JBCS

INTRODUÇÃO

A triagem de fármacos envolve a investigação acerca da responsividade transcricional de um organismo a um medicamento.¹ O uso de modelos matemáticos para prever a suscetibilidade de microorganismos a medicamentos tem se mostrado importante em diversas áreas da medicina utilizando diferentes estratégias.^2-6

Os estudos de QSAR são descritos e amplamente aplicados como ferramenta para descrever quantitativamente as relações entre a estrutura química de moléculas e a atividade biológica das mesmas,⁷ permitindo o planejamento racional de fármacos ou o reposicionamento de fármacos. Para isso é necessário um número total de variáveis, que pode ser muito maior que o número que será efetivamente incluído nos modelos.⁸ A validação do modelo gera alguns parâmetros estatísticos, sendo que um modelo com bom ajuste precisa apresentar um coeficiente de correlação (R) próximo à um (unidade), desvio-padrão (s) pequeno e o valor do teste de Fischer (F) grande.^8,9

Há vários compostos descritos na literatura com ação potencial contra o SARS-CoV, como é o caso do favipiravir (aprovado para influenza), remdesivir (GS-5734), galidesivir (BCX4430), ribavirina (aprovado para hepatite viral tipo C, HCV, e vírus sincicial respiratório),¹⁰ tenofovir disoproxil fumarato (TDF) (aprovado para tratar a síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV) e hepatite B, o qual possui mecanismo de ação semelhante ao remdesivir).¹¹ Também podemos destacar o composto anakinra, antireumático que em testes clínicos gerou redução da mortalidade, juntamente com uma diminuição da necessidade de invasão mecânica por ventilação, sem que houvesse infecção bacteriana¹² ou ainda a inibição na replicação de SARS-CoV-2 utilizando 2-desoxi-D-glicose (2-DG) in vitro.¹³ Outros compostos como o 3CL^pro e o PL^pro apresentam potencialidades como inibidores contra SARS-CoV e MERS-CoV.¹⁴ Assim, conforme descrito por Liu et al.,¹⁴ estes compostos podem ser testados contra 3CL^pro e PL^pro específicos, contribuindo na elucidação do mecanismo de ação específico. Resultados apresentados por Elfiky (2020) indicam que os compostos sofosbuvir, ribavirina e remdesivir podem ser usados contra SARS-CoV-2 bem como os derivados de nucleotídeos fisiológicos, utilizados como inibidores específicos contra a COVID-19.¹⁵ Estudos ainda descrevem que combinações do antibiótico baricitinibe com os antivirais de ação-direta lopinavir ou ritonavir e remdesivir podem reduzir a infecciosidade, replicação viral e resposta inflamatória frente à infecção por COVID-19.¹⁶ Já a combinação tripla de interferon beta-1b, lopinavir-ritonavir e ribavirina demonstraram em estudos clínicos, fase 2, a redução da taxa viral do SARS-CoV-2, alívio dos sintomas e redução no tempo de internamento dos pacientes infectados com COVID-19 com sintomas leves a moderado.¹⁷

Conforme descrito por Dai et al.,¹⁸ o novo corona vírus (SARS-CoV-2) possui poliproteínas que são processadas por uma protease principal (M^pro), também conhecida como protease do tipo 3C (3CL^pro) e algumas outras proteínas e proteases. No entanto, a protease M^pro, desempenha um papel vital no ciclo de vida do coronavírus. M^pro é uma proteína de cisteína com três domínios envolvida na maioria dos eventos de clivagem e de maturação na poliproteína precursora,^18-20 sendo uma enzima chave que desempenha um papel central na mediação da replicação e transcrição viral.¹⁸

Nesse manuscrito foram gerados modelos de QSAR a partir da correlação entre a concentração inibitória para 50% da replicação viral (CI₅₀) de compostos descritos na literatura com descritores físico-químicos e moleculares da estrutura tridimensional (3D). Além disso, foi investigada a correlação entre os valores de CI₅₀ e o alinhamento da estrutura tridimensional (3D), para os três inibidores conhecidos da protease (M^pro) presentes no SARS-CoV-2.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Modelos matemáticos e validação

