JBCS

INTRODUÇAO

Grande parte dos carboidratos identificados na natureza está sob a forma de polissacarídeos, que sao polímeros com padrao de massa molar variável entre médio (10⁴ g mol^-1) a alto (10⁶ g mol^-1). Essas moléculas, também conhecidas por glicanos, podem se diferenciar quanto à composiçao das unidades monossacarídicas que se repetem ao longo do polímero, nos tipos de ligaçoes glicosídicas, no tamanho e no grau de ramificaçao das cadeias.¹ Polissacarídeos microbianos se destacam por apresentar facilidades na sua obtençao. A possibilidade de cultivos sem a interferência de condiçoes climáticas e o uso de espaço físico relativamente pequeno tornam esses biopolímeros atraentes para aplicaçao. Pelo controle de parâmetros como pH, temperatura, taxa de aeraçao, velocidade de agitaçao, tempo de fermentaçao e composiçao do meio de cultivo, os polissacarídeos microbianos acabam apresentando menos heterogeneidade em suas propriedades físico-químicas.²

Entre esses micro-organismos destacam-se os fungos por disponibilizarem à indústria uma série de produtos com diferentes valores biotecnológicos.^3-6 O grande número de espécies fúngicas encontradas nos biomas contribui para esse fato. Eles podem produzir ácidos orgânicos, enzimas, reguladores do crescimento de plantas, alcaloides, pigmentos, toxinas, antibióticos e polissacarídeos.^7,8 Essas moléculas podem ser isoladas da biomassa e/ou da mistura de metabólitos secretados pelo fungo.

Nos últimos vinte anos, os polissacarídeos fúngicos têm se tornado alvo de pesquisas por apresentarem diferentes aplicaçoes farmacológicas, como glucanas na inibiçao da replicaçao de vírus⁹ e estimuladoras do sistema imunológico,¹⁰ heteropolissacarídeos de manose e arabinose como antioxidante¹¹ e fucomanogalactanas como anti-inflamatório.¹²

O fungo Colletotrichum gloeosporioides pertence ao grupo dos ascomicetos e atua como patógeno em várias espécies de plantas.¹³ Embora Park e colaboradores¹⁴ tenham isolado e descrito a propriedade dispersante de um exopolissacarídeo produzido por esse micro-organismo, a maior parte dos estudos referentes ao fungo está relacionada à sua fitopatologia, nao havendo na literatura nenhum relato sobre a composiçao química dos polissacarídeos presentes na biomassa do C. gloeosporioides. Considerando que essas macromoléculas constituem mais de 90% da parede celular, isolá-las, purificá-las e determinar as suas estruturas químicas poderá contribuir nao somente com as pesquisas que visam ao combate do fitopatógeno, mas também auxiliar na descoberta de novos agentes farmacológicos, que possam apresentar açoes imunomoduladora, anti-coagulante, anti-inflamatória, entre outras.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes

Os principais reagentes utilizados na pesquisa foram de grau analítico. Na cromatografia de filtraçao em gel à pressao normal, utilizou-se o gel Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech). Os padroes de dextrana (Leuconostoc mesenteroides) utilizados no HPSEC/RID foram adquiridos da SIGMA.

Métodos analíticos

Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol-ácido sulfúrico¹⁵ e a glucose foi utilizada como padrao. As proteínas foram determinadas pelo método de Bradford¹⁶ e soro albumina bovina foi utilizada como padrao.

Manutençao do micro-organismo

O fungo Colletotrichum gloeosporioides, isolado da Mimosa pudica, foi cedido pela Prof. Dra. Adriana Knob (UNICENTRO - Guarapuava, PR) e identificado pelo Prof. Dr. André Rodrigues (UNESP - Rio Claro, SP). O fungo foi mantido em meio BDA (batata-dextrose-ágar) inclinado, a 4 ºC, com repiques trimestrais.

Cultivo do micro-organismo e isolamento da biomassa fúngica

O C. gloeosporioides foi cultivado segundo Dominato.¹⁷ Os cultivos foram interrompidos utilizando um sistema de filtraçao a vácuo para separaçao da biomassa, que foi lavada, com água destilada, para remoçao do meio de cultivo e dos resíduos metabólicos secretados pelo micro-organismo, garantindo que nenhum açúcar residual, do processo de fermentaçao, contaminasse o material de estudo. Esse procedimento foi efetuado até que a água de lavagem resultasse negativa para o teste do fenol-ácido sulfúrico.¹⁵ Após este processo a biomassa foi liofilizada.

