JