JBCS

INTRODUÇAO

Os n-alquilciclohexanos têm sido pouco utilizados e explorados em estudos geoquímicos para avaliaçao de biodegradaçao de óleos brasileiros, embora tenham sido detectados em petróleos de diferentes bacias sedimentares brasileiras, tais como Bacia de Campos,^1,2 Sergipe-Alagoas³ e Potiguar.⁴ A presença destes compostos em óleos e sedimentos é reconhecida há muitos anos,^5-9 sendo sua série homóloga detectada em petróleos e sedimentos de bacias de todo

o mundo, tais como nos extratos de rochas geradoras das Bacias McArthur, Canning, Amadeus e Hamersley da Austrália,^10-12 da Bacia de Puertollano na Espanha,¹³ da Bacia Silesian Coal da Polônia,¹⁴ e em óleos maturos dos Estados Unidos, Bolívia, Nigéria, Líbia^8,15 e de Alberta no Canadá.¹⁶

Os compostos n-alquilciclohexanos sao alcanos com um anel terminal de seis carbonos, e possuem uma distribuiçao similar ao perfil dos n-alcanos.^12,13 Embora esses compostos possam ter uma origem biológica direta proveniente de ácidos ciclohexilalcanóicos presentes em algumas espécies de bactérias,¹⁷ a afinidade destes com os n-alcanos aponta para a ciclizaçao da cadeia lateral dos lipídios como uma origem mais provável.^8,10,11,16 Assim, os n-alquilciclohexanos têm, provavelmente, os mesmos precursores dos n-alcanos.

De Lima,² ao analisar três amostras de óleos da Bacia de Campos com diferentes níveis de biodegradaçao (muito leve/leve, moderada e pesada), observou que a abundância relativa da série homóloga dos n-alquilciclohexanos tende a diminuir com o aumento da extensao da biodegradaçao. Essa observaçao está de acordo com a escala de biodegradaçao de Peter e Moldowan (PM), em que alquilciclohexanos têm uma alteraçao inicial em níveis moderados, intermediária em níveis pesados, sendo completamente degradados apenas em níveis severos de biodegradaçao.¹⁸

A biodegradaçao é um dos processos de alteraçao secundária que mais impactam o petróleo no interior de reservatórios em todo o mundo.^19,20 Trata-se de um processo pós deposicional que ocorre em reservatório sob temperaturas de cerca de até 80 ºC, no qual o petróleo é biologicamente degradado em escala de tempo geológico. Os microrganismos utilizam os hidrocarbonetos e outros componentes do petróleo como fonte de carbono (doadores de elétrons) e alguns nutrientes (oxigênio molecular, nitratos, sulfatos ou íon férrico) como receptores de elétrons,²¹ produzindo um óleo quimicamente e fisicamente alterado e de baixa qualidade.²² A baixa qualidade do petróleo se deve, dentre outros fatores, à formaçao de ácidos orgânicos que ocorre devido à biodegradaçao dos hidrocarbonetos de forma quase sequencial e sistemática,²² iniciando-se pelos n-alcanos, alquilciclohexanos, isoprenóides acíclicos e compostos bicíclicos, até atingir hidrocarbonetos mais complexos com três ou mais ciclos, tais como esteranos e terpanos, em estágios mais avançados do processo.²³

A presença de diversas classes de compostos numa matriz complexa como o petróleo torna necessária a utilizaçao de técnicas analíticas capazes de separar e quantificar analitos, garantindo uma interpretaçao confiável das informaçoes obtidas, principalmente quando existem diversos fatores responsáveis pela alteraçao nas quantidades das substâncias presentes (como origem da matéria orgânica, ambiente deposicional, fatores secundários, etc.). Nesse contexto, a cromatografia gasosa tem sido comumente utilizada para acompanhar essas mudanças composicionais, uma vez que o perfil cromatográfico ou impressao digital (fingerprint) de uma amostra de petróleo pode ser utilizado como uma das primeiras indicaçoes qualitativas da biodegradaçao por meio do monitoramento da diminuiçao dos compostos lineares (n-alcanos), levando ao aumento das razoes pristano Pr/nC17 e fitano Fi/nC18.^21,24 Essas mudanças sistemáticas também têm sido usadas por geoquímicos do petróleo para formular escalas de biodegradaçao baseadas na remoçao dos hidrocarbonetos de menor a maior complexidade, sendo a de Peters e Moldowan a mais amplamente utilizada, que varia de 0 (nenhuma biodegradaçao) a 10 (biodegradaçao severa).^18,23 No entanto, classificar amostras de óleo de acordo com seu nível de biodegradaçao nao é uma tarefa simples, devido à sua complexidade composicional, e também ao fato de que toda acumulaçao petrolífera é composta por mistura de óleos de diferentes maturidades, origens (diferentes rochas geradoras) ou mesmo níveis de biodegradaçao.²² Desta forma, a sugestao de novos parâmetros, como a utilizaçao dos compostos n-alquilciclohexanos encontrados em petróleos brasileiros, pode auxiliar nesta tarefa classificatória e de importância significativa para geoquímicos.^2,3,4