Extraçao dos polissacarídeos

A biomassa liofilizada (53 g) foi macerada e submetida a dois diferentes procedimentos extrativos sequenciais, como mostrado pelo fluxograma abaixo (Figura 1).

Figura 1. Fluxograma dos procedimentos para obtençao dos polissacarídeos fúngicos

Purificaçao dos polissacarídeos do extrato aquoso

Fracionamento dos polissacarídeos por tratamentos consecutivos de congelamento e descongelamento

O extrato aquoso (E_H2O-C) foi congelado e, entao, descongelado à temperatura ambiente. Este processo resultou em uma fraçao solúvel e outra insolúvel, separadas por centrifugaçao (4 ºC, 30 min, 4800 x g). Na fraçao insolúvel foi adicionada água destilada e, novamente, ambas as fraçoes solúvel e insolúvel foram congeladas e depois descongeladas à temperatura ambiente. Este processo foi repetido diversas vezes, até que as fraçoes solúveis nao apresentassem precipitados durante o descongelamento. As fraçoes aquosas contendo os polissacarídeos solúveis foram precipitadas pela adiçao de álcool etílico na proporçao de 1 volume da fraçao aquosa para 3 volumes de etanol. O precipitado etanólico, após remoçao do álcool e solubilizaçao em água, foi dialisado (em tubos de 12.000 MWCO) contra água corrente por 24 h. Após este período a fraçao retida no tubo de diálise, denominada PE_H2O-C, foi liofilizada e pesada (2,23 g). Dessa fraçao, foram retiradas alíquotas para dosagens de açúcar total e proteína, determinaçao da composiçao monossacarídica após hidrólise ácida total e verificaçao do grau de homogeneidade por cromatografia de permeaçao em gel.

Cromatografia de filtraçao em gel Sepharose CL-6B

A fraçao PE_H2O-C foi purificada por cromatografia de filtraçao em gel à pressao normal. O gel selecionado e as condiçoes da análise foram semelhantes ao trabalho efetuado por Alexandre e colaboradores.¹⁸

Análise da homogeneidade e da massa molecular aparente por HPSEC/RID

A homogeneidade dos polissacarídeos foi determinada por cromatografia de permeaçao em gel em cromatógrafo líquido de alta pressao da marca SHIMADZU, com detector de índice de refraçao diferencial modelo RID 10A, usando quatro colunas de gel permeaçao da marca WATERS, com limites de exclusao de 7 x 10⁶, 4 x 10⁵, 8 x 10⁴ e 5 x 10³ Da, dispostas em série. As condiçoes da análise foram: total de material aplicado 200 µg em 200 µL; fluxo de 0,6 mL min^-1 a 37 ºC; eluente: NaNO₃ 0,1 mol L^-1 contendo azida sódica 0,03%. A determinaçao das massas moleculares aparentes foi realizada utilizando-se uma curva de calibraçao com padroes de dextrana com massas moleculares variando de 9,4 x 10³ a 6,3 x 10⁵ Da.

Análise de monossacarídeos por HPAEC/PAD

Para análise dos monossacarídeos, alíquotas de 50 µg de açúcares totais, de cada fraçao, foram hidrolisadas com TFA 4 mol L^-1, 100 ºC, por 6 h. O ácido foi removido em evaporador rotativo, a baixa pressao, e solubilizado em água deionizada. Fraçoes contendo cerca de 1 µg de açúcares totais em 25 µL de água deionizada foram injetadas em HPAEC (Dionex DX500) equipado com um detector de amperometria pulsada (PAD). Os açúcares neutros foram separados isocraticamente, usando uma coluna analítica CarboPac PA1 equipada com guarda coluna PA1, ao fluxo de 1 mL min^-1. As condiçoes de eluiçao foram produzidas utilizando H₂O deionizada (eluente 1) e 7% NaOH 200 mmol L^-1 (eluente 2), resultando em uma fase móvel de NaOH 14 mmol L^-1, com corridas de 25 min de duraçao.

