JBCS

INTRODUÇAO

Os primeiros contatos entre seres humanos e substâncias psicoativas ocorreram através do consumo de plantas. A partir de entao, foram isolados alguns metabólitos secundários de origem botânica, como: morfina, cocaína e efedrina. Porém, foi com o aparecimento das anfetaminas que se deu início às primeiras sínteses de substâncias psicoativas inspiradas em produtos naturais. Com os avanços das drogas sintéticas, houve entao a popularizaçao das designer drugs.¹

Designer drugs é o termo utilizado para denominar substâncias sintéticas com efeitos similares aos das drogas ilícitas (substâncias de uso proibido). Essas drogas sao produzidas através de ligeiras modificaçoes nas estruturas químicas de substâncias já existentes com o intuito de fraudar a legislaçao atual em vigor.² As designer drugs têm como característica principal o fato de terem sido modificadas em laboratórios clandestinos, a fim de aumentar, diminuir ou criar efeitos psicoativos.³ As mais consumidas sao as derivadas dos grupos anfetamínicos (drogas estimulantes), tais como 3,4-metileno-dioxi-anfetamina (MDA) e 3,4-metileno-dioxi-metanfetamina (MDMA).⁴

A correta identificaçao desta classe de drogas em matrizes biológicas tem sido um grande desafio analítico devido à versatilidade e rapidez pela qual estas moléculas sao modificadas. Portanto, faz-se necessário abordagens analíticas diretas e rápidas para a identificaçao inequívoca das designer drugs. Dentre estas abordagens analíticas, a espectrometria de massas (MS - do inglês, mass spectrometry) vem se destacando por ser uma técnica capaz de detectar, identificar e quantificar moléculas de diversos tamanhos, composiçoes em diferentes matrizes.⁵

Com o surgimento da espectrometria de massas ambiente (AMS),⁶ em 2004, principalmente com a introduçao das técnicas de ionizaçao Direct Analysis in Real Time (DART) e Desorption Electrospray Ionization (DESI), tem-se, entao, um novo, revolucionário e simples modo de gerar íons em espectrometria de massas.⁷ As técnicas de AMS tem como característica comum a geraçao de íons em condiçoes ambientes e a ionizaçao do analito que ocorre diretamente do seu "ambiente natural", ou seja, na própria matriz ou com o uso de superfícies auxiliares.^5,8 Assim, a AMS provocou uma nova revoluçao na espectrometria de massas, tornando-a mais rápida e universalizando seu campo de atuaçao, principalmente levando-a ao "mundo real".⁹

Dentre os diversos métodos de ionizaçao ambiente de espectrometria de massas, um de maior simplicidade é o Paper Spray Ionization (PSI).^10-12 O PSI foi desenvolvido por Liu et al.¹³ A ionizaçao ocorre adicionando a soluçao da amostra, previamente acidificada ou basificada, em um pedaço de papel triangular, e com a aplicaçao de uma elevada diferença de potencial (~ 4 kV) no papel, tem-se a formaçao de um spray. Este spray é composto por gotículas contendo íons e o solvente, que por um processo de dessolvataçao tem-se a geraçao de íons em fase gasosa, por um processo similar ao electrospray (ESI), como ilustrado pela Figura 1.

Figura 1. Esquema geral do método de ionizaçao paper spray ionization - PSI

O PSI tem possibilitado a análise de amostras sem o pré-tratamento prévio ou com mínimo preparo de amostra. A sua faixa de aplicaçao é muito ampla. Inúmeros trabalhos têm demonstrado aplicabilidade do PSI, principalmente em aplicaçoes clínicas, incluindo a triagem neonatal,¹⁴ monitoramento de drogas terapêuticas,^15,16 medicina personalizada^17,18 e a análise de fluidos biológicos, como sangue,^19,20 urina^6,21 e saliva.^22,23 Contudo, toda técnica analítica possui uma limitaçao inerente, e o PSI apresenta algumas quando aplicado na análise de matrizes complexas (e.g. sangue, urina e saliva), como a supressao iônica, sensibilidade baixa ao nível de traços e faixa dinâmica estreita. Estas limitaçoes tem sido a força motriz para o desenvolvimento de novas abordagens que integrem de forma eficiente etapas de clean up, extraçao/enriquecimento do analito e ionizaçao. Neste trabalho, apresentamos uma abordagem para melhorar a eficiência do PSI, frente a análise de matrizes complexas, que consiste em recobrir o papel, substrato do PSI, com um polímero molecularmente impresso (MIP - do inglês, molecularly imprinted polymer).