Além da avaliaçao dos hidrocarbonetos por cromatografia gasosa, outras técnicas vêm sendo utilizadas para avaliaçao da biodegradaçao por meio da avaliaçao dos compostos heteroatômicos (polares), como, por exemplo, a espectrometria de massas por Orbitrap (Orbitrap FT MS)^25,26 e a espectrometria de massas de ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier (FT-ICR MS),^27,28 capaz de analisar centenas de milhares de compostos do petróleo em uma única análise.²⁹ Dentre as muitas classes heteroatômicas avaliadas, uma das mais significantes para avaliar o processo de biodegradaçao é a classe O₂, composta principalmente por ácidos carboxílicos.²⁷ Os compostos polares podem ser classificados de acordo com o número de carbono ou do DBE (double bond equivalent), que corresponde ao número de insaturaçao (anéis mais ligaçoes duplas).²⁹ Por exemplo, os compostos de DBE 1 da classe O₂ compreendem principalmente os ácidos lineares (uma dupla apenas referente ao grupo funcional carboxila); já os compostos de DBE 2 da classe O₂ compreendem principalmente os ácidos monocíclicos (uma dupla do grupo carboxila mais um anel).²⁷

Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi utilizar os compostos da série homóloga dos n-alquilciclohexanos para avaliar a extensao da biodegradaçao de um conjunto de amostras de petróleos brasileiros, verificando-se a relaçao entre a reduçao na abundância desses compostos e o aumento do nível de biodegradaçao, com consequente formaçao de ácidos monocíclicos representados pelos compostos de DBE 2 presentes na classe O₂.

PARTE EXPERIMENTAL

Amostras

Neste trabalho foram utilizadas 26 amostras de petróleo provenientes de seis bacias sedimentares brasileiras: Campos (C01 a C18); Santos (SA01); Solimoes (SO02); Potiguar (P01); Espírito Santo (E01); e Recôncavo (R01 a R04). Essas seis bacias estao entre as principais províncias responsáveis atualmente pela produçao de petróleo no Brasil.³⁰ Essas amostras, com exceçao da amostra E01, foram classificadas em níveis de biodegradaçao (PM) por Martins et al.,³¹ conforme apresentado na Tabela 1.

Fracionamento dos óleos

Foi realizado o fracionamento SARA das amostras de óleo, que consiste na separaçao do óleo nas fraçoes de hidrocarbonetos saturados (S) e aromáticos (A), resinas (R) e asfaltenos (A). Inicialmente, os asfaltenos foram removidos do óleo cru utilizando-se n-hexano como solvente para promover a precipitaçao, seguido por filtraçao, de acordo com metodologia adaptada de Martins et al.³² Adicionaram-se 120,0 mL de n-hexano (grau cromatográfico, Sigma-Aldrich) a 4,0 g de óleo. A mistura foi agitada, seguindo para o banho em ultrassom por 10 minutos. Após a precipitaçao, a mistura malteno/asfalteno foi passada por filtro Whatman nº 40. O precipitado (fraçao asfaltênica no filtro) foi lavado com 60,0 mL de n-hexano, com o intuito de remover os possíveis compostos adsorvidos. O solvente da fraçao maltênica resultante (filtrado) foi evaporado e a amostra reservada para cromatografia líquida.