Análise dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C foram obtidos em espectrômetro Bruker, modelo Avance-DRX-400. O heteropolissacarídeo foi solubilizado em água deuterada 99%, em tubos de 5 mm de diâmetro e mantidos a 30 ºC durante a análise. Os deslocamentos químicos foram expressos em δ (ppm) relativos aos sinais de ¹³C e ¹H da acetona deuterada em δ 30,2 e 2,224, respectivamente. Os experimentos de ressonância magnética nuclear bidimensionais foram realizados usando um software Bruker e incluíram as correlaçoes homonuclear ¹H/¹H (COSY) e heteronucleares HSQC (heteronuclear single quantum coherence) e HMBC (heteronuclear multiple bond correlation).

Teste biológico: atividade citotóxica

A linhagem celular usada neste estudo foi a CHO-K1 (Células de Ovário de Hamster Chinês). As células foram cultivadas em 10 mL de DMEM/F10 suplementada com 10% de soro bovino fetal em frascos de 25 cm² e mantidas em incubadora sem CO₂ a 37 ºC.

Preparo das amostras para o teste de toxicidade

Para o teste a fraçao P_IV foi diluída em tampao fosfato-salino (PBS) na concentraçao de 1 mg mL^-1 e colocada em agitaçao constante overnight, em ambiente climatizado a 24 ±2 ºC. Para melhorar a homogeneidade, a amostra foi submetida ao banho de ultrassom por um período de uma hora e, em seguida, centrifugada (5 min, 5000 rpm). O sobrenadante foi esterilizado, em fluxo laminar, utilizando filtro de seringa estéril com porosidade de 0,22 µm. Para obter a concentraçao efetiva de açúcar no material que transpôs o filtro, uma alíquota do filtrado foi quantificada pelo método do fenol-ácido sulfúrico.¹⁵ A partir desta informaçao, diferentes concentraçoes do P_IV (25, 50, 100, 200 e 400 µg mL^-1) foram preparadas a partir da soluçao filtrada estéril e usadas para os testes de toxicidade.

Protocolo de exposiçao e ensaio de citotoxicidade

O potencial citotóxico das diferentes concentraçoes foi avaliado pelo método de reduçao do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), de acordo com Mosmann.¹⁹ As células foram semeadas numa placa transparente de 96 poços na densidade inicial de 2,0 x 10⁵ células por poço. As células foram incubadas com PBS e meio de cultura (1:1), controle negativo (CN) ou com diferentes concentraçoes da amostra (25, 50, 100, 200 e 400 µg mL^-1) e meio de cultura (1:1), pelos tempos experimentais de 24 e 48 h. Um controle positivo (CP) também foi preparado na concentraçao de 1% de Triton-X.

Após a finalizaçao dos tempos experimentais (24 e 48 h), o sobrenadante das culturas foi cuidadosamente removido, e entao, adicionado em cada poço 200 µL do MTT (0,5 mg mL^-1 de meio de cultura). As células foram incubadas novamente por mais 4 h. Após esse período, o sobrenadante resultante foi removido e 200 µL de DMSO foram adicionados. A absorbância correspondente foi determinada a 540 nm em leitor de microplacas. A absorbância obtida para o controle negativo foi considerada como 100% de viabilidade celular (VC). A VC das outras amostras foi determinada pela seguinte fórmula: VCE = [(AE - AB) / (ACN - AB)] x 100 onde: VCE = viabilidade celular das células expostas ao material; AE = Absorbância encontrada para células expostas ao material; ACN = Absorbância encontrada para as células do controle negativo; AB = Absorbância encontrada para o branco (poço apenas com DMSO).

Análises estatísticas

Os resultados foram comparados por análise paramétrica de variância (ANOVA), utilizando o método Student-Newman-Keuls ou o teste nao paramétrico de Kruskal-Wallis, de acordo com a distribuiçao dos dados (normalidade e homogeneidade de variância). Valores de p <0,05 foram considerados significativos e os resultados foram expressos em média ± SE (desvio padrao).

RESULTADOS E DISCUSSAO

Cultivo do micro-organismo e obtençao da biomassa

Para a obtençao dos polissacarídeos, os cultivos foram realizados de acordo com Dominato¹⁷ e as condiçoes utilizadas foram as que apresentaram maior rendimento de biomassa. Para este trabalho foram realizados 6 cultivos do C. gloeosporioides rendendo 53 gramas de biomassa com cor acinzentada, como podem ser vistos na Figura 1SD.

Extraçao dos polissacarídeos

Os processos de extraçao dos polissacarídeos da biomassa seguiram procedimentos já descritos na literatura.^18,20,21 A primeira extraçao efetuada com álcool etílico, removeu 16% de compostos hidrofóbicos e de pequena massa molecular, como oligossacarídeos livres, gerando um resíduo de 45 gramas, que após maceraçao foi submetido a extraçao aquosa a quente (4x), procedimento capaz de isolar polissacarídeos da parede celular como: β-glucanas, galactanas e mananas.^12,18,22-24 Os extratos aquosos foram reunidos e congelados (E_H2O-C). No descongelamento surgiu um precipitado, que se manteve insolúvel à temperatura ambiente. Dessa forma esse procedimento foi repetido até que nenhum precipitado se formasse no descongelamento; essa é uma técnica simples para separar polissacarídeos lineares dos ramificados. Segundo Ruthes,²⁵ polissacarídeos lineares ou com porcentagens menores de ramificaçao sao normalmente encontrados na fraçao insolúvel, enquanto os mais ramificados sao encontrados na fraçao solúvel de um extrato aquoso.

A fraçao solúvel foi precipitada com álcool etílico na proporçao de 1:3 e após diálise e liofilizaçao pesou 2,23 g (PE_H2O-C). As quantificaçoes de açúcar total e proteínas para PE_H2O-C resultaram em 94 e 6%, respectivamente, e a hidrólise ácida mostrou que a fraçao é constituída de 41% de glucose, proporçoes semelhantes de galactose (26%) e manose (25%), além de um pequeno percentual de ramnose (8%). A cromatografia de permeaçao em gel acoplada a um detector de índice refraçao (HPSEC/RID) apresentou 3 picos, indicando a presença de 3 ou mais polissacarídeos (Figura 2A) que se separaram, provavelmente, de acordo com a massa molecular. Essa análise é fundamental para indicar os caminhos futuros da investigaçao, uma vez que a caracterizaçao química solicita um material homogêneo.

Figura 2. (A) Perfil de eluiçao por HPSEC/RID do PE_H2O. (B) Cromatografia de filtraçao em gel Sepharose CL-6B do PE_H2O-C. Vol. coluna: 173 mL, Material aplicado: 8 mg; Fluxo: 1,0 mL/min; Vol. fraçao: 2,5 mL. (C) Perfil de eluiçao por HPSEC/RID das fraçoes obtidas na coluna Sepharose CL-6B a partir do PE_H2O

Purificaçao dos polissacarídeos

Considerando a diferença da massa molecular o procedimento escolhido para obter um material homogêneo foi a cromatografia de filtraçao em gel Sepharose CL-6B, a pressao normal. O perfil gráfico do experimento (Figura 2B) mostrou a presença de 5 picos, denominados P_I a P_V. A análise de alíquotas de cada pico por HPSEC/RID (Figura 2C) sinalizou que apenas P_IV e P_V apresentaram comportamento de macromoléculas homogêneas e a ausência de proteínas pelo método de Bradford¹⁶ indicou que essas fraçoes sao constituídas unicamente de carboidratos.

Para conhecer a composiçao monossacarídica das fraçoes consideradas puras alíquotas de P_IV e P_V foram separadas, hidrolisadas e analisadas por HPAEC/PAD e os resultados sao mostrados na Tabela 1.

Dos polissacarídeos obtidos no extrato aquoso do C. gloeosporioides, P_IV indica estar puro para experimentos de caracterizaçao química bem como em quantidade suficiente para os testes de atividade biológica. A massa molar aparente da fraçao P_IV foi estimada em 2,8 x 10⁴ g mol^-1, a partir da comparaçao com uma curva de calibraçao com padroes de dextrana. O valor do índice de polidispersividade (Mw/Mn) de 1,17 indica um polímero pouco polidisperso. A composiçao monossacarídica de P_IV (Tabela 1) revela que 95% da molécula é composta por galactose e glucose, podendo a manose (5%) fazer parte da estrutura polimérica ou ser o elo entre o polissacarídeo e as proteínas (ou glicoproteínas) presentes na parede celular.²⁶

