JBCS

INTRODUÇÃO

Annonaceae é uma família de árvores floríferas, arbustos e cipós com distribuição pantropical, sendo composta por 110 gêneros e aproximadamente 2.430 espécies.^1,2 No Brasil apresenta ampla distribuição, com cerca de 390 espécies encontradas principalmente na Região Amazônica e Mata Atlântica.^3,4 As espécies da família são conhecidas pela biossíntese de alcaloides e os estudos demonstraram considerável diversidade estrutural, além de notáveis atividades biológicas para esses metabólitos secundários.^5,6 Com relação ao gênero, Anaxagorea compreende 26 espécies,⁷ ocorrendo nas regiões neotropical e paleotropical, e no Brasil é encontrado principalmente no Norte e Nordeste.^8-10 Das espécies do gênero investigadas até o presente momento, foram identificados principalmente alcaloides, terpenoides, xantonas, flavonoides e lignoides.^11-16 Ao passo que em Anaxagorea dolichocarpa Sprague & Sandwith, estudos fitoquímicos prévios permitiram o isolamento de alcaloides azafenantrenos e aporfínicos.^11,17 Diversos compostos dessas duas subclasses de alcaloides já foram testados em ensaios de atividade citotóxica e antitumoral, alguns deles apresentando resultados positivos, sendo por isso considerados promissores.^5,11

Historicamente, produtos naturais obtidos de plantas representam a principal fonte de novos fármacos, além de fornecerem protótipos para a síntese de compostos farmacologicamente ativos, particularmente com atividade anticâncer. Considerando que o câncer é uma das doenças com as mais altas taxas de morbidade e mortalidade no mundo, há um considerável interesse científico e comercial na descoberta de novas drogas a partir de fontes naturais.¹⁸ Então, como continuidade dos estudos do nosso grupo de pesquisa com a família Annonaceae, este trabalho buscou isolar e identificar novos compostos de A. dolichocarpa por meio de métodos cromatográficos e espectroscópicos, respectivamente, e ainda avaliar a citotoxicidade dessas substâncias.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo químico do extrato etanólico das raízes de A. dolichocarpa levou ao isolamento de seis compostos (1 - 6) (Figura 1), sendo esse o primeiro relato das substâncias 1 e 2 na literatura. Suas estruturas químicas foram determinadas com base na análise dos dados espectroscópicos de RMN uni e bidimensionais, espectrometria de massa de alta resolução com ionização por electrospray (EMAR-IES) e comparação com dados da literatura. Os dados de RMN de ¹H e ¹³C dos compostos 1 e 2 estão compilados na Tabela 1.

