JBCS

INTRODUÇÃO

O docetaxel (Taxotere^®) é um derivado semi-sintético do teixo Europeu Taxus Baccata, sendo utilizado para tratamento de uma variedade de tumores, particularmente tumores de mama, próstata, ovário, pulmão, adenocarcinoma gástrico, câncer gástrico e cabeça e pescoço.^1,2 Seu uso foi aprovado em 1996 pelo Food and Drug Administration (FDA) e vem demonstrando benefícios aos pacientes, como aumento da expectativa de vida e redução da progressão do tumor, apresentando atividade antitumoral duas vezes mais potente que o seu precursor placlitaxel.³

A dose clinicamente recomendada do docetaxel (DTX) varia entre 60 a 100 mg/m² de acordo com o tipo de tumor, sendo atualmente baseada na superfície de área corporal do paciente, administrada por infusão intravenosa 1 hora a cada 3 semanas.^1,4-7 Apesar do benefício terapêutico, os efeitos hematológicos como neutropenia, neutropenia febril, anemia e trombocitopenia são fatores limitantes na dose do fármaco, levando a interrupção da quimioterapia e consequentemente redução na taxa de cura.⁵

O metabolismo do DTX é mediado pelas enzimas hepáticas CYP3A4 e CYP3A5 do citocromo P450, que através de uma reação de oxidação na cadeia lateral de terc-butil-propionato forma os quatro metabólitos M2, M4 e diastereoisômeros M1 e M3, com atividade citotóxica reduzida.^3,5,8 A entrada do DTX ao hepatócitos é dada através do transportador de influxo SLCO1B3, e sua eliminação ocorre através de proteínas transportadoras de efluxo, ABCB1 (glicoproteína-P), ABCC2 e a proteína de resistência multi-droga 2 (MRP2).^2,9-11 Variações na resposta terapêutica do DTX podem estar relacionadas a polimorfismos nos genes CYP3A4, CYP3A5, ABCC2, ABCB1, SLCO1B3 e CYP1B1, levando à redução do metabolismo do fármaco e à toxicidade.^2,8,12,13

Considerando que o DTX possui uma farmacocinética variável e uma gama de efeitos adversos o interesse pelo seu monitoramento terapêutico de fármacos (MTF) tem emergido na oncologia. A área de superfície corporal (ASC) é um parâmetro indicativo da exposição sistêmica ao DTX e tem sido sugerida como um preditor de neutropenia nos pacientes tratados com o fármaco.^14-18 No entanto, diferentemente de outros quimioterápicos em que a ASC já está bem estabelecida, para o DTX ainda não há um valor consensual, tendo sido relatado que a melhor resposta terapêutica está associada com valores alvo de ASC entre 2,5 a 3,7 e 4,9 mg.h/L para doses de 50, 75 e 100 mg/m² respectivamente.¹⁸

Ensaios para determinação do DTX têm sido descritos na literatura, sendo que a utilização do LC-MS/MS para determinação de fármacos em fluidos biológicos é especialmente atrativa, devido a sua alta sensibilidade e seletividade.^19-21 Em vista disso, o objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar um método simples e rápido para a determinação do DTX e metabólitos M1 e M3 em plasma por LC-MS/MS. O método foi aplicado na avaliação da exposição ao DTX em um grupo de pacientes oncológicos no Sul do Brasil, a partir da estimativa de sua ASC em um modelo de amostragem limitado.¹⁵ Além disso, a dosagem dos metabólitos permite avaliar as razões de metabolismo para CYP3A, podendo ser utilizada como uma alternativa para a fenotipagem dessa via. Vale ressaltar que este é o primeiro estudo com aplicação clínica no monitoramento dos níveis de DTX e seus metabólitos M1+M3 em uma população brasileira.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes e soluções

O Docetaxel, Docetaxel-D5 e metabólitos (M1+M3) foram obtidos da Research Chemicals (Toronto, Canada). Ácido fórmico, metanol e acetonitrila em grau HPLC foram adquridos da Merck (Darmstadt, Germany). O acetato de sódio foi obtido da Mallinckrodt Baker (Xalostoc, Mexico). Água purificada foi obtida através de um sistema Elga Purelab Ultra^® da Veolia Labwater (High Wycombe, UK).