Caracterizaçao química do heteropolissacarídeo (P_IV) por RMN

Análises de ressonância magnética nuclear de ¹H e ¹³C mono e bidimensionais foram realizadas para caracterizar a estrutura de P_IV. O espectro de ¹H (Figura 3A) mostrou três sinais anoméricos intensos em 5,39, 5,25 e 5,04 ppm. ¹H anoméricos com menor intensidade também foram observados. No espectro de RMN de ¹³C (Figura 3B) foram encontrados três sinais mais intensos em 108,3, 107,4 e 99,8 ppm e outros menos intensos entre 103,0 a 98,7 ppm. De acordo com a literatura e os valores de deslocamentos químicos, os sinais em δ 108,3 e 107,4 ppm correspondem a unidades β-D-galactofuranosídicas 1→5 e 1→6 substituídas, respectivamente,²⁷ e 99,8 ppm foi atribuído às unidades α-D-glucopiranosídicas.²¹

Figura 3. Espectros de RMN de ₁H (A), RMN de ₁₃C (B) e regiao do RMN 13C-DEPT (C) do heteropolissacarídeo (P_IV) obtido por cromatografia de filtraçao em gel Sepharose CL-6B do extrato aquoso do C. gloeosporioides

De acordo com o espectro de RMN de ¹³C-DEPT (Figura 3C), as unidades β-D-galactofuranosídicas 1→6 substituídas apresentam um sinal intenso, invertido, em 69,8 ppm correspondendo ao C-6 envolvido na ligaçao glicosídica. As unidades β-D-galactofuranosídicas envolvidas em ligaçao 1→5 mostram o C-6 livre, também invertido, em 60,8 ppm. O outro sinal invertido no DEPT, referente ao carbono primário das unidades α-D-glucopiranosídicas, C-6, pode ser visto em 61,5 ppm. Segundo a literatura muitos polissacarídeos da parede celular fúngica, solúveis em água, sao constituídos por cadeias β-galactofuranosídicas de diferentes comprimentos e tipos de ligaçao,^21,28 com ramificaçoes de glucose.

A partir do espectro bidimensional heteronuclear HSQC (Figura 2S) foram correlacionados os ¹H anoméricos 5,04 e 5,25 ppm aos seus respectivos carbonos anoméricos 108,3 e 107,4 ppm das unidades β-D-galactofuranosídicas 1→5 e 1→6, substituídas e o sinal 5,39 ppm ao 99,8 ppm das unidades α-D-glucopiranosídicas.

Do espectro bidimensional homonuclear COSY foi correlacionado o sinal de H-1 (5,25 ppm) aos respectivos H-2 (4,16 ppm) (Figura 3SA) e H-3 (3,71 ppm) (Figura 3SB) das unidades β-D-galactofuranosídicas ligadas em 6. Com essas atribuiçoes, os deslocamentos químicos para C-2 (81,8 ppm) e C-3 (80,3 ppm), da mesma unidade, puderam ser obtidos no HSQC (Figura 2S). No estudo do espectro HMBC foi possível correlacionar o C-3 dessa unidade (80,3 ppm) ao H-1 da unidade glucopiranosídica (5,39 ppm), sugerindo substituiçao em O-3 por α-D-glucopiranose (Figura 3SC). Deve-se observar a ausência de um sinal próximo a 88 ppm, característico de unidades galactofuranosídicas 2-O substituídas, indicando que esse tipo de substituiçao, comum em polissacarídeos e oligossacarídeos de parede celular de fungos, inexiste nessa estrutura.^21,28

Também no espectro HMBC (Figura 3SC) sao visualizados correlaçao entre o C-6 (69,8 ppm) da unidade β-D-galactofuranosídica 6-O ligado ao H-1 (5,04 ppm) da unidade β-D-galactofuranosídica 5-O ligada, indicando as sequências abaixo (I e II) como fazendo parte da estrutura do heteropolissacarídeo.

Avaliaçao da citotoxicidade

Estudos do potencial citotóxico in vitro de extratos de fermentaçao,²⁹ de extratos de micélio³⁰ e de metabólitos liberados no meio de cultivo por fungos do gênero Colletotrichum^31,32 sao encontrados na literatura científica, porém o potencial citotóxico de polissacarídeos extraídos da biomassa Colletotrichum gloeosporioides, em linhagens celulares, ainda nao foi relatado. Dessa forma, este é o primeiro estudo que avalia a citotoxicidade in vitro de um polissacarídeo extraído da biomassa deste micro-organismo.