Parte da fraçao maltênica dos óleos (aproximadamente 0,10 g) foi, entao, submetida à cromatografia líquida em coluna de vidro recheada com sílica gel 60 (230-400 mesh; Merck) previamente ativada em estufa a 120 ºC durante 12 h. As fraçoes de hidrocarbonetos saturados e aromáticos e a fraçao contendo os compostos NSO (resinas) foram eluídas utilizando-se 40,0 mL de n-hexano, 40,0 mL de n-hexano:diclorometano (8:2 v/v) e 40,0 mL diclorometano:metanol (9:1 v/v), respectivamente. Todos os solventes utilizados foram de grau cromatográfico, da Sigma-Aldrich (Brasil). O solvente presente nas fraçoes coletadas foi evaporado, e as massas obtidas foram registradas.

Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)

A fraçao dos compostos saturados foi analisada em um cromatógrafo em fase gasosa Agilent Technologies 6890N, equipado com uma coluna DB-5 MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura do filme), acoplado a um detector seletivo de massas Agilent 5973 MSD. A programaçao de temperatura utilizada foi inicialmente de 60 ºC por 2 minutos, seguida por um aquecimento a uma taxa de 22 ºC min^-1 até 200 ºC, mantendo-se nessa temperatura por 3 minutos, e finalmente aquecida a uma taxa de 3 ºC min^-1 até 300 ºC, com essa temperatura final mantida por 25 minutos. O gás He foi utilizado como gás carreador, com o fluxo constante de 1 mL min^-1.

As temperaturas do injetor e da linha de transferência foram de 300 e 280 ºC, respectivamente. O espectrômetro de massas foi operado com energia de ionizaçao de 70 eV e temperatura de 230 ºC para a fonte de ionizaçao. A injeçao foi realizada sem divisao de fluxo, com o volume de injeçao de 1 µL. Utilizou-se análise em varredura linear (Scan) na faixa de 50-550 Dalton e monitoramento seletivo de íons (SIM = Single Ion Monitoring) como modo de análise para os íons fragmentos m/z 83, 85, 183 e 191, para analisar as classes de n-alquilciclohexanos, n-alcanos, isoprenóides e terpanos, respectivamente. Os compostos foram identificados com base em dados da literatura, perfil cromatográfico de amostras de referência e pelos espectros de massas.

Espectrometria de massas de altíssimo poder de resoluçao (FT-ICR MS)

As análises foram realizadas a partir de uma soluçao do óleo bruto em um espectrômetro de massas de ultra-alta resoluçao, o LTQ FT Ultra mass spectrometer (ThermoScientific, Bremen, Germany) com um magneto de 7,2 T. Cerca de 2 mg das amostras foram previamente dissolvidas em 1,0 mL de tolueno, e entao diluídas com 1,0 mL de metanol contendo 0,2% de hidróxido de amônio. Os solventes foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), com pureza HPLC. As amostras foram inseridas no espectrômetro de massas por infusao direta no modo negativo de íons, e analisadas com uma resoluçao de 400.000 em uma faixa de massas de 200-1000 m/z. Foi utilizado um fluxo na seringa de 5 µL min^-1, a voltagem capilar de -3,1 kV e foram obtidos espectros pela soma de 100 transientes totalizando 6 minutos de aquisiçao.

Os espectros de massas obtidos no FT-ICR MS foram processados utilizando o software PetroMS.³³ Esse software foi designado para calibrar e atribuir as fórmulas moleculares para séries homólogas conhecidas a partir da medida dos valores de m/z dos compostos polares do petróleo. Para cada espectro, processamentos automatizados foram realizados para designar fórmulas moleculares aos picos com sinal/ruído maior que três (> 3). Os elementos permitidos foram o ¹²C, ¹³C, ¹H, ¹⁶O, ¹⁴N e ³²S. O erro máximo permitido para as fórmulas moleculares foi de 1 ppm.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Análise dos n-alquilciclohexanos por CG-EM

Assim como em De Lima,² Da Silva⁴ e em outros trabalhos, a série homóloga dos n-alquilciclohexanos foi detectada em todas as 26 amostras de petróleos (cromatograma de massas do íon m/z 83), com distribuiçao similar ao perfil dos n-alcanos como mostrado na Figura 1 para amostra E01 da Bacia do Espírito Santo (os demais cromatogramas podem ser visualizados em Martins et al.,³¹ no material suplementar). Foi identificada a série homóloga destes cicloexanos monossubstituídos do C₁₃ ao C₂₆, como é apresentado na Tabela 2, e um espectro de massas representativo para sua classe, referente ao decil-cicloexano, é apresentado na Figura 2.