Preparação dos reagentes e soluções

Soluções-mãe de DTX e metabólitos (M1 e M3) foram preparadas pela dissolução em metanol afim de se obter a concentração de 1 mg mL^-1. A partir das soluções mãe foram preparadas soluções estoque metanólicas nas concentrações de 60; 50; 30; 20; 14; 10; 5,0; 2,0 e 1,0 µg mL^-1 para o DTX e 6,0; 5,0; 3,0; 2,0; 1,4; 1,0; 0,5; 0,2 e 0,1 µg mL^-1 para a mistura dos metabólitos diastereoisômeros M1+M3. Amostras calibradoras foram preparadas em plasma isento dos analitos diluindo-se as soluções estoque em 1:20, como descrito no item linearidade. Solução de DTX-D5 (padrão interno, PI) foi preparada por dissolução em metanol, na concentração de 1,0 µg mL^-1.

Equipamentos e condições cromatográficas

Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Dionex Ultimate 3000 acoplado a espectrômetro de massas sequencial (UPLC-MS/MS). A análise foi realizada em um espectrômetro TSQ Quantum Access MAX triplo quadruplo, controlado por software Xcalibur, proveniente da Thermo Scientific (San Jose, Estados Unidos). A separação cromatográfica foi realizada em coluna Acquity BEH C18 (150 x 2,1 mm; 1,7 µm), proveniente da Waters (Milford, Estados Unidos), mantida a 30 °C durante a análise. A fase móvel utilizada foi composta por mistura de água e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (45:55, v/v), eluída a uma vazão de 0,2 mL min^-1. Nessas condições o tempo total da corrida cromatográfica foi de 7 minutos. A ionização foi realizada com fonte electrospray (EIS) no modo positivo, cujas condições foram definidas após infusão de solução contendo os padrões analíticos na concentração de 1 µg mL^-1 em metanol, com voltagem de 4000 V, gás nebulizador nitrogênio com fluxo de 30 Arb, gás auxiliar nitrogênio com fluxo de 10 Arb, gás de colisão argônio, temperatura de vaporizador 370 °C e temperatura de capilar 284 °C. A aquisição foi realizada no modo MRM através das transições m/z 830→247 para quantificação e m/z 830→303 e 549 para qualificação do DTX, m/z 844→300 para quantificação e m/z 844→317 e 549 para qualificação dos metabólitos M1+M3, m/z 835→247 para quantificação e m/z 835 e 554 para qualificação do PI docetaxel-D5.

Preparo das amostras

As amostras foram processadas em extração líquido-líquido, onde uma alíquota de 500 µL de plasma foi acrescentada de 50 µL do padrão interno (PI) (docetaxel-D5 1 µg/mL) e 3,5 mL do solvente de extração metil-tert-butil-éter (MTBE). Após homogeneização por 10 minutos os extratos foram centrifugados a 3.000 rpm por 10 minutos. Uma alíquota de 3,2 mL da fase orgânica foi transferida para novo tubo e evaporada a 45 ºC em concentrador a vácuo. O extrato seco foi retomado com 100 µL da mistura de fase móvel e acetato de sódio 0,2 mmol L^-1 (90:10, v/v). O acetato de sódio foi incluído na fase móvel usada para retomar os extratos formar adutos de sódio e induzir a sua fragmentação. Os extratos foram centrifugados e posteriormente filtrados com membrana de PTFE com poro de 20 µm. Uma alíquota de 25 µL foi injetada em sistema UPLC-MS/MS para a detecção dos adutos de sódio do DTX, metabólitos e PI.

Validação do método

A validação do método empregou parâmetros essenciais para fornecer a confiabilidade e aceitabilidade da análise preconizados pelo Food and Drug Administration,²² tais como: seletividade, linearidade, sensibilidade, precisão, exatidão, estabilidade, efeito matriz e rendimento da extração.