Nesse estudo, os resultados obtidos pelo ensaio do MTT indicam que a viabilidade das células CHO-K1, expostas às diferentes concentraçoes do heteropolissacarídeo, nao apresentaram diferenças significativas quando comparadas com a viabilidade do controle negativo (CN), nos tempos experimentais de 24 e 48 h (Figura 4). Kim e colaboradores³³ avaliaram a citotoxicidade de endopolissacarídeos extraído do micélio do fungo Inonotus obliquus e observaram que a maioria das células tumorais e das células normais testadas nao tiveram a sua viabilidade celular afetada, mesmo quando expostas a altas concentraçoes do polissacarídeo. Galinari e colaboradores³⁴ mostraram que fraçoes de polissarídeos extraídos de parede celular da levedura Kluyveromyces marxianus CCT773 inibiram a proliferaçao da célula tumoral Hep-G2, mas nao foram citotóxicas para células tumorais HeLa e apresentaram pouca citotoxicidade para a linhagem celular normal 3T3.

Figura 4. Viabilidade celular (%) das linhagens CHO-K1 expostas a diferentes concentraçoes do polissacarídeo PIV, somente ao meio de cultura (CN- linha tracejada) ou ao Triton-X (CP) por 24 e 48 horas. As linhas horizontais representam as médias e as linhas verticais o desvio padrao. * indica diferença significativa comparado com CN, que foi considerado 100% (P <0.05)

A ausência de citotoxicidade apresentada pelo heteropolissacarídeo do C. gloeosporioides nas células CHO-K1, que é uma linhagem normal, pode ser interpretada como positiva, abrindo novas perspectivas para futuros estudos toxicológicos tanto em outras linhagens celulares normais, quanto em células cancerosas, avaliando seu potencial como agente antitumoral. A ausência de citotoxicidade dos compostos em células normais é uma característica fundamental, mas difícil de ser encontrada. Isso tem se tornado um grande desafio para a medicina na busca por novos fármacos antitumorais.

CONCLUSAO

Condiçoes de cultivo pré-estabelecidas permitiram o crescimento do fungo ascomiceto Colletotrichum gloeosporioides favorecendo a produçao de biomassa que, após procedimentos extrativos, resultou em uma fraçao rica em polissacarídeos. Técnicas de purificaçao por congelamento/descongelamento e cromatografia de filtraçao em gel Sepharose CL-6B permitiram o isolamento da fraçao P_IV, considerada homogênea por HPSEC/RID, com massa molar de 2,8 x 10⁴ g mol^-1, Mw/Mn 1,17, e 100% de açúcar total com galactose (61%), glucose (34%) e manose (5%) como seus constituintes monossacarídicos. Análises de ressonância magnética nuclear de ¹H e ¹³C, mono e bidimensionais, forneceram espectros que permitem concluir que P_IV é um heteropolissacarídeo com a cadeia principal formada por unidades β-D-galactofuranosídicas com ligaçoes 1→5 e ligaçoes 1→6, sendo algumas dessa última unidade substituída em O-3 por resíduos α-D-glucopiranosídicos. Ensaios de citotoxicidade (MTT) indicaram que a viabilidade das células CHO-K1, expostas às diferentes concentraçoes do heteropolissacarídeo, nao apresentaram diferenças significativas quando comparadas com a viabilidade do controle negativo (CN), nos tempos experimentais de 24 e 48 h. Essa resposta sinaliza a possibilidade da continuidade dos testes de citotoxicidade tanto em outras linhagens de células normais como em células tumorais.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Estao disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre, fotos do cultivo do fungo Colletotrichum gloeosporioides e de sua biomassa (Figura 1S), espectro de RMN bidimensional HSQC (Figura 2S) e das regioes selecionadas dos espectros de RMN bidimensional homonuclear (COSY) (Figuras 3SA e 3SB) e heteronuclear (HMBC) do heteropolissacarídeo P_IV (Figura 3SC).

AGRADECIMENTOS

A CAPES pela bolsa de estudo da doutoranda S. M. A. Alexandre.

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