Figura 1. Alcaloides isolados de A. dolichocarpa

O composto 1 foi isolado como cristais amarelados. O espectro de EMAR-IES mostrou o pico do íon [M+H]⁺ com m/z 283,1073 (calcd. para C₁₆H₁₅N₂O₃, 283,1077), compatível com a fórmula molecular C₁₆H₁₅N₂O₃. O espectro de infravermelho mostrou absorção de duas bandas em 3306 e 3139 cm^-1 de estiramento N-H₂, banda de carbonila de amida em 1646 cm^-1, absorções em 1618 e 1582 cm^-1 de C=C de aromático, além do sinal em 1055 cm^-1 de estiramento C-O. O espectro de RMN de ¹H (CD₃OD, 400 MHz) mostrou seis sinais de prótons aromáticos, sendo dois dupletos em δ_H 8,95 (d; J = 4,8 Hz) e δ_H 7,64 (d; J = 4,8 Hz), sugestivos para os prótons H-2 e H-3 de um anel piridínico do esqueleto azaaporfinoide,^19,20 e também quatro duplos dupletos duplos compatíveis com um sistema aromático ABCD, sendo um mais desprotegido em δ_H 9,13 (ddd; J = 8,4; 1,2; 0,8 Hz) característico do próton H-10 desse tipo de esqueleto, um em δ_H 8,26 (ddd; J = 8,4; 1,2; 0,8 Hz) atribuído ao H-7 e os outros dois em δ_H 7,81 (ddd; J = 8,4; 7,2; 1,2 Hz) e 7,73 (ddd; J = 8,4; 7,2; 1,2 Hz) assinalados para H-8 e H-9, respectivamente. Além desses sinais, foram ainda observados dois simpletos, ambos integrando para três prótons, em δ_H 4,07 (s) e δ_H 4,04 (s), correspondentes a duas metoxilas. No espectro de ¹³C (CD₃OD, 100 MHz) foram observados dezesseis sinais. Desses, seis denotam ser de carbonos metínicos aromáticos e dois de grupos metoxila, confirmando dessa forma os dados observados no espectro de RMN de ¹H. Observou-se também um sinal característico de um grupo carbonila e mais sete sinais indicativos de carbonos aromáticos não hidrogenados. A análise desses dados e do espectro de correlações HSQC permitiram atribuir os sinais dos carbonos metínicos em δ_C 147,3 e 121,8 aos carbonos C-2 e C-3, o primeiro mais desprotegido por estar ligado a um heteroátomo, e em δ_C 122,9, 130,8, 128,0 e 125,4 aos carbonos C-7, C-8, C-9 e C-10, respectivamente. Os demais carbonos foram definidos com auxílio das correlações a longa distância (²J e ³J) observadas no experimento HMBC (Figura 2), que permitiu também confirmar as demais atribuições já sugeridas. A correlação dos sinais em δ_H 8,95 (H-2) com δ_C 121,8 (C-3), 144,4 (C-3a), 144,3 (C-10b) e em δ_H 7,64 (H-3) com δ_C 147,3 (C-2), 174,4 (C-4), 122,1 (C-10c) estabeleceu os valores dos carbonos C-3a, C-10b e C-10c, bem como ratificou a posição da carbonila em C-4. A correlação dos sinais em δ_H 7,81 (H-8) e δ_H 9,13 (H-10) com δ_C 132,0 (C-6a) e em δ_H 8,26 (H-7) e δ_H 7,73 (H-9) com δ_C 128,9 (C-10a) determinou o deslocamento dos carbonos C-6a e C-10a. Além dessa correlação, o sinal em δ_H 8,26 (H-7), assim como o δ_H 4,07 (H₃CO-6), correlacionaram-se com δ_C 147,4 (C-6), permitindo dessa forma atribuir o deslocamento de C-6, substituído, portanto, por um grupo metoxila. A localização da segunda metoxila foi definida por meio da correlação do sinal em δ_H 4,04 (H₃CO-5) com o sinal em δ_C 143,8 (C-5). Para confirmar o grupo NH₂ na estrutura química, a amostra foi submetida a análise de RMN de ¹H em CDCl₃, na qual pôde-se observar dois sinais largos em δ_H 5,74 e 5,87 que desapareceram ao adicionar-se D₂O (Figuras 9S e 10S). Assim, com base nesses dados, foi possível propor para 1 a estrutura mostrada na Figura 1, um novo alcaloide azafenantreno denominado dolichocarpina. Sua análise por EMⁿ apresentou os íons indicados na Figura 2S e a proposta de fragmentação desses íons pode ser observada na Figura 3.^21,22