Os modelos matemáticos foram desenvolvidos com o auxílio do software BuildQSAR (versão 1.0.1.35). A avaliação do grau de previsibilidade dos modelos também foi calculada usando o programa BuildQSAR. Foi realizada a validação estatística e a validação externa. Um modelo com elevado grau de previsibilidade para objetos não incluídos no mesmo apresentará coeficiente de correlação (Q²) próximo de 1 e desvio-padrão da validação cruzada (S_PRESS) próximo a zero.²¹

Os modelos foram gerados a partir de método semi-empírico, considerando a investigação da suscetibilidade in vitro (CI₅₀) determinada experimentalmente por Jeon et al. de 35 compostos que apresentaram os melhores valores de CI₅₀, os quais foram selecionados a partir de 52 compostos previamente descritos.²² A partir destes 35 compostos, 31 parâmetros (físico-químicos e moleculares) foram calculados, incluindo o alinhamento estrutural 3D (similaridade estrutural), utilizando o banco de estruturas da PubChem²³ e o software ChemAxon²⁴ (Tabela 1S). Compostos iguais apresentam alinhamento estrutural 3D igual a 1. Para cruzamento dos dados e para gerar os modelos matemáticos foi utilizado o programa BuildQSAR. Com a finalidade de gerar as QSARs os valores de CI₅₀ são convertidos em log(1/CI₅₀) (Tabela 1S). Para a triagem foram selecionados 29 compostos (Tabela 2S) que compreendem analgésicos, antivirais, anticoagulantes e produtos naturais com diferentes ações metabólicas. Para validação externa (Tabela 3S), foram selecionados os compostos com ação anti-SARS-CoV-2 favipiravir (CI₅₀ > 500 μmol L^-1) e atazanavir (CI₅₀ > 50 μmol L^-1),²² emetina (CI₅₀ = 0,46 μmol L^-1) e homoharringtonina (CI₅₀ = 2,55 μmol L^-1),²⁵ ivermectina (CI₅₀ = 2,80 μmol L^-1),²⁶ 11a (CI₅₀ = 0,053 μmol L^-1) e 11b (CI₅₀ = 0,04 μmol L^-1).¹⁸ Para todos os compostos investigados - série em estudo (Tabela 1S), compostos utilizados na triagem (Tabela 2S) e compostos utilizados na validação externa (Tabela 3S) - foram calculados os mesmos parâmetros físico-químicos e descritores moleculares.

Considerando que o mecanismo de ação de um fármaco na base proteica do SARS-CoV-2 ainda não é totalmente conhecido a análise da semelhança estrutural entre os inibidores conhecidos (N1, N3 e N9)¹⁸ (Figura 1) e as moléculas investigadas é uma ferramenta físico-química importante no processo de triagem ou reposicionamento de fármacos que apresentem potencial ação anti-SARS-CoV-2.

 

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Correlação entre CI₅₀ e descritores da estrutura tridimensional (3D)

Os testes de avaliação das equações geradas levaram em consideração: i) verificação do grau de ajuste do modelo (cálculo do coeficiente de correlação (R) e do desvio-padrão (s)); ii) verificação do grau de significância do modelo (cálculo do teste F); e iii) verificação do grau de previsibilidade do modelo e das variáveis selecionadas (validação cruzada, cálculo do coeficiente de correlação (Q²) e do desvio padrão da validação cruzada (s_PRESS)), sendo estas as avaliações exigidas para um modelo de regressão linear ser aceito.²¹ Na primeira etapa, foram geradas equações para os 35 compostos. As equações obtidas não apresentaram bons resultados estatísticos, apresentando baixos coeficientes de correlação (R), altos desvios-padrão (s), baixa significância (baixo F), baixa previsilidade (Q²) e alto desvio padrão da validação cruzada (s_PRESS), indicando que os compostos investigados apresentam diferentes mecanismos de ação.

Na segunda etapa, para a construção do modelo foram selecionados cinco compostos descritos por Jeon et al.,²² que apresentam os maiores valores de log(1/CI₅₀) para SARS-CoV-2, sendo digoxina, digitoxina, niclosamida, proscilaridina e hexaclorofeno, com valores de CI₅₀ entre 0,190 e 2,040 μmol L^-1. Observou-se que os valores de similiaridade tridimensional 3D com N1 estavam entre 0,060 e 0,327, similiaridade tridimensional 3D com N3 entre 0,140 e 0,319 e similiaridade tridimensional 3D com N9 entre 0,096 e 0,334. Dentre as muitas equações geradas (QSARs), a Equação 1 foi a que apresentou os parâmetros estatísticos mais adequados, mas mesmo assim, não é uma equação estatisticamente aceitável, pois apesar de ser um modelo com previsibilidade de 89,4% (Q²=0,894x100) e h positivo (coeficiente angular), que indica que o parâmetro X da equação contribui positivamente para o modelo gerado, ela apresenta baixa significância (baixo F), baixa correlação (r²=0,135) e altos desvios padrão (s e S_SPRESS). O parâmetro X[27] utilizado para gerar o modelo é o número de sítios aceptores de ligação de hidrogênio. A correlação entre os valores de log(1/CI₅₀)_Previsto versus log(1/CI₅₀)_Observado indicam a presença de compostos que geram grandes resíduos no modelo de regressão (Figura 1S), denominados de outliers.²¹

Como critério de investigação, foi realizada a validação externa utilizando a Equação 1. A relação entre log(1/CI₅₀)_Observado e log(1/CI₅₀)_Previsto indica valor dos resíduos ≤ 2,386 (Tabela 1). Estes compostos provavelmente apresentam diferentes mecanismos de ação o que é uma variável a ser considerado na flutuação dos valores dos resíduos.

 

 

Observa-se que os compostos com as maiores atividades biológicas contra SARS-CoV-2 utilizados na construção da QSAR apresentada na Equação 1, apresentam grandes diferenças estruturais entre si, possivelmente apresentando diferentes mecanismos ação, o que geralmente é fator determinante para obtenção de parâmetros estatísticos que permitam validar o modelo gerado.

Na terceira etapa, foram então selecionados aleatoriamente dois grupos de compostos visando correlacionar os valores de CI₅₀ com a similaridade 3D para os três inibidores conhecidos da protease (M^pro), separadamente. Para gerar os modelos matemáticos do Grupo 1 foram selecionados aleatoriamente, os compostos proscilaridina, penfluridol, ceritinibe, tetrandrina, bazedoxifeno, droloxifeno e eltrombopag. Esses compostos aparesentam valores de CI₅₀ entre 2,04 e 8,27 μmol L^-1. Observou-se que os compostos escolhidos apresentaram valores de alinhamento estrutural tridimensional (3D) para N1 entre 0,141 a 0,308, similiaridade tridimensional 3D com N3 entre 0,270 e 0,349 e similiaridade tridimensional 3D com N9 entre 0,289 e 0,338. Dentre as equações geradas, o modelo apresentado na Equação 2, utiliza o parâmetro X[24] que indica o número de doadores de ligação de hidrogênio no composto testado. Dentre as equações geradas, a Equação 2 foi a que apresentou os parâmetros estatísticos mais adequados, apresentando previsibilidade do modelo de 63,9% (Q²=0,639x100) e h positivo (coeficiente angular), que indica que o parâmetro X da equação contribui positivamente para o modelo gerado. O modelo gerado (Eq. 2) apresenta maior significância (valor F) que o modelo apresentado na Eq. 1, boa correlação (r²=0,766) e baixos desvios padrão (s e S_SPRESS). A correlação entre os valores de log(1/CI₅₀)_Previsto versus log(1/CI₅₀)_Observado indicam a presença de compostos que geram menores resíduos no modelo de regressão (Figura 2S), quando comparados ao modelo apresentado na Equação 1.

A partir da validação externa utilizando a Equação 2 a relação entre log(1/CI₅₀)_Observado e log(1/CI₅₀)_Previsto indica valores dos resíduos menores que os observados na Equação 1 (Tabela 2). Observa-se que os compostos que apresentam o maior número de sítios aceptores de par eletrônico (Tabela 3S), homoharringtonina e ivermectina, apresentam os menores resíduos.

 

 

Para gerar os modelos matemáticos do Grupo 2 foram selecionados os compostos ciclosporina, lusutrombopag, triparanol, remdesivir, cloroquina. Esses compostos apresentam valores de CI₅₀ entre 3,78 e 12,00 μmol L^-1. Para esse grupo observou-se que os compostos escolhidos apresentaram valores de alinhamento estrutural tridimensional (3D) para N1 entre 0,233 e 0,333, similiaridade tridimensional 3D com N3 entre 0,284 a 0,391 e similiaridade tridimensional 3D com N9 entre 0,260 e 0,398. Dentre as equações geradas, são apresentados dois modelos (Equações 3 e 4) os quais apresentaram parâmetros estatísticos adequados. A Equação 3 apresenta previsibilidade do modelo de 96,9% (Q²=0,969x100) e h positivo da equação (coeficiente angular), indicando que o parâmetro X[18], raio máximo de projeção, contribui positivamente para o modelo gerado. O modelo gerado (Eq. 3) apresenta alta significância (valor F), boa correlação (r²=0,988) e baixos desvios padrão (s e S_SPRESS).

A partir da validação externa utilizando a Equação 3 a relação entre log(1/CI₅₀)_Observado e log(1/CI₅₀)_Previsto indica que os menores valores dos resíduos são observados para homoharringtonina e ivermectina (Tabela 3).

 

 

A Equação 4 apresenta previsibilidade do modelo de 99,9% (Q²=0,999x100) e h positivo (coeficiente angular) da equação, indicando que o parâmetro X[20], comprimento perpendicular à área mínima, contribui positivamente para o modelo gerado. O modelo de QSAR gerado (Eq. 4) apresenta os melhores parâmetros estatísticos dentre os quatro modelos gerados (Eq. 1-4), apresentando alta significância (valor F), boa correlação (r²=1,00) e baixos desvios padrão (s e S_SPRESS). A correlação entre os valores de log(1/CI₅₀)_Previsto versus log(1/CI₅₀)_Observado para as Equações 3 e 4 indicam boa linearidade dos modelos de regressão (Figura 3S e Figura 4S), sendo os melhores modelos obtidos.

A partir da validação externa utilizando a Equação 4 a relação entre log(1/CI₅₀)_Observado e log(1/CI₅₀)_Previsto indica que os menores valores dos resíduos são observados para atazanavir, homoharringtonina e ivermectina (Tabela 4). Mesmo um modelo matemático apresentando bons parâmetros estatísticos, os valores dos resíduos algumas vezes podem ser superiores a uma unidade. Isso pode estar correlacionado com diferentes mecanismos de ação entre os compostos utilizados para gerar o modelo e os compostos selecionados para a validação ou incapacidade de explicar o aspecto tridimensional das interações fármaco-receptor.⁷ De modo geral, os resíduos resultam de erros aleatórios relativos à determinação experimental dos valores de Y (log(1/CI₅₀)) e/ou a especificação imprópria do modelo. Os resíduos indicam uma variabilidade que o modelo não pode explicar.²¹

Dentre os parâmetros físico-químicos e descritores moleculares utilizados para a obtenção dos modelos matemáticos, observa-se que os modelos de QSAR que possuem compostos com baixa similaridade estrutural entre N1, N3 e N9 geram modelos com baixa predição (Eq. 1). Os parâmetros que mais interferem e permitem validar as equações são: número de doadores de ligação de hidrogênio (Eq. 2), raio máximo de projeção (Eq. 3) e comprimento perpendicular à área mínima (Eq. 4). Isso infere dizer que há um sinergismo entre a capacidade básica do sítio de ação da proteína de cisteína presente no vírus e as condições geométricas para o alinhamento tridimensional nos potenciais compostos com ação anti-SARS-Cov-2, devido a similaridade estrutural com as estruturas dos inibidores peptidomiméticos covalentes, conforme descrito na literatura.^18-20,27

A literatura descreve compostos que apresentam alta atividade biológica contra o vírus, mas seu emprego é inviável pela toxicidade ou efeitos colaterais e a similaridade estrutural é um fator importante a ser considerado,¹⁸ conforme também observado a partir dos modelos matemáticos propostos por este trabalho. A semelhança estrutural com a protease principal (M^pro) foi um parâmetro chave para poder compreender os modelos matemáticos gerados.

Os modelos de QSAR gerados e apresentados nas Equações 1-4 foram aplicados aos 29 compostos selecionados para triagem. Do grupo de triagem, os compostos ácido acetil salicílico, azitromicina, azul de metileno, colecalciferol, curcumina, ergocalciferol, famotidina, heparina e T3 estão com tag de testes clínicos na plataforma PubChem.²³ A Tabela 2S contém os números CID dos compostos para pesquisa na referida plataforma. A partir dos 29 compostos selecionados para triagem, foram calculados os valores da atividade biológica prevista (log(1/CI₅₀)_Previsto) (disponível na Tabela 4S). Dentre estes compostos observa-se que os compostos com as maiores atividades previstas (log(1/CI₅₀)_Previsto) para: i) Equação 1 são: heparina, saponina, rutina, tartrazina, kaempferol e azitromicina (Figura 2); ii) Equação 2 são: saponina, rutina, heparina, azitromicina, kaempferol e famotidina (Figura 3); iii) Equação 3 são: astaxantina, zeaxantina, saponina, ácido linolênico, heparina e colecalciferol (Figura 4); e iv) Equação 4 são: astaxantina, zeaxantina, saponina, ácido linolênico, heparina e sulfato de colesterol (Figura 5). É importante destacar que as equações indicam muitos dos compostos que tem tag de testes clínicos sobre SARS-CoV-2. A Tabela 5S também apresenta a atividade biológica prevista (log(1/CI₅₀)_Previsto) para os 35 compostos da série em estudo a partir das quatro equações geradas por este trabalho e os respectivos resíduos.

 

 

 

 

 

 

 

 

A triagem envolvendo hormônios e produtos naturais, que muitas vezes têm ação quelante,^28,29 justifica-se porque ainda não há um diagnóstico clínico explicitando por que algumas pessoas não desenvolvem os sintomas da COVID-19, sendo então assintomáticas e potencialmente transmissoras do vírus. A ligação de íons metálicos pode ativar ou desativar uma proteína, sendo que estudos indicam que íons metálicos podem se ligar às proteínas virais da protease 3CL de SARS-CoVcom inibição não competitiva.^30,31 Estudos têm evidenciado que a curcumina inibe a infecção pelos vírus zika e chikungunya, inibindo a ligação celular³² e que uma ingestão habitual moderada de flavonóides têm correlação com a redução das taxas de mortalidade relacionadas a problemas cardiovasculares e ligados ao câncer, considerando uma ingestão de aproximadamente 500 mg/dia de flavonóides.³³ A literatura descreve compostos naturais que inibem a replicação de vírus que causam síndrome reprodutiva e respiratória em animais.³⁴

Os autores destacam que o trabalho aqui apresentado permite contribuir para a investigação, reposicionamento ou síntese de novos fármacos e reforçam que os modelos matemáticos auxiliam na investigação química, mas não substituem estudos para avaliar a eficácia in vitro, in vivo, pré-clínico e clínicos, os quais são fundamentais para a dosagem, liberação ou autorização do uso de qualquer medicamento ou suplemento.

 

CONCLUSÃO

Estes modelos de relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR) propostos contribuem para: i) reflexão sobre o reposicionamento de fármacos; ii) desenvolvimento ou investigação de compostos com similaridade estrutural ao sítio de ação conhecido; iii) auxiliar na investigação de compostos que tenham similaridade estrutural com a proteína do vírus que não sofre mutação.

Este trabalho demonstra que a partir de cada domínio conhecido presente no SARS-CoV-2 com alinhamento estrutural podem ser desenvolvidas equações para prever a atividade anti-COVID-19 de compostos químicos, contribuindo para a síntese de novos fármacos ou o reposicionamento de fármacos pré-existentes.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

Tabelas e figuras de parâmetros gerados a partir deste trabalho estão disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o Laboratório de Corantes e Processos Pirolíticos (LACOPPI/IFPR), o Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Paraná - IFPR (Edital 12/2020 - Chamada Interna de Apoio à Projetos de Extensão, Pesquisa e Inovação para o Enfrentamento da Emergência de Saúde Pública de Importância Internacional Decorrente do Coronavírus, Covid-19/PROEPPI-IFPR) e o Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Santa Catarina - IFSC.

 

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