, 30 indivíduos foram expostos a nitrato de prata e óxido de prata. Seis apresentaram argiria e 20 tiveram argirose (deposiçao de prata nos olhos). As análises dos níveis de prata no sangue apoiaram a natureza benigna da argíria (18-26 µg L^-1).⁵⁰

• Em 2006 uma pessoa com queimaduras utilizou um curativo chamado Acticoat^R (contendo NPs de Ag com tamanho de 15 nm) por 6 dias e apresentou sintomas similares à argiria e suspeita de hepatotoxicidade. Embora os níveis de prata no plasma e na urina fossem altos, estes foram revertidos aos níveis normais após a remoçao do curativo.⁵¹

• Em 2007, um paciente que utilizou o mesmo curativo por 28 dias apresentou no soro o valor de 56,8 µg L^-1 de prata. Após 3 meses do término da utilizaçao do curativo, os valores de prata no soro foram revertidos aos níveis normais.⁵²

• Em 2012, dois trabalhadores do sexo masculinos foram analisados após 7 anos de exposiçao a nanomateriais de prata em concentraçoes de 3,5 e 13,5 ng L^-1. Análises bioquímicas do sangue e as informaçoes hematológicas foram encontradas dentro dos níveis normais. No primeiro indivíduo, foi estimada uma exposiçao de 0,35 µg m^-3 de prata acompanhada de um nível de 0,34 µg/L no sangue e 0,43 µg L^-1 na urina. No segundo indivíduo, a exposiçao estimada foi de 1,35 µg m^-3 acompanhada de 0,30 µg L^-1 no sangue e nao detectável (<0,1 µg L^-1) na urina. Parâmetros de química clínica e hematologia foram relatados como dentro da faixa normal.⁵³

• Um estudo de toxicidade em 62 humanos em 2014 foi realizado com NPs de Ag produzidas por eletrólise aquosa de tamanhos variando de 5-10 nm (concentraçao estoque de 10 µg mL^-1) ou na faixa de 25-40 nm (concentraçao estoque de 32 µg mL^-1).⁵⁴ A ingestao diária foi de 100 µg/dia para 5-10 nm e 480 µg/dia para 25-40 nm de prata. A administraçao oral de prata em suspensao aquosa libera tanto prata iônica como NPs de Ag. Afirmou-se nesta pesquisa que a maioria da prata detectada em amostras de sangue do paciente foi iônica, e ausência de evidências de que NPs de Ag intactas fossem absorvidas na circulaçao através do trato digestivo, ou ligadas aos componentes do sangue. A conclusao final dos autores foi que a exposiçao oral destas NPs de Ag comerciais nao produz mudanças significativas no metabolismo humano, hematológica, na urina, observaçoes físicas ou nas imagens de morfologia. Os autores sugerem a necessidade de mais estudos para compreender melhor os riscos de toxicidade NPs de Ag por outros sistemas biológicos.

• Munger et al. continuaram a investigar se a ingestao da prata coloidal ingerida oralmente produzia interferência na farmacocinética da enzima específica citocromo P450 em estudo cego simples, controlado, em pacientes simultaneamente com administraçao de sondas padronizadas da enzima P450. A ingestao oral da prata coloidal comercial produziu níveis de prata detectáveis em soro humano após 14 dias de administraçao, sem alteraçao clinicamente significativa. Foram avaliados aspectos metabólicos, hematológicos, urinários e aspectos físicos.⁵⁵

Casos extremos

Uma paciente de 58 anos de idade com argiria sobreviveu após a ingestao de 1 L de suspensao de prata coloidal diariamente por 16 meses como remédio tradicional (valor sérico de 381 ng/mL (referência <15 ng mL^-1).⁵⁶ Um homem de 71 anos com câncer de próstata ingeriu prata coloidal por 4 meses, com alto teor de prata no plasma, morreu após 6 meses após a nova ingestao de prata coloidal.⁵⁷ Wadhera e Fung⁵⁸ demonstraram que, para argiria, uma ingestao de prata coloidal deve ser realizada três vezes por dia durante 10 meses (450 mL de uma soluçao de 450 mg L^-1) . Todos os dados mostram que os efeitos terapêutico e tóxico podem ser somente exibidos pela prata livre Ag(I).⁵⁹