Os MIPs sao materiais sintéticos que possuem sítios de reconhecimento capazes de religar um composto-alvo especificamente em detrimento de outros compostos estreitamente relacionados. Esses materiais sao sintetizados via polimerizaçao de monômeros funcionais e de reticulaçao em torno de uma molécula modelo, gerando um polímero em rede tridimensional altamente reticulado.²⁴ Os monômeros sao escolhidos de acordo com as suas capacidades de interagir com os grupos funcionais da molécula modelo. Quando ocorre a polimerizaçao, a molécula modelo é extraída, gerando os sítios de ligaçao com a forma, tamanho e funcionalidade complementar do composto-alvo (Figura 2). Os MIPs sao materiais estáveis, robustos e resistentes a uma ampla gama de pH, solventes e temperatura, além de suas sínteses serem relativamente baratas e de fácil realizaçao.²⁵

Figura 2. Esquema geral da síntese do MIP

O presente trabalho trata da combinaçao do MIP com o PSI-MS com o objetivo de se obter um método de análise seletivo (característica do MIP) e que forneça respostas analíticas em um curto espaço de tempo (característica do PSI-MS) para a detecçao e quantificaçao de designer drugs em fluído biológico. Como designer drugs, foram utilizadas MDMA e MDA, e como fluído biológico, foi utilizado saliva sintética.

PARTE EXPERIMENTAL

Preparo da saliva sintética

A saliva sintética foi preparada de acordo com o protocolo proposto por Alshali et al.²⁶ Foram dissolvidas 0,25 g de hidroxietil celulose em 400 mL de água ultrapurificada e a soluçao resultante foi submetida à agitaçao por 24 h. Logo depois, foram adicionados: cloreto de potássio (0,625 g L^-1), cloreto de cálcio dihidratado (0,166 g L^-1), fosfato de potássio monobásico (0,326 g L^-1), cloreto de magnésio hexahidratado (0,059 g L^-1) e albumina sérica bovina (0,00235 g L^-1). Após dissolver todos os reagentes, o pH foi ajustado para 6,75 utilizando hidróxido de potássio e o volume foi completado para 500 mL.

Síntese da membrana MIP

A síntese da membrana MIP foi realizada a partir de uma adaptaçao da metodologia descrita por Sergeyeva et al.²⁷ As membranas de celulose foram lavadas em um Soxlet com 400 mL de metanol por 4 h e secas à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram submersas em uma soluçao de 150 mmol L^-1 de benzofenona em acetona por 5 min e secas à temperatura ambiente. Foram, entao, submersas em uma soluçao aquosa contendo 50 mmol L^-1 de ácido metacrílico, 150 mmol L^-1 de etileno dimetacrilato, 10 mmol L^-1 de MDA ou MDMA. Posteriormente, foram expostas à radiaçao UV (ultravioleta) por 15 min utilizando um comprimento de onda de 254 nm. Por fim, as membranas foram lavadas novamente no sistema de Soxlet com 400 mL de metanol por 4 h para retirada do molde. Após secas, as membranas foram pesadas com o intuito de avaliar a eficiência de remoçao do molde. Seguindo a mesma metodologia, foi sintetizado um polímero nao-impresso (NIP), porém, nao contendo a molécula modelo, para agir como um controle (através da comparaçao entre MIP e NIP) na verificaçao da seletividade do MIP para as moléculas desejadas. As membranas (MIP e NIP) foram cortadas em formato triangular equilátero com altura de 1 cm.

MIP-PSI-MS

As membranas poliméricas foram imersas por 5 min em 1 mL de soluçoes de diferentes concentraçoes de MDA ou MDMA (amostras fornecidas pela Polícia Civil do Estado do Espírito Santo) em saliva sintética. Em seguida, foram lavadas com água deionizada para remoçao da saliva e secadas por 15 min à temperatura ambiente. Para a análise de PSI-MS (Figura 3), a membrana polimérica foi presa por sua base em um grampo metálico onde uma alta voltagem foi aplicada. Os parâmetros experimentais foram baseados em trabalhos anteriores desenvolvidos no nosso grupo utilizando PSI-MS.^8,10-12 A membrana foi posicionada a uma distância de aproximadamente 4 mm da entrada do espectrômetro de massas. Utilizaram-se 10 µL de metanol com 0,1% de ácido fórmico para análises no modo positivo. Para obtençao dos espectros de massas, foi utilizado um espectrômetro de massas Thermo Scientific Ion trap LCQ Fleet. Foram utilizados os seguintes parâmetros instrumentais: voltagem do spray: 3,5 kV; temperatura do capilar: 275 °C; tensao do capilar: 35 V; tube lens: 50 V; energia de colisao: 23 eV.

Figura 3. Sistema MIP-PSI homemade acoplado ao espectrômetro de massas LCQ Fleet

Validaçao analítica

O método MIP-PSI-MS foi validado parcialmente de acordo com a RDC nº 166 de 24 de julho de 2017 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa)²⁸ que tem por objetivo principal regular e controlar a área sanitária de serviços e produtos, incluindo a validaçao para métodos analíticos. Os critérios analisados foram: linearidade, limites de detecçao (LD) e quantificaçao (LQ), precisao, exatidao, recuperaçao e sensibilidade.

A linearidade é a capacidade do método em fornecer resultados proporcionais à concentraçao do analíto em um intervalo determinado.²⁹ A forma comum de identificar a linearidade é analisar o coeficiente de correlaçao (R) das curvas analíticas e, de acordo com a Anvisa, o valor do R deve ser maior que 0,990. Neste trabalho, a curva analítica foi construída monitorando o aumento da intensidade do fragmento mais intenso do MDMA e MDA, o m/z 163 para ambos. O íon m/z 163 é resultante de um experimento de MS² nas moléculas de interesse. Para a construçao das curvas, o MDMA e MDA foram dissolvidos em saliva sintética para obter as seguintes concentraçoes: 25, 90, 180, 270, 360, 410 e 500 µg L^-1.

O limite de detecçao (LD) é a menor quantidade detectável porém nao quantificável do analito. Já o limite de quantificaçao (LQ) é a menor quantidade de analito quantificável de forma precisa e exata.³⁰ O LD e o LQ foram determinados baseados em 3 e 10 vezes a razao sinal-ruído, respectivamente.

As curvas de correlaçao para avaliar a capacidade do método em quantificar analitos em concentraçoes próximas a valores reais foram construídas utilizando as seguintes concentraçoes: 45, 90, 140, 180, 230, 270, 320, 360, 380, 410, 450, 500 µg L^-1 .

A exatidao é o quao próximo o valor dos resultados obtidos pelo método se aproxima dos valores verdadeiros. A precisao é a proximidade dos resultados em várias medidas de uma mesma amostra.³⁰ A exatidao e precisao foram realizadas intra (n = 5) e inter-dia (n = 3) utilizando as seguintes concentraçoes: 90, 270 e 500 µg L^-1, respectivas concentraçoes baixa, média e alta da curva de calibraçao. A exatidao foi obtida pela seguinte equaçao:

em que Xi é a concentraçao analisada e Xv é a concentraçao nominal. A precisao foi determinada através da seguinte equaçao:

sendo S o desvio padrao.

A recuperaçao está diretamente ligada à exatidao, pois mostra a quantidade de analito recuperada na análise de acordo com a quantidade de analito real na amostra.²⁹ A recuperaçao foi realizada com as mesmas concentraçoes utilizadas nos testes de exatidao e precisao, e foi calculada através da seguinte equaçao:

em que Xo é concentraçao original do analito na amostra.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Análise de MDMA e MDA em saliva

A geometria triangular do papel foi largamente exposta na literatura.^13,14 Geometrias distintas no papel provocam variabilidade na intensidade do campo elétrico e na corrente aplicada.¹⁴ A forma geométrica mais adequada é a triangular.

A Figura 4 ilustra os espectros de massas obtidos por MIP-PSI-MS da saliva artificial dopada com 500 µg L^-1 de MDMA (m/z 194) e MDA (m/z 180). É possível notar a alta intensidade dos íons protonados de ambos analitos. A ausência de íons intensos oriundos da saliva, demonstra a eficácia do MIP-PSI-MS em evitar o efeito de supressao iônica comum em amostras complexas.

A Figura 5 ilustra o espectro de massas obtido por MIP-PSI-MS da saliva sintética, branco, utilizando a membrana MIP-MDMA (Figura 5a) e MIP-MDA (Figura 5b). Note que os íons [M + H]⁺ de m/z 194 e m/z 180 referentes ao MDMA e MDA mostrados anteriormente (Figura 4) nao foram detectados. Neste estudo, priorizou o uso da molécula alvo como molde. A Figura 5 mostra que processo de lavagem para retirada do molde foi eficiente. Andersson et al.³¹ propôs o uso de uma molécula análoga ao analito alvo como template, a fim de se evitar falsos positivos caso a etapa de lavagem nao seja eficiente. Entretanto, a principal desvantagem do uso de moldes análogos é a capacidade de reconhecimento molecular menor quando comparadas aos que usam a molécula alvo como molde.³² O uso do mesmo alvo como template, neste trabalho, nao interferiu na análise do analito de interesse.

Figura 4. Espectro de massas obtido por MIP-PSI(+)-MS com 500 µg L^-1 de MDMA (A) e MDA (B) em saliva artificial

Figura 5. Espectro de massas obtido por MIP-PSI(+)-MS com molde de MDMA(A) e MDA (B) sem adiçao de MDMA e MDA na saliva sintética

Teste de seletividade

A capacidade de sequestrar os analitos alvos dos MIPs foi avaliada comparando as intensidades obtidas com as membranas MIP e NIP. A Figura 6a ilustra um gráfico de barras que demonstra as intensidades dos íons protonados [M + H]⁺ do MDMA (m/z 194), mCPP (m/z 197), DOB (m/z 275) e LSD (m/z 324) utilizando as membranas MIP-MDMA e NIP. Ao verificar as análises de NIP e MIP com o mCPP, DOB e LSD, observa-se uma pequena diferença entre as intensidades dos sinais. Todavia, para as análises com o MDMA, a intensidade do sinal obtida por MIP-MDMA foi muito maior do que a obtida por NIP. Isso demonstra que a membrana MIP-MDMA possui uma alta seletividade para a molécula de MDMA, em detrimento das moléculas de mCPP, DOB e LSD. Esse resultado era esperado, uma vez que o MDMA foi utilizado como template para a síntese do MIP. A Figura 6b demonstra a mesma abordagem, porém, utilizando a membrana MIP-MDA. A maior intensidade é encontrada na análise do composto MDA, demonstrando a seletividade da membrana para esse composto.

Figura 6. Comparativo das intensidades absolutas do íon [M + H]⁺ do MDMA e MDA utilizando o MIP e NIP-PSI-MS

Os espectros de massas de dissociaçao do MDMA e MDA sao mostrados na Figura 7. Note que na Figura 7(A), espectro de MIP-PSI-MS/MS do MDMA, a principal perda é evidenciada pela transiçao m/z 194 → 163, referente à perda de um grupo metilamina (NH2CH3). Na Figura 7(B), a transiçao m/z 163 → 135, decorrente de um experimento de MS³, é referente à perda de etileno (CH2CH2); a transiçao m/z 163 → 133 é referente à perda de formaldeído (CH2O), devido a um rearranjo no grupo metilenodioxi; e a transiçao m/z 135 → 105 é devido à outra perda de um grupo formaldeído (CH2O). Na Figura 7(C) é mostrado o espectro de PSI-MS/MS do MDA. A perda mais importante é evidenciada pela transiçao m/z 180 → 163, referente à perda de amônia (NH3), comum em aminas primárias. Na Figura 7(D), a transiçao m/z 163 → 135, decorrente de um experimento de MS³, é referente à perda de etileno (CH2CH2); a transiçao m/z 163 → 133 é devido à perda de formaldeído (CH2O), em virtude de um rearranjo no grupo metilenodioxi; e a transiçao m/z 135 → 105 também é referente à outra perda de formaldeído (CH2O). Essas perdas também sao mostradas por Schepens et al.,³³ que fizeram uma rápida quantificaçao de drogas de abuso em fluido oral utilizando a MS.

Figura 7. Espectro de MIP-PSI(+)-MS/MS do MDMA (A) e (B) e MDA (C) e (D) em saliva sintética

Validaçao analítica

Para verificar a performance analítica da técnica, curvas analíticas (Figura 8) foram construídas com diferentes concentraçoes de MDMA e MDA em saliva sintética através do monitoramento das transiçoes m/z 194 → 163 (MDMA) e m/z 180 → 163 (MDA). O método MIP-PSI-MS apresentou linearidades com o R > 0,99 para ambas as designer drugs, em conformidade com as diretrizes da Anvisa. Os valores de LD e LQ obtidos para o MDMA foram de 1,11 µg L^-1 e 18,73 µg L^-1, respectivamente. Já para o MDA, o LD e LQ foram 3,42 µg L^-1 e 21,66 µg L^-1, respectivamente. Schepens et al.³³ mostraram valores próximos de LD e LQ para o MDMA (ambos< 5 µg L^-1)e para o MDA (10 µg L^-1 e 25 µg L^-1) com o método de Cromatografia Liquida acoplada à MS (LC-MS) para rápida confirmaçao e quantificaçao de drogas de abuso em saliva sintética. Ishikawa et al.³⁴ também mostraram valores próximos de LD e LQ para o MDA, 2,5 µg L^-1 e 10 µg L^-1, e para o MDMA, 1 µg L^-1 e 10 µg L^-1, em fluídos biológicos utilizando Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (CG-MS). Portanto, o método de MIP-PSI-MS atingiu resultados próximos aos de técnicas clássicas utilizadas para análises de drogas.

Figura 8. Curva analítica, linearidade (R), LD e LQ obtidos por MIP-PSI(+)-MS para MDMA (A) e MDA (B)

A Figura 9 demonstra curvas analíticas que correlacionam concentraçoes reais (quantidades das drogas concentradas na saliva) com concentraçoes obtidas por MIP-PSI-MS para as drogas MDA e MDMA. Esse teste demonstra a capacidade da técnica em quantificar compostos em valores próximos aos reais. De acordo com a Figura 9a (MDMA) e Figura 9b (MDA), é possível notar correlaçoes entre as concentraçoes reais e medidas para ambas as drogas, apresentando valores de R maiores que 0,99. Desse modo, o método MIP-PSI-MS apresenta um alto grau de confiabilidade para determinaçao das drogas MDMA e MDA em concentraçoes próximas do valor existente na amostra, com um potencial uso para quantificaçao de designer drugs em amostras reais.

Figura 9. Curva analítica que demonstra a correlaçao entre concentraçoes reais e medidas em saliva utilizando MIP-PSI(+)-MS para o MDMA (A) e MDA (B)

A Tabela 1 retrata os resultados de precisao, exatidao e recuperaçao do MIP-PSI-MS para o MDMA. Os valores de precisao intra-dia variaram entre 0,66 e 1,52%, e inter-dia entre 0,86 e 1,35%. Já os valores de exatidao intra-dia variaram de 0,51 a 3,92%, e inter-dia de 0,84 a 3,84%. A recuperaçao esteve próxima de 100%.

Os valores de precisao, exatidao e recuperaçao para o MDA estao dispostos na Tabela 2. Os resultados de precisao intra-dia variaram de 0,49 a 1,53%, e inter-dia de 0,96 a 2,26%. Os valores de exatidao intra-dia variaram entre 0,35 e 1,98%, e inter-dia entre 0,35 e 1,98%. O método apresentou valores de recuperaçao próximos de 100%. De acordo com a RDC nº166 de 24 de julho de 2017 da ANVISA,¹⁵ valores de precisao e exatidao até 20% sao aceitos para amostras biológicas. Os valores de recuperaçao próximos de 100%, como mostrado aqui, evidencia uma maior eficiência do método MIP-PSI-MS perante ao método de determinaçao de drogas de abuso em biofilme dental, utilizando LC-MS/MS, descrito por Henkel et al.³⁵ O parâmetro da recuperaçao encontra-se dentro do intervalo estimado pela Anvisa, de 80-120%, que é o indicado desde que o método seja preciso e exato.

CONCLUSAO

Neste trabalho foram demonstradas análises de designer drugs em saliva utilizando MIP-PSI-MS, um método que combina a síntese do MIP sobre uma membrana de celulose que é utilizada como substrato em análises de PSI-MS. O método proposto apresenta a vantagem de fornecer resultados de forma rápida, uma vez que o MIP pode ser produzido em aproximadamente 4 h e a análise por PSI-MS pode ser realizada em segundos. Além disso, o MIP-PSI-MS nao requer etapas laboriosas de preparo de amostras para fornecer resultados analíticos adequados. Estas características fazem do MIP-PSI-MS um método com potencial aplicaçao em laboratórios de perícia, devido à necessidade de detecçao e quantificaçao de designer drugs de forma rápida e precisa. A performance analítica do MIP-PSI-MS foi avaliada através da análise das drogas MDMA e MDA em saliva sintética. O MIP-PSI-MS apresentou uma elevada seletividade para o MDMA e MDA, apresentando íons mais intensos para ambas as drogas em relaçao a analitos com estruturas moleculares diferentes. A linearidade das curvas analíticas foram determinadas com R > 0,99. Valores de LD e LQ obtidos para o MDMA foram de 1,11 µg L^-1 e 18,73 µg L^-1, respectivamente, e para o MDA, 3,42 µg L^-1 e 21,66 µg L^-1, respectivamente, em equivalência a outros métodos de análises de drogas clássicas já existentes. Os valores de precisao e exatidao foram determinados abaixo de 4%, e as recuperaçoes próximas de 100%. Estes resultados se encontram dentro dos parâmetros de validaçao de métodos analíticos descritos pela RDC nº166 de 24 de julho de 2017 da Anvisa.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, à CAPES e à FAPEG, pelo apoio e suporte financeiro.

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