Seletividade

Foram avaliadas amostras de plasma de 6 indivíduos que não eram usuários do fármaco e processadas conforme descrito no item "preparação das amostras" para verificar a presença de picos cromatográficos que possam interferir na detecção do analito e padrão interno (PI).

Linearidade

A linearidade dos modelos de calibração foi avaliada em 9 níveis, em sextuplicata para cada nível. Soluções calibradoras foram preparadas diluindo-se 20 vezes as soluções de trabalho DTX e M1+M3 para se obter concentrações em plasma de: 50; 100; 250; 500; 700; 1.000; 1.500; 2.500; e 3.000 ng mL^-1 para DTX e 5; 10; 25; 50; 70; 100; 150; 250; e 300 ng mL^-1 para M1+M3. As 6 réplicas de cada calibrador foram extraídas conforme item "preparação das amostras". Curvas de calibração foram construídas por cálculos da razão entre a área dos picos dos analitos e a área do padrão interno (y), e relacionando essas razões com concentração nominal das amostras de calibração (x). A homocedasticidade dos dados de calibração foi avaliada com o teste F com nível de confiança de 95%. As curvas foram ajustadas através de regressão linear empregando-se diversos fatores ponderais (1/x, 1/x^0,5, 1/x², 1/y, 1/y^0,5, 1/y²). Os modelos de calibração foram avaliados pelos coeficientes de correlação (r) e pelo erro percentual cumulativo (Σ%ER), de acordo com Almeida et al.²³

Sensibilidade

A sensibilidade foi determinada através do ponto mais baixo da curva de calibração (50 e 5 ng mL^-1 para DTX e M1+M3, respectivamente). Esse experimento foi incluído na avaliação da precisão e exatidão do método (limite inferior de quantificação, LIQ) e foi avaliado em triplicata durante três dias. O coeficiente de variação (CV%) máximo aceitável intra ensaio e inter ensaio foi de 20%, e a exatidão entre 80% e 120%.

Ensaios de precisão e exatidão

A precisão e exatidão do método foram avaliadas com amostras controle contendo DTX e M1+M3 nas concentrações 75 e 7,5 ng mL^-1 (controle de qualidade baixo - CQB); 90 e 75ng mL^-1 (controle de qualidade médio - CQM), 2.700 e 250 ng mL^-1 (controle de qualidade alto - CQA), respectivamente. As amostras foram processadas em triplicata e repetidas durante 5 dias diferentes. A precisão intra ensaio (variação entre as análises de um mesmo dia) e inter ensaio (variação entre os dias analisados) foram calculadas pela análise de variância (ANOVA), enquanto que a exatidão foi calculada como percentagem média obtida do valor teórico adicionado na amostra. O coeficiente de variação (CV%) aceito para a precisão foi de até 15%, e a exatidão entre 85 e 115%.

Estabilidade

A avaliação da estabilidade foi realizada através da análise de amostras de plasma controle de qualidade (CQB e CQA) em sextuplicata, os quais foram processados conforme descrito anteriormente. Os extratos obtidos de cada controle foram reunidos e injetados sob condições de uma corrida analítica com intervalos de 1 h, durante 12 h. A estabilidade foi avaliada através da diferença percentual entre o valor das áreas dos analitos obtidas no tempo inicial e as obtidas nos demais tempos, sendo considerada aceitável se todos os valores encontrados estivessem na faixa de 90 a 110% da razão das áreas entre os analitos e o PI obtida no tempo inicial. A estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento foi avaliada em amostras controle (CQB e CQA), as quais foram preparadas em triplicata para cada controle e analisadas no dia da preparação das amostras. Após três ciclos de congelamento e descongelamento as amostras foram reanalisadas em triplicata. Esse teste foi avaliado através da diferença percentual entre a média das concentrações obtidas no dia da preparação das amostras controle e as médias obtidas no ciclo, sendo considerado aceitável se todos os valores encontrados estiverem na faixa de 90 a 110% das concentrações obtidas nas amostras preparadas antes do ciclo.