Figura 2. Correlações HMBC de 1 e 2

Figura 3. Proposta de fragmentação de EMⁿ de 1

O composto 2 foi isolado como cristais amarelados. O espectro de EMAR-IES mostrou o pico do íon [M+H]⁺ com m/z 295,1078 (calcd. para C₁₇H₁₅N₂O₃, 295,1077), compatível com a fórmula molecular C₁₇H₁₅N₂O₃. Os dados de RMN dessa substância foram comparados com os dados do alcaloide eupolauramina, isolado previamente de A. dolichocarpa e novamente neste trabalho (composto 3),¹¹ como também com outros relatados na literatura.²⁰ O espectro de RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz) apresentou semelhança com o da eupolauramina (3), observando-se porém um sinal de grupo metoxila a mais. Além dessa diferença, o espectro revelou a ausência de um sinal de próton aromático e alteração na multiplicidade dos sinais, apresentando um dupleto duplo e dois dupletos no lugar dos quatro duplos dupletos duplos, sugerindo dessa maneira uma substituição no anel D do esqueleto eupolaumarina. Os sinais em δ_H 7,33 (dd; J = 9,2; 2,4 Hz), δ_H 8,04 (d; J = 9,2 Hz) e δ_H 8,44 (d; J = 2,4 Hz) sugerem substituição no C-9, devido à ausência do sinal mais desprotegido na região próxima de 9,0 ppm atribuído ao H-10, que pode ter sofrido um efeito de proteção orto da metoxila na posição vizinha (C-9), podendo-se então atribuir esses sinais para H-8, H-7 e H-10, respectivamente. No espectro de RMN de ¹³C foi possível observar apenas oito sinais. Dentre eles se destaca o sinal de metoxila adicional em δ_C 55,8 e o de um carbono aromático mais protegido em δ_C 105,2, o qual apresentou correlação no espectro HSQC com o sinal em δ_H 8,44, atribuindo-se, por conseguinte, esse sinal ao carbono C-10. Os carbonos que não tiveram seus sinais observados no espectro de RMN de ¹³C (CDCl₃, 100 MHz) foram assinalados após análise do espectro de correlações HMBC (Figura 2). Esse experimento permitiu também confirmar a posição da metoxila em C-9 por meio da correlação do sinal em δ_C 158,5 (C-9) com δ_H 4,04 (H₃CO-9) e 8,04 (H-7), e deste último com δ_C 138,1 (C-6). Assim, o composto 2, pôde ser identificado como um novo alcaloide azafenantreno, denominado 9-metoxieupolauramina.

Composto 3: RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz), δ em ppm (mult.; J em Hz; H): 9,16 (d; 4,8; H-2), 9,01 (ddd; 8,0; 1,6; 0,8; H-10), 8,13 (ddd; 8,0; 1,2; 0,8; H-7), 7,91 (d; 4,8; H-3), 7,73 (ddd; 8,0; 6,8; 1,6; H-8), 7,67 (ddd; 8,0; 6,8; 1,2; H-9), 4,06 (s; H₃CO-6), 3,73 (s; H₃C-N). RMN de ¹³C (CDCl₃, 100 MHz), δ em ppm: 166,8 (C-4), 150,1 (C-2), 142,5 (C-10b), 132,6 (C-6a), 129,6 (C-8), 126,8 (C-9), 124,9 (C-5a), 124,4 (C-10), 122,8 (C-7), 117,2 (C-3), 63,5 (H₃CO-6), 28,5 (H₃C-N). EMAR-IES: m/z 265,0979 [M+H]⁺ (calcd. para C₁₆H₁₃N₂O₂, 265,0972). Dados coerentes com os relatados na literatura para eupolauramina,¹¹ já isolado em A. dolichocarpa.

Composto 4: RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz), δ em ppm (mult.; J em Hz; H): 8,72 (d; 6,0; H-5), 8,15 (s; H-2), 7,98 (ddd; 6,8; 1,2; 0,8; H-10), 7,91 (ddd; 6,8; 1,2; 0,8; H-7), 7,61 (d; 6,0; H-4), 7,45 (dt; 7,6; 1,2; H-9), 7,40 (dt; 7,6; 1,6; H-8), 4,08 (s; H₃CO-3). RMN de ¹³C (CDCl₃, 100 MHz), δ em ppm (alguns dados atribuídos por HMBC): 161,6 (C-6a), 155,0 (C-10b), 150,5 (C-3), 149,2 (C-5), 131,1 (C-9), 129,9 (C-8), 129,4 (C-2), 128,5 (C-3a), 122,6 (C-10), 121,7 (C-7), 113,5 (C-4), 56,4 (CH₃O-3). EMAR-IES: m/z 235,0872 [M+H]⁺ (calcd. para C₁₅H₁₁N₂O, 235,0866). Dados compatíveis com os reportados para 3-metoxieupolauridina,²³ isolado pela primeira vez na família Annonaceae.