Em relaçao à exposiçao por inalaçao, Tsai et al.⁶⁰ avaliou as exposiçoes de nanopartículas no ar associadas ao manuseio manual de nano-alumina e nano-prata em exaustores em instalaçoes de escala de laboratório. As NPs de Ag pareciam ter um tamanho primário inferior a 100 nm, entretanto sofreram elevada agregaçao em partículas de vários mm quando examinadas como um pó em massa. No entanto, para manusear 15 g de prata em um béquer, foram relatadas concentraçoes no ar com um tamanho na faixa de 100-200 nm e uma contagem de pico de 7000 partículas por cm³.

Ressalta-se que as informaçoes referentes à ingestao de prata por humanos sao amplamente restrita a casos narrativos em que humanos ingeriram determinadas quantidades de NP de Ag (provavelmente como prata coloidal), geralmente em um período longo.⁶¹ Neste caso, a doença que foi encontrada foi a chamada argiria, como mencionado anteriormente.⁶² Isso se deu devido ao acúmulo de diferentes graus de sulfeto de prata nas fibras elásticas. A cor da pele de pessoas com argiria varia de azulada à preta. Nesses casos, sao reportados elevados níveis séricos de prata e grânulos de prata, principalmente na pele, baço, fígado e glândulas suprarrenais.⁶² Lyon et al. encontraram em amostras de fígado de crianças menores de seis anos de idade, a partir de amostras coletadas por autópsia, um nível significativo de prata (15,5 ng/g m/m), provavelmente de amálgama materna durante a gravidez e lactaçao. A presença de prata no fígado neonatal sugeriu que este metal atravessasse a barreira placentária em humanos.⁶³

CONCLUSOES

As nanopartículas de prata produzem efeitos tóxicos distintos dependendo de vários fatores discutidos nesta revisao. Resultados de estudos in vivo, tanto com camundongos quanto com humanos, demonstraram baixa toxicidade. Todavia, é evidente que existe a necessidade de estudos com maior tempo de exposiçao e avaliaçao em sistemas fisiológicos ainda nao estudados. A utilizaçao de materiais de referência (certificados) e estudos toxicológicos integrados (interlaboratoriais) sao de fundamental importância para o avanço do conhecimento e regulamentaçao envolvendo NPs de Ag.

Ressalta-se que o mau uso das NPs de Ag poderia, em longo prazo, causar problemas para a saúde. Foi reportado um trabalho experimental que monitorou a possibilidade de NPs de Ag desenvolverem resistência a Escherichia coli (K-12MG1655), uma bactéria que, até o presente momento, nao demonstra resistência à prata. Após 225 geraçoes de exposiçao ao ambiente de NPs de Ag, as populaçoes de bactérias expostas às NPs demonstraram maiores aptidoes em relaçao ao grupo controle para desenvolverem resistência, na presença de concentraçoes variáveis de NPs de Ag revestidas com citrato e de tamanho de 10 nm. A análise genômica mostrou que as mudanças associadas à resistência bacteriana às NPs de Ag já estavam acumulando dentro das populaçoes de tratamento pela geraçao 100 e, pela geraçao 200, três mutaçoes tinham alcançado alta frequência nos estoques de resistência às NPs de Ag. Este estudo indicou que, apesar das reivindicaçoes anteriores, seria difícil de conter a resistência bacteriana frente às NPs de Ag. As bactérias, contrariamente, podem facilmente evoluir resistência às NPs de Ag, e isso ocorre por mudanças genômicas relativamente simples. Estes resultados indicam que devem ser tomados cuidados com relaçao ao uso de NPs de Ag como biocidas, bem como no que se refere à exposiçao nao intencional de comunidades microbianas às NPs de Ag em produtos derivados de resíduos,⁶⁴ ou quando se considerada seu uso no meio ambiente para tratar algumas doenças em animais.⁶⁵

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao CNPq, à FAPESP (2016/10347-6) e aos centros INCT-INOMAT, NanoBioss-SisNANO, MCTI e Rede de Nanotoxicologia - Cigenanotox (CNPq/MCTI) pelo apoio.

REFERENCIAS

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