Figura 1. Cromatograma de íons reconstruídos para o íon-fragmento m/z 83, característico dos n-alquilciclohexanos, para a amostra E01. nC₁₅: n-alcano C₁₅; nC₂₇: n-alcano C₂₇. Os números correspondem aos compostos da série homóloga dos n-alquilciclohexanos, nomeados na Tabela 2

Figura 2. Espectro de massas do Decil-cicloexano (C₁₆, pico 4), representativo da classe dos n-alquilciclohexanos

Foi observada uma nítida diminuiçao da abundância dos n-alquilciclohexanos com o aumento da extensao da biodegradaçao, assim como observado por De Lima,² alcançando baixíssimas abundâncias para a amostra R03, a mais biodegradada, como já foi mostrado por Martins et al.³¹ (Figura 3).

Figura 3 Cromatogramas de íons reconstruídos para o íon-fragmento m/z 83 de amostras de petróleo com diferentes níveis de biodegradaçao: R01, nível 0-1; C₁₄, nível 3; C₁₀, nível 4-5; R03, nível 5-10 (Modificado de Martins et al.³¹). nC₁₅: n-alcano C₁₅; nC₂₇: n-alcano C₂₇; Os números correspondem aos compostos da série homóloga dos n-alquilciclohexanos (Tabela 2)

Desta forma, para avaliar o nível de biodegradaçao utilizando esta classe de compostos sugere-se a utilizaçao da razao H30/DC em conjunto com a razao H30/AC. Esses parâmetros sao calculados pela razao entre a abundância do biomarcador H30 17α(H), 21β(H)-hopano (obtido pelo cromatograma de massas do íon-fragmento m/z 191) sobre o decil-cicloexano (DC) e sobre a soma da abundância dos n-alquilciclohexanos (AC = Σ C₁₃-C₂₆ n-alquilciclohexanos) (obtidos pelo cromatograma de massas do íon-fragmento m/z 83), respectivamente. O decil-cicloexano foi escolhido para o cálculo da primeira razao, visto que se mostrou mais resistente à biodegradaçao. O H30 foi utilizado no cálculo destas razoes por ser considerado um biomarcador altamente resistente à biodegradaçao comumente encontrado em amostras de petróleo. Na Figura 4 é apresentado um gráfico da razao H30/AC versus H30/DC para as 26 amostras de óleo.

Figura 4. Gráfico da relaçao entre os parâmetros de biodegradaçao H30/AC e H30/DC, referentes às amostras de óleo brasileiro estudadas

Observa-se, na Figura 4, que a partir das razoes propostas pôde-se classificar as amostras em quatro grupos com níveis distintos de biodegradaçao de acordo com a escala PM: Nível 0-2 (nenhum/muito levemente/levemente) para as amostras R01, R02, R04 e SO02, em que nao houve alteraçao dos n-alquilciclohexanos; Nível 3 (moderado) para as amostras SA01, P01, E01, C01-C04, C06, C07, C09, C11-C18, em que houve alteraçao inicial dos n-alquilciclohexanos; Nível 4-5 (pesado) para as amostras C05, C08, C10, em que houve alteraçao intermediária destes; e Nível 6-10 (severo) para amostra R03, em que houve remoçao quase completa destes compostos. Esses resultados estao em concordância com a avaliaçao da extensao da biodegradaçao realizada por Martins et al.,³¹ com exceçao da amostra P01, que havia sido classificada como levemente biodegradada. Por isso ressalta-se a importância de se avaliar várias famílias de compostos para se obter uma classificaçao, quanto ao nível de biodegradaçao, mais satisfatória. Assim, sugere-se a inclusao dessas razoes para obter uma análise mais ampla e completa da extensao da biodegradaçao.

A fim de verificar a eficácia dos parâmetros propostos baseados nos n-alquilciclohexanos, esses foram relacionados com a razao do H30 17α(H), 21β(H)-hopano sobre o isoprenóide fitano (H30/Fi). Essa razao foi baseada no trabalho de Koopmans et al.,³⁴ que avaliaram a biodegradaçao de um conjunto de óleos pesados da Bacia Liaohe, noroeste da China, por meio da razao H30 17α(H), 21β(H)hopano/(P + Fi), e já foi utilizada para corroborar a classificaçao do nível de biodegradaçao no trabalho de Martins et al.³¹ A Figura 5 apresenta os gráficos do parâmetro H30/Fi versus os parâmetros H30/AC e H30/DC.