Composto 5: RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz), δ em ppm (mult.; J em Hz; H): 8,69 (d; 6,0; H-2/H-5), 7,99 (dd; 8,4; 2,0 H-10/H-7), 7,46 (dd; 8,4; 2,0; H-8/H-9), 7,42 (d; 6,0; H-3/H-4). RMN de ¹³C (CDCl₃, 100 MHz), δ em ppm: 162,7 (C-6a/C-10b), 149,7 (C-2/C-5), 139,6 (C-6b/C-10a), 135,3 (C-3a), 131,4 (C-8/C-9), 122,9 (C-7/C-10), 120,9 (C-10c), 117,6 (C-3/C-4). EMAR-IES: m/z 205,0762 [M+H]⁺ (calcd. para C₁₄H₉N₂, 205,0760). Dados semelhantes com os relatados na literatura para eupolauridina,^15,24 relatado pela primeira vez na espécie A. dolichocarpa.

Composto 6: RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz), δ em ppm (mult.; J em Hz; H): 8,95 (d; 0,8; H-5), 8,89 (d; 6,0; H-2), 8,83 (ddd; 8,0; 1,2; 0,8; H-11), 8,45 (ddd; 8,0; 1,6; 0,8; H-8), 7,81 (ddd; 8,0; 7,6; 1,6; H-10), 7,79 (d; 6,0; H-3), 7,67 (ddd; 8,0; 7,6; 1,2; H-9), 2,76 (d; 0,8; CH₃-4). EMAR-IES: m/z 247,0875 [M+H]⁺ (calcd. para C₁₆H₁₁N₂O, 247,0866). Dados compatíveis com os relatados na literatura para 4-metilsampangina,²⁵ relatado pela primeira vez como produto natural.

Os compostos 2 e 4 inibiram significativamente a proliferação de células HCT-116 com percentual de inibição de 30,22 ± 2,63% e 32,42 ± 0,53%, respectivamente (Figura 4). Assim, comparando-se as estruturas químicas de 2 com 3 e de 4 com 5, observou-se nos dois casos uma substituição por um grupo metoxila em 2 e 4, o que permitiu sugerir que essa substituição aumentou a atividade citotóxica desses compostos para células tumorais da linhagem HCT-116. O estudo de citotoxicidade em linhagem não tumoral de fibroblasto de camundongo L929 mostrou que os compostos 2 - 5 podem reduzir a proliferação celular, o que indica citotoxicidade.

Figura 4. Citotoxicidade dos compostos 1 - 5 em linhagens de células HCT-116 e L929, após 72 h de tratamento. Os valores representam a média ± erro padrão de quatro replicatas na concentração de 50 μmol L^-1 (*p < 0,05 comparado ao grupo controle)

CONCLUSÃO

O estudo do extrato etanólico das raízes de A. dolichocarpa levou ao isolamento, por cromatografia líquida de média pressão e cromatografia líquida de alta eficiência, dos novos alcaloides azafenantrenos dolichocarpina (1) e 9-metoxieupolauramina (2), além dos alcaloides eupolauramina (3), já isolado na espécie, 3-metoxieupolauridina (4), novo na família, eupolauramina (5), novo na espécie e 4-metilsampangina (6), relatado pela primeira vez como produto natural. O estudo da atividade citotóxica mostrou que os compostos 2 - 5 induziram citotoxicidade em linhagem celular não tumoral murina L929 e que, em linhagem tumoral HCT-116, apenas os compostos 2 e 4 foram capazes de inibir a proliferação celular.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