Efeito matriz e rendimento da extração

Para avaliação do efeito matriz e rendimento da extração foram preparadas três séries de amostras controle de qualidade (CQB, CQM e CQA) e extraídas conforme segue: (A) Soluções contendo DTX e M1+M3 e padrão interno (DTX-5) foram adicionadas a fase móvel e injetadas diretamente no UPLC-MS/MS de forma que a concentração final seja equivalente a 100% da extração. (B) Amostras de cinco fontes diferentes foram extraídas, e re-extraídas com PI, DTX e M1+M3 em fase móvel. (C) Amostras de plasma de cinco fontes diferentes enriquecidas com os controles de qualidade foram extraídas em quintuplicada. O efeito matriz (ME) em ionização foi estimado com as percentagens de redução ou aumento de DTX e M1+M3 e a área do padrão interno na re-extração das amostras enriquecidas com DTX, M1+M3 e PI (B), comparando com a injeção direta das soluções (A), usando o cálculo ME= [100%-B/A%]. O rendimento da extração (RE) foi calculado comparando a área do analito com a área do padrão interno antes da extração (C) e após a extração (B), usando a formula RE= C/B%.

Aplicação do método

O método desenvolvido foi aplicado nas dosagens de 31 amostras de plasma obtidas de pacientes em tratamento com o DTX no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Os pacientes incluídos no estudo possuem câncer de próstata, mama ou pulmão, idade superior a 18 anos e somente foram aceitos após terem recebido esclarecimentos em relação ao estudo e assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre sob o parecer 1.055.723. Para calcular a exposição ao DTX através da estimativa da ASC, foi empregado um modelo de amostragem limitada descrito e validado por Engels et al.²⁴ e adaptado por Kraff et al.²⁵ Dessa forma, duas amostras de 8 mL de sangue venoso em tubo contendo EDTA foram colhidas dos participantes, como segue: a primeira no dia da administração do DTX, 5 minutos antes do final da infusão; e a segunda 60 ± 10 minutos após a infusão com o DTX. Após as coletas, as amostras de plasma foram centrifugadas e armazenadas em freezer -80 °C até as análises. Para a realização do cálculo da ASC em modelo bayesiano, foi utilizada uma planilha Excel^® disponibilizada pelo Departamento de Farmácia Clínica da Universidade Bonn (Bonn, Alemanha), na qual foram preenchidos os dados de dose utilizada, horários de inicio e término da infusão, horários da primeira e segunda coletas, bem como, as concentrações obtidas nas duas amostras coletadas.²⁵

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Cromatografia e preparação da amostra

O UPLC-MS/MS mostrou-se apropriado para determinação do DTX e M1+M3 em amostras de plasma. Foi utilizada uma coluna de fase reversa octadecil e fase móvel com eluição isocrática, que permitiu uma separação eficiente dos analitos dentro de uma corrida de 7 minutos, com tempos de retenção de 5,5 para DTX e PI e 2,8 minutos para M1+M3. O UPLC-MS/MS é um método que apresenta intrinsecamente alta seletividade, possibilitando a aquisição dos cromatogramas através de três transições do íon molecular para seus fragmentos (1 de quantificação e 2 de confirmação). Dessa forma, durante as análises de seletividade não foram identificados picos interferentes que possam impactar na detecção dos analitos. Na Figura 1 são apresentados cromatogramas adquiridos no método.