Figura 5. Gráficos da relaçao entre os parâmetros de biodegradaçao H30/AC e H30/Fi (A), e H30/DC e H30/Fi (B), referentes às amostras de óleo brasileiro estudadas

Observa-se, na Figura 5, uma boa relaçao entre os parâmetros avaliados, com os valores das razoes aumentando com a biodegradaçao devido à degradaçao do fitano e dos n-alquilciclohexanos, com exceçao da amostra E01, da Bacia do Espírito Santo. Já a amostra R03 nao foi mostrada nos gráficos, já que, devido ao seu nível severo de biodegradaçao, os valores para as razoes foram discrepantes das demais, sendo de 72,40 para H30/Fi, 0,49 para H30/AC e de 2,82 para H30/DC.

A amostra E01, que nao apresentou boa correlaçao entre os parâmetros H30/DC e H30/Fi, é a que possui o menor grau API entre todas amostras (14º), sendo classificada como óleo asfáltico, de acordo com esse parâmetro.³⁵ No entanto, foi classificada com nível de biodegradacao moderado (3), de acordo com os parâmetros H30/AC e H30/DC. Para verificar a possibilidade de mistura de óleos com níveis de biodegradaçao distintos (envolvendo petróleos leves e petróleos muito biodegradados), foi avaliada a presença do biomarcador 17α(H),21β(H)-25-norhopano (25NH) nessa amostra. A classe dos 25NH já havia sido detectada nas demais amostras com baixíssima abundância relativa, com valores da razao 25NH/H30 menores que 0,08 (Martins et al.).³¹ No entanto, essa razao apresentou um alto valor para a amostra E01 (25NH/H30 = 1,16). Portanto, essa amostra pode ser considerada uma mistura de óleos de diferentes níveis de biodegradaçao, visto que foi detectada a presença de n-alcanos (verificados pelo cromatograma de massas do íon-fragmento m/z 85), alcanos isoprenóides e 25-norhopanos.³⁶

Análise dos ácidos monocíclicos por ESI(-) FT-ICR MS

Muitos trabalhos têm indicado que a biodegradaçao é o principal processo que gera os ácidos carboxílicos presentes no petróleo, a partir da oxidaçao de seus componentes, principalmente dos hidrocarbonetos.^19,37 A avaliaçao dos compostos n-alquilciclohexanos para as 26 amostras de óleo deste trabalho mostraram que a abundância desses compostos diminui com a biodegradaçao e, com isso, espera- -se que a abundância dos ácidos monocíclicos, os prováveis produtos desta degradaçao microbiana, aumente em suas composiçoes. Para verificar essa tendência, as amostras foram analisadas por FT-ICR MS utilizando a técnica de ionizaçao por electrospray no modo negativo, ESI(-).

Pode-se considerar que os ácidos monocíclicos presentes na classe O₂ sao os compostos de DBE 2, ou seja, com uma insaturaçao e um ciclo saturado. Desse modo, relacionou-se o parâmetro %DBE 2 com a razao H30/AC, como mostrado no gráfico da Figura 6.

Figura 6. (A) Gráfico da abundância relativa dos compostos da classe O₂ de DBE 2 (%DBE 2) versus o parâmetro H30/AC, referentes as 26 amostras estudadas. (B) Gráfico mostrando a boa correlaçao entre a %DBE 2 e o parâmetro H30/AC, para as amostras estudadas, com exceçao das amostras menos biodegradadas SO01, R01, R02 e R04

Observa-se na Figura 6A uma relaçao entre a abundância relativa dos compostos da classe O₂ de DBE 2 com a razao H30/AC, na qual a diminuiçao dos compostos n-alquilciclohexanos indicada por essa última razao relaciona-se com o aumento dos ácidos monocíclicos. Essa tendência também foi observada por Angolini et al.²⁵ ao avaliarem os efeitos da biodegradaçao sobre compostos

Pode-se considerar que os ácidos monocíclicos presentes na classe monocíclicos. Essa tendência também foi observada por Angolini O₂ sao os compostos de DBE 2, ou seja, com uma insaturaçao e um et al.²⁵ ao avaliarem os efeitos da biodegradaçao sobre compostos oxigenados de petróleos brasileiros originados de bacias marginais utilizando Orbitrap como analisador de massas. Outra observaçao interessante na Figura 6A é a de que os ácidos monocíclicos foram também detectados, mesmo que em baixa abundância, nas amostras nao/muito levemente biodegradadas das Bacias de Solimoes e Potiguar (SO01, R01, R02, R04), que tiveram os valores para a razao H30/AC muito próximos de zero. Essa observaçao está coerente com o fato de que existem outras prováveis origens dos ácidos carboxílicos presentes no petróleo além da degradaçao microbiana, tais como os ácidos originais formados da rocha geradora (ácidos primários).³⁸ Já na Figura 6B apresenta-se esses resultados apenas para as amostras biodegradadas, em que se pode observar uma boa correlaçao entre a formaçao dos ácidos monocíclicos e a degradaçao dos seus possíveis precursores, os n-alquilciclohexanos, mostrada pela razao H30/AC, com um modelo linear ajustado com coeficiente de determinaçao (ajustamento) maior que 90% (R² = 0,93).

CONCLUSAO

A série homóloga dos n-alquilciclohexanos foi detectada em todas as amostras de petróleo deste trabalho, no qual a análise desses compostos por CG-EM se mostrou útil na avaliaçao da extensao da biodegradaçao, visto que se observou a diminuiçao de sua abundância com o aumento da extensao deste processo microbiológico. Foi proposto o uso em conjunto de dois parâmetros para avaliar a extensao da biodegradaçao baseados nos n-alquilciclohexanos, o H30/AC e o H30/DC, que possibilitou a classificaçao das amostras de petróleos brasileiros deste trabalho nos seguintes níveis de acordo com a escala de Peters e Moldowan: nível 0-2 (nenhum/muito leve/leve); nível 3 (moderado); nível 4-5 (pesado); 6-10 (severo).

A boa correlaçao entre o parâmetro % DBE 2, obtido da análise dos óleos por ESI(-) FT-ICR MS, e a razao H30/AC, obtida da análise dos óleos por CG-EM, também comprovou a degradaçao dos n-alquilciclohexanos, sendo esses os prováveis precursores dos ácidos monocíclicos (compostos de DBE 2 da classe O₂) formados devido à biodegradaçao.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho teve o apoio do Laboratório de Engenharia e Exploraçao de Petróleo da Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro (LENEP/UENF) e do Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). CENPES/Petrobras forneceram a infraestrutura necessária para conduzir a pesquisa, que foi financiada pelo PRH20-ANP, pela Capes e pela FAPERJ.

REFERENCIAS

1. Nascimento, L. R.; Rebouças, L. M. C.; Koike, L.; Reis, F. A. M.; Soldan, A. L.; Cerqueira, J.; Marsaioli, A. J.; Org. Geochem. 1999, 30, 1175.

2. De Lima, S. G.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 2005.

3. Alves, P. B.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 1997.

4. Da Silva, A. A.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 2008.

5. Mair, B. J.; Eberly, P. E.; Li, K.; Rossini, F. D.; Ind. Eng. Chem. 1958, 50, 115.

6. Hood, A.; Clerc, R. J.; O`Neal, M. J.; J. Inst. Petrol. 1959, 45, 168.

7. Johns, R. B.; Belsky, T.; McCarthy, E. D.; Burlingame, A. L.; Haug, P.; Schnoes, H. K.; Richter, W.; Calvin, M.; Geochim. Cosmochim. Acta 1966, 30, 1191.