As separações por cromatografia líquida de média pressão (CLMP) foram feitas utilizando como fase estacionária sílica gel (40-63 µm, 230-400 mesh, SiliCycle) e um equipamento Buchi modelo Sepacore flash system X-50. O software desse equipamento permitiu analisar as frações coletadas, auxiliando desse modo no agrupamento das amostras. As frações eluídas foram também analisadas por cromatografia de camada delgada (CCD) utilizando-se placas de alumínio pré-revestidas com sílica gel F₂₅₄ (SiliCycle), revelando-se com reagente de Dragendorff e exposição à luz UV (254 e 366 nm), e agrupadas de acordo com a similaridade de eluição. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) analítica foi realizada no instrumento Shimadzu Prominence equipado com uma bomba de solvente binária LC-20AT, auto-injetor SIL-20A, sistema degaseificador DGU-20A, detector DAD SPD-M20A, sistema de controle CBM-20A e as colunas de fase reversa Kromasil 100-10-C18 (250 mm × 4,6 mm preenchida com partículas de 10 μm) ou ACE 5 C18 (250 mm × 4,6 mm e partículas de 5 µm). As frações foram purificadas por CLAE na escala semi-preparativa e preparativa. Para a primeira técnica foi utilizado um equipamento Shimadzu composto por bomba LC-10AD vp, válvula solenoide FCV-10AL vp, injetor manual Rheodyne, desgaseificador DGU-14A, detector UV-vis SPD-10A vp, controlador de sistema SLC-10A vp e uma coluna semi-preparativa Venusil XBP C18 (250 mm × 10 mm e partículas de 10 μm). No caso da escala preparativa a purificação foi realizada em um Shimadzu contendo duas bombas LC-6AD, injetor manual Rheodyne, detector DAD SPD-M10A vp, controlador de sistema SLC-10A vp e coluna preparativa ACE 5 C18 (250 mm × 21,2 mm e partículas de 5 μm). O fluxo empregado para as purificações foi de 3,5 mL min^-1 para a escala semipreparativa e 8,0 mL min^-1 para a preparativa, realizando-se, para ambas, injeções de 100 μL de amostra para cada corrida cromatográfica.

Os espectros de massa de alta resolução com ionização por electrospray (EMAR-IES) e de baixa resolução em tandem (MSⁿ) foram obtidos em equipamentos Bruker modelos micrOTOF II e Ion Trap-amaZonX, respectivamente, os dois operando no modo positivo. Os espectros de RMN de ¹H, ¹³C e bidimensionais foram adquiridos no espectrômetro Bruker AVANCE III HD (400 MHz e 100 MHz para ¹H e ¹³C, respectivamente) usando CDCl₃ e CD₃OD como solvente e CHCl₃ (δ_H 7,24 e δ_C 77,0) e CH₃OH (δ_H 3,30 e δ_C 49,0) residual como padrão interno. As análises de infravermelho foram realizadas nos espectrômetros Rayleigh WQF-510 FT-IR e PerkinElmer Frontier FT-IR, com pastilhas de KBr e número de onda medido em cm^-1.

Material vegetal

As raízes de Anaxagorea dolichocarpa Sprague & Sandwith foram coletadas em Cruz do Espírito Santo, Paraíba, Brasil em dezembro de 2010. O registro de acesso ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) foi obtido sob o número AE4B71A. A identificação botânica foi realizada pela Drª Maria de Fátima Agra e uma exsicata encontra-se depositada no Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB), no Centro de Ciências Exatas e da Natureza, registrada como AGRA & GÓES 5543.