Figura 1. Cromatogramas obtidos nas análises de plasma. (A) Amostra de paciente coleta 1 1A: Docetaxel 1.125,6 ng mL^-1, 1B: M1+M3 25,8 ng mL^-1, 1C: Padrão interno; (B) Amostra de paciente coleta 2 2A: Docetaxel 85,1 ng mL^-, 2B: M1+M3 23,9 ng mL^-1, 2C: Padrão interno; Transições: DTX (m/z 830 → 247; 830 → 303; 830 → 549), Padrão interno (m/z 835 → 554; 835 → 427; 835 → 427), M1/M3 (m/z 844 → 300; 844 → 317;844 → 549)

A técnica utilizada para o preparo das amostras foi relativamente simples, com extração líquido-líquido, seguida de evaporação da fase orgânica. O acetato de sódio adicionado a amostra permitiu a formação dos adutos de sódio e uma ionização mais eficiente dos analitos com alcance de uma maior sensibilidade no ensaio.

Validação do método

O método foi linear nos intervalos de 50 a 3000 ng mL^-1 para o DTX e 5 a 300 ng mL^-1 para os metabólitos. Todas as curvas de calibrações incluíram este amplo intervalo, devido a grande diferença nas concentrações encontradas entre as coletas 1 e 2 realizadas neste estudo. Os dados da curva de calibração possuem heterocedasticidade significativa, com Fexp = 326,72 e 25,43 (Ftab (9. 5. 0,95) = 3,48) para os DTX e metabólitos, respectivamente. Diferentes fatores ponderais foram avaliados para a seleção modelo de regressão a ser empregado. Dentre os modelos avaliados, a regressão utilizando o fator ponderal 1/x apresentou menor ΣResíduos, com valores de -3,41 × 10^-13 e -2,7 × 10^-13 e menor Σ%ER, com valores de 1,47 × 10^-13 e 1,86 × 10^-13 e com coeficientes de correlação de 0,999 (DTX) e 0,9929 (M1+M3).

Os resultados de precisão e exatidão foram adequados, conforme a Tabela 1. A precisão intra-ensaio apresentou CV de 2,5 a 10,1% e a precisão inter-ensaio CV entre 5,9 e 12,6%, demonstrando adequada repetibilidade do método. A exatidão foi estimada entre 89 e 114%, também dentro dos critérios de aceitação para métodos bioanalítcos preconizados pelo Food and Drug Administration.²²

O efeito matriz foi avaliado para verificar a ocorrência de supressão de íons ou efeito de aumento causado por co-eluição de moléculas originarias da matriz da amostra com os compostos de interesse. Esta avaliação demonstrou um efeito de ionização entre -12 e +15%, indicando que a co-eluição com os componentes da matriz parecem ter efeito mínimo com os compostos de interesse (Tabela 1).

As amostras foram estáveis durante o período de 12 horas, com variação máxima de 6,1% para o DTX e 5,5% para M1+M3, permitindo o processamento de grandes lotes analíticos. A avaliação da estabilidade após três ciclos de congelamento e descongelamento atenderam os critérios de aceitação com variações entre 98,2 e 109,1% para o DTX e 99,4 e 110,3% M1+M3, respectivamente (Tabela 2).

A extração líquido-líquido com metil-tert-butil-éter (MTBE) mostrou alta recuperação dos analitos com média de 90% para DTX e 91% para os metabólitos. O método apresentou sensibilidade satisfatória, sendo que o limite inferior de quantificação foi menor do que o nível mais baixo encontrado em amostras clínicas. Cabe destacar ainda, que em estudos anteriores^20,21,26 os metabólitos formados a partir do metabolismo do DTX, não foram quantificados como no presente estudo. O desenvolvimento do método analítico descrito aqui, permitiu a quantificação dos metabólitos, mesmo que as concentrações presentes nas amostras clínicas sejam baixas. Entretanto, em contraste com Rosing et al.,²⁷ em que a detecção por LC-UV foi um fator limitante, a detecção por espectro de massas utilizada neste estudo permitiu adequada sensibilidade para detecção de M1+M3. No estudo de Guitton et al.,²⁸ apesar da quantificação dos metabólitos M1+M3, o limite superior de quantificação do método de 1000 ng mL^-1 não abrange a maioria das amostras clínicas obtidas antes do final da infusão, sendo necessária etapas de diluição das amostras, além disso a corrida cromatográfica possui tempo reduzido.