8. Fowler, M. G.; Abolins, P.; Douglas, A. G.; Org. Geochem.1986, 10, 815.

9. Dong, J.; Vorkink, W. P.; Lee, M. L.; Geochim. Cosmochim. Acta 1993, 57, 837.

10. Hoffmann, C. F.; Foster, C. B.; Powell, T. G.; Summons, R. E.; Geochim. Cosmochim. Acta 1987, 51, 2681.

11. Summons, R. E.; Powell, T. G.; Boreham, C. J.; Geochim. Cosmochim. Acta 1988, 52, 1747.

12. Brocks, J. J.; Buick, R.; Summons, R. E.; Logan, G. A.; Geochim. Cosmochim. Acta 2003, 22, 4321.

13. Del Rio, J. C.; Garcia-Molla, J.; Gonzalez-Vila, F. J.; Martin, F.; Org. Geochem. 1994, 21, 897.

14. Fabianska, M. J.; Bzowska, G.; Matuszewska, A.; Racka, M.; Skret, U.; Chem. Erde 2003, 63, 63.

15. Kissin, Y. V.; Org. Geochem. 1990, 15, 575.

16. Rubinstein, I.; Strausz, O. P.; Geochim. Cosmochim. Acta 1979, 43, 1387.

17. Suzuki, K. I.; Saito, K.; Kawaguchi, A.; Okuda, S.; Komagata, K.; J. Gen. Appl. Microbiol. 1981, 27, 261.

18. Peters, K. E.; Moldowan, J. M.; Org. Geochem. 1991, 17, 47.

19. Wenger, L. M.; Davis, C. L.; Isaksen, G. H.; SPE Reservoir Eval. Eng. 2002, 5, 375.

20. Larter, S.; Huang, H.; Adams, J.; Bennet, B.; Jokanola, O.; Oldenburg, T. B. P.; Jones, M.; Head, I.; Riediger, C.; Fowler, M. G.; AAPG Bull. 2006, 90, 921.

21. Da Cruz, G. F.; Marsaioli, A. J.; Quim. Nova 2012, 35, 1628.

22. Head, I. M.; Jones, D. M.; Larter, S. R.; Nature 2003, 426, 344.

23. Head, I. M.; Larter, S. R.; Gray, N. D.; Sherry, A.; Adams, J. J.; Aitken, C. M.; Jones, D. M.; Rowan, A. K.; Huang, H.; Roling, W. F. M. Em Hydrocarbon Degradation in Petroleum Reservoirs; Timmis, K. N., eds.; Springer-Verlag: Berlin Heidelberg, 2010, cap. 54.

24. Peters, K. E.; Walters, C. C.; Moldowan, J. M.; The biomarker guide: Biomarkers and Isotopes in the Environment and Human History, 2^nd ed., Cambridge University Press: United Kingdom, 2005.

25. Angolini, C. F. F.; Capilla, R.; Marsaioli, A. J.; Energy Fuel 2015, 29, 4886.

26. Martins, L. L.; Angolini, C. F. F.; Da Cruz, G. F.; Marsaioli, A. J.; J. Braz. Chem. Soc. 2017, 28, 848.

27. Kim, S.; Stanford, L. A.; Rodgers, R. P.; Marshall, A. G.; Walters, C. C.; Qian, K.; Wenger, L. M.; Mankiewicz, P.; Org. Geochem. 2005, 36, 1117.

28. Vaz, B. G.; Silva, R. C.; Klitzke, C. F.; Simas, R. C.; Nascimento, H. D. L.; Garcia, D. F.; Eberlin, M. N.; Azevedo, D. A.; Energy Fuels 2013, 27, 1277.

29. Marshall, A. G.; Rodgers, R. P.; Acc. Chem. Res. 2004, 37, 53.

30. Agência Nacional do Petróleo, Boletim da Produçao de Petróleo e Gás Natural; Junho 2018, 70; PP 1-26.

31. Martins, L. L.; Pudenzi, M. A.; Da Cruz, G. F.; Nascimento, H. D. I.; Eberlin, M. N.; Energy Fuels 2017, 31, 6649.

32. Martins, L. L.; Franklin, G. C.; De Souza, E. S.; Da Cruz, G. F.; Quim. Nova 2014, 37, 1263.

33. Corilo, Y. E.; Vaz, B. G.; Simas, R. C.; Nascimento, H. D. L.; Klitzke, C. F.; Pereira, R. C. L.; Bastos, W. L.; Santos Neto, E. V.; Rodgers, R. P.; Eberlin, M. N.; Anal. Chem. 2010, 82, 3990.

34. Koopmans, M. P.; Larter, S. R.; Zhang, C.; Mei, B.; Wu, T.; Chen, Y.; AAPG Bull. 2002, 86, 1833.

35. Farah, M. A. Em O Petróleo; Brasil, N. I., Araújo, M. A. S., Sousa, E. C. M., eds.; LTC: Rio de Janeiro, 2014, cap. 2.

36. Bennet, B.; Fustic, M.; Farrimond, P.; Huang, H.; Larter, S. R.; Org. Geochem. 2006, 37, 787.

37. Meredith, W.; Kelland, S. J.; Jones, D. M.; Org. Geochem. 2000, 31, 1059.

38. Watson, J. S.; Jones, D. M.; Swannell, R. P. J.; Van Duin, A. C. T.; Org. Geochem. 2002, 33, 1153.