Extração e isolamento

As raízes de A. dolichocarpa foram secas em estufa de ar circulante a 45 °C por 92 h e em seguida trituradas produzindo 700,0 g de pó. Esse material foi, então, submetido ao processo de extração por maceração com etanol 95% por 72 h, em cinco repetições. A solução extrativa obtida foi concentrada em evaporador rotativo a 45 °C, resultando em 77,6 g de extrato etanólico bruto (EEB). Uma alíquota de 76,1 g do EEB foi inicialmente submetida a uma extração com hexano, para separação dos constituintes com baixa polaridade, permanecendo em contato com o solvente, em agitação mecânica, por cerca de 5 minutos. A seguir o material foi filtrado e o resíduo insolúvel pesando 66,4 g foi submetido ao procedimento de extração ácido-base para alcaloides,²⁶ fornecendo 2,3 g de fração alcaloídica (FA). Uma amostra da FA (2,1 g) foi fracionada por CLMP, usando sílica gel previamente tratada com NaHCO₃ 10%,²⁶ e gradientes dos solventes Hex-CHCl₃ (100:0 → 0:100), CHCl₃-AcOEt (100:0 → 0:100) e AcOEt:MeOH (100:0 → 3:7), resultando em 116 frações de 50 mL que após análise em CCD foram agrupadas em 20 (FA1-FA20). A fração FA2 (95,0 mg), eluída em Hex-CHCl₃ (8:2), foi submetida a um novo fracionamento por CLMP, com sílica gel tratada com NaHCO₃ 10%, e gradiente de Hex-CHCl₃ (100:0 → 0:100) e CHCl₃-AcOEt (100:0 → 0:100), fornecendo 9 subfrações (FA2A-FA2I). A subfração FA2D (15,8 mg), obtida em Hex-CHCl₃ (95:5), foi purificada por CLAE semi-preparativa com sistema gradiente de água (0,1% de ácido fórmico) e MeOH (95:5 → 0:100, em 60 minutos) a 254 nm, dando origem ao composto 5 (2,0 mg), eluído em 74% de MeOH. A subfração FA2E (23,4 mg), também obtida em Hex-CHCl₃ (95:5), foi purificada por CLAE semi-preparativa usando o seguinte gradiente de eluição: solvente A = água (0,1% de ácido fórmico); solvente B = MeOH; sistema de eluição = 0-40 min (20-70% de B); 40-50 min (70% de B); e 50-65 min (70-100% de B); a 254 nm; fornecendo as substâncias 2 (0,6 mg), 3 (4,7 mg) e 4 (1,5 mg), eluídas em 80%, 72% e 70% de B, respectivamente. A fração FA7 (197,3 mg), eluída em Hex-CHCl₃ (1:9), foi purificada por CLAE preparativa com o gradiente de eluição: solvente A = água (0,1% de ácido fórmico); solvente B = MeOH; sistema de eluição = 0-45 min (0-65% de B); 45-55 min (65% de B); e 55-90 min (65-100% de B); a 254 nm; isolando 6 (1,5 mg), obtido em 65% de B. A fração FA8 (295,5 mg), eluída em CHCl₃-AcOEt (9:1), foi separada em 11 frações (FA8A-FA8M) por CLMP, com sílica gel tratada com NaHCO₃ 10%, e gradiente de Hex-CHCl₃ (100:0 → 0:100), CHCl₃-AcOEt (100:0 → 0:100) e AcOEt:MeOH (100:0 → 3:7). A subfração FA8G (121,4 mg), eluída em CHCl₃, foi submetida a CLAE semi-preparativa com o gradiente de eluição: solvente A = água (0,1% de ácido fórmico); solvente B = MeOH; sistema de eluição = 0-20 min (30-40% de B); 20-65 min (40% de B); e 65-100 min (40-100% de B); a 254 nm; obtendo-se o composto 1 (3,6 mg), obtido em 45% de B.

Avaliação da citotoxicidade

Para a avaliação da citotoxicidade dos compostos 1 - 5 foram utilizadas as linhagens de células HCT-116 (carcinoma colorretal humano) e L929 (fibroblastos murinos não-tumorais). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U mL^-1 de penicilina e 100 μg mL^-1 de estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO₂. As células foram semeadas em placas de 96 poços em uma densidade de 3 × 10⁵ células/poço. Após um período de 24 h, as células foram incubadas com os compostos 1 - 5 (50 µmol L^-1) dissolvidos em DMSO (0,4%), por 72 h. Então, o sobrenadante foi descartado e a solução de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (5 mg mL^-1) foi adicionada e incubada por mais 3 h. O sal de formazam depositado foi dissolvido em dodecil sulfato de sódio (SDS) (100 μL).²⁷ O controle positivo foi o DMSO (20%). A densidade ótica foi medida em um leitor de microplacas (Synergy HT, BioTek^®) no comprimento de onda de 570 nm. Os resultados foram expressos como média ± e.p.m. (erro padrão da média) de quatro replicatas e foram comparados por análise de variância (ANOVA - one way), seguido do pós-teste de Tukey. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros no IV, de RMN uni e bidimensionais, EMAR-IES e de baixa resolução MSⁿ estão disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem às agências de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (código de financiamento 001) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro e bolsas de pesquisa, ao Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise (LMCA-UFPB) e ao Centro Analítico de Instrumentação da Universidade de São Paulo (Central Analítica IQ-USP) pela aquisição dos espectros, e à Rede Norte-Nordeste de Fitoprodutos (INCT-RENNOFITO) pela colaboração.

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