Aplicação do método

O método desenvolvido foi aplicado em 31 amostras de pacientes em tratamento quimioterápico com o DTX para câncer de mama (n=8), da próstata (n=12), pulmonar (n=5) e esofágico/gástrico (n=7), sarcomatoide (n=1) e osteossarcoma quadril (n=1). Todos os pacientes receberam uma dose padrão do quimioterápico de 75 mg m^-2 por infusão intravenosa durante 1 hora. O DTX foi administrado em regime de monoterapia ou associado a ácido zoledrônico, leuprorrelina, carboplatina e trastuzumab, cisplatina, prednisona e ciclofosfamida. As concentrações do DTX plasmáticas medidas 5 minutos (± 5 minutos) antes do final da infusão estiveram no intervalo de 779,0 a 3842,2 ng mL^-1, com média de 2116,9 ng mL^-1 (Shapiro-Wilk = 0,9808 p =0,82). As concentrações do fármaco mensuradas 60 minutos (± 10 minutos) após o término da infusão foram significativamente menores do que as inicialmente medidas, apresentando concentrações entre 49,78 e 394,8 ng mL^-1, com mediana de 97,15 ng mL^-1 (Shapiro-Wilk = 0,769 p <0,001). Isso ocorre em virtude do rápido tempo de meia-vida do fármaco (4, 36 minutos e 11,1 horas para as fases α, β e γ, respectivamente).²⁹

A estimativa da ASC dos pacientes seguiu um modelo Bayesiano, seguindo amostragem limitada proposto por Engels et al.¹⁵ e adaptado por Kraff.²⁵ Os valores de ASC ficaram dentro do intervalo de 2,4 e 4,9 mg h L^-1, com mediana de 3,0 mg h L^-1 (P25-75 de 2,72‑3,27 mg h L^-1) (Shapiro-Wilk = 0,8875; p <0,01). O coeficiente de variação percentual (CV%) dos valores de ASC foi de 18,1%, apresentado variabilidade interpaciente menor que a encontrada em estudos anteriores (23 a 56%), realizados com pacientes europeus, asiáticos e americanos.^{15,18,21,30,31} Entretanto, até o momento, ainda não há relatos em relação a farmacocinética do DTX na população brasileira, dessa forma é importante considerar diferenças étnicas, diferenças no metabolismo, transporte e excreção do fármaco.

Dentre os pacientes avaliados 4 (12,9%) apresentaram ASC acima do alvo terapêutico previamente proposto. Conforme descrito por Ma et al.,¹⁸ uma ASC de 2,5 a 3,7 mg h L^-1 seria adequada para efeitos clínicos benéficos durante a quimioterapia, com redução nas taxas de toxicidade grave em 24% dos pacientes asiáticos avaliados. Em contrapartida, em nosso estudo 3 (9,7%) dos pacientes obtiveram a ASC marginalmente inferior ao limite proposto para faixa terapêutica, com valor de ASC de 2,4 mg h L^-1. Entretanto, cabe ressaltar que apesar dos valores de ASC não estarem bem definidos, de acordo com a faixa terapêutica previamente estabelecida 22,6% dos pacientes avaliados no estudo seriam candidatos ao MTF.

Adicionalmente ao monitoramento do DTX, foi realizada a dosagem dos metabólitos M1+M3, cujos níveis plasmáticos antes do término da infusão foram de 8,13 a 93,87 ng mL^-1 e após a infusão de 5,01 a 50,47 ng mL^-1. As razões metabólicas [(DTX)]/[(M1+M3)] apresentaram-se altamente variáveis entre os pacientes, sendo de 8,30 a 312,51 durante a infusão e de 1,43 a 14,74 em coleta realizada 1 h após o final da infusão. A dosagem dos metabólitos e estabelecimento das razões metabólicas pode ser uma promissora estratégia para a fenotipagem da CYP3A4/5, devendo ser validada em amostras clínicas em um grupo maior de pacientes, de forma a estabelecer valores de corte populacionais, podendo ser um marcador adicional em estudos farmacocinéticos do DTX.

O método proposto apresenta excelente custo benefício na avaliação da terapia com o DTX. O 'turnaround time" estimado para a determinação da ASC foi inferior a um dia, com custo estimado na ordem de poucas dezenas de reais. Esse tempo permite a otimização da terapia do DTX em condições clínicas, uma vez que a quimioterapia é administrada a cada três semanas.

CONCLUSÃO

Foi desenvolvido e validado um método para determinação simultânea de DTX e seus metabólitos M1+M3 em plasma por UPLC-MS/MS. A preparação das amostras mostrou-se simples e eficiente, através de uma extração líquido-líquido. O método demonstrou desempenho analítico adequado para aplicações clínicas, sendo o primeiro estudo realizado em uma população brasileira em pacientes durante quimioterapia com o DTX. Os parâmetros de validação mostraram que o método oferece desempenho analítico satisfatório, e desta forma pode ser utilizado como ferramenta para o MTF do DTX. Cabe destacar, ainda, que a partir da estimativa da ASC foi possível identificar os potenciais candidatos para o monitoramento terapêutico do DTX.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Universidade Feevale, ao Hospital de Clínicas de Porto Alegre, à CAPES e à Fapergs (processo 16/0191-0) pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

1. Montero, A.; Fossella, F.; Hortobagyi, G.; Valero, V.; Lancet Oncol. 2005, 6, 229.

2. Baker, S. D.; Verweij, J.; Cusatis, G. A.; Van Schaik, R. H.; Marsh, S.; Orwick, S. J.; Franke, R. M.; Hu, S.; Schuetz, E. G.; Lamba, V.; Messersmith, W. A.; Wolff, A. C.; Carducci, M. A.; Sparreboom, A.; Clin. Pharmacol. Ther. 2009, 85, 155.

3. Joerger, M.; Cancer Chemother. Pharmacol. 2016, 77, 221.

4. Tetzlaff, E. D.; Cheng, J. D.; Ajani, J. A.; Ther. Clin. Risk Manage. 2008, 4, 999.

5. Awada, Z.; Haider, S.; Tfayli, A.; Bazarbachi, A.; El-Saghir, N. S.; Salem, Z.; Shamseddine, A.; Taher, A.; Zgheib, N. K.; OMICS 2013, 17, 353.

6. Pereira, L. C.; Nogueira, T. A.; Barbosa, L. A. de O.; Calil-Elias, S.; Castilho, S. R. de.; Braz. J. Pharm. Sci. 2015, 51, 551.

7. Reddy, L. H.; Bazile, D.; Adv. Drug Deliv. Rev. 2014, 71, 34.

8. Bosch, T. M.; Huitema, A. D. R.; Doodeman, V. D.; Jansen, R.; Witteveen, E.; Smit, W. M.; Jansen, R. L.; Van Herpen, C. M.; Soesan, M.; Beijnen, J. H.; Schellens, J. H. M.; Clin. Cancer Res. 2006, 12, 5786.

9. Kiyotani, K.; Mushiroda, T.; Kubo, M.; Zembutsu, H.; Sugiyama, Y.; Nakamura, Y.; Cancer Sci. 2008, 99, 967.

10. van Waterschoot, R. A. B.; Lagas, J. S.; Wagenaar, E.; Rosing, H.; Beijnen, J. H.; Schinkel, A. H.; Int. J. Cancer 2010, 127, 2959.

11. de Weger, V. A.; Beijnen, J. H.; Schellens, J. H. M.; Anti-Cancer Drugs 2014, 25, 488.

12. Paci, A.; Veal, G.; Bardin, C.; Levêque, D.; Widmer, N.; Beijnen, J.; Astier, A.; Chatelut, E.; Eur. J. Cancer 2014, 50, 2010.

13. Krens, S. D.; McLeod, H. L.; Hertz, D. L.; Pharmacogenomics 2013, 14, 555.

14. Yamamoto, N.; Tamura, T.; Murakami, H.; Shimoyama, T.; Nokihara, H.; Ueda, Y.; Sekine, I.; Kunitoh, H.; Ohe, Y.; Kodama, T.; Shimizu, M.; Nishio, K.; Ishizuka, N.; Saijo, N.; J. Clin. Oncol. 2005, 23, 1061.

15. Engels, F. K.; Loos, W. J.; Van Der Bol, J. M.; De Bruijn, P.; Mathijssen, R. H. J.; Verweij, J.; Mathot, R. A. A.; Clin. Cancer Res. 2011, 17, 353.

16. Ozawa, K.; Minami, H.; Sato, H.; Cancer Chemother. Pharmacol. 2008, 62, 551.

17. Björkhem-Bergman, L.; Bäckström, T.; Nylén, H.; Rönquist-Nii, Y.; Bredberg, E.; Andersson, T. B.; Bertilsson, L.; Diczfalusy, U.; Drug Metab. Dispos. 2013, 41, 1488.

18. Ma, Y.; Lin, Y.; Li, Y.; Zhao, H.; Zhang, Y.; Sheng, J.; Yang, Y.; Huang, Y.; Zhang, L.; Annals of Oncology 2015, 26 (suppl 9), ix128.3-ix128.

19. Ciccolini, J.; Catalin, J.; Blachon, M. F.; Durand, A.; J. Chromatogr. B 2001, 759, 299.

20. Wang, L. Z.; Goh, B. C.; Grigg, M. E.; Lee, S. C.; Khoo, Y. M.; Lee, H. S.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 1548.

21. Yamaguchi, H.; Fujikawa, A.; Ito, H.; Tanaka, N.; Furugen, A.; Miyamori, K.; Takahashi, N.; Ogura, J.; Kobayashi, M.; Yamada, T.; Mano, N.; Iseki, K.; J. Chromatogr. B 2012, 893-894, 157.

22. U. S. Food and Drug Administration; Guidance for Industry, Bioanalitical Method Validation, disponível em https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/bioanalytical-method-validation-guidance-industry, acessada em Fevereiro 2020.

23. Almeida, A.; Castel-Branco, M.; Falcão, A.; J. Chromatogr. B 2002, 774, 215

24. De Graan, A. J. M.; Elens, L.; Sprowl, J. A.; Sparreboom, A.; Friberg, L. E.; Van Der Holt, B.; De Raaf, P. J.; De Bruijn, P.; Engels, F. K.; Eskens, F. A. L. M.; Wiemer, E. A. C.; Verweij, J.; Mathijssen, R. H. J.; Van Schaik, R. H. N.; Clin. Cancer Res. 2013, 19, 3316.

25. Stefanie Theresa Kraff. Pharmakokinetische Dosisindividualisierung von Fluorouracil und Taxanen, 2015.

26. Sheu, M. T.; Wu, C. Y.; Su, C. Y.; Ho, H. O.; Sci. Rep. 2017, 7, 14609.

27. Rosing, H.; Lustig, V.; van Warmerdam, L. J.; Huizing, M. T.; ten Bokkel Huinink, W. W.; Schellens, J. H.; Rodenhuis, S.; Bult, A.; Beijnen, J. H.; Cancer Chemother. Pharmacol. 2000, 45, 213.

28. Guitton, J.; Cohen, S.; Tranchand, B.; Vignal, B.; Droz, J. P.; Guillaumont, M.; Manchon, M.; Freyer, G.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2419

29. Kenmotsu, H.; Tanigawara, Y.; Cancer Sci. 2015, 106, 497.

30. Veyrat-Follet, C.; Bruno, R.; Olivares, R.; Rhodes, G. R.; Chaikin, P.; Clin. Pharmacol. Ther. 2000, 68, 677.

31. Yamamoto, N.; Tamura, T.; Kamiya, Y.; Sekine, I.; Kunitoh, H.; Saijo, N.; J. Clin. Oncol. 2000, 18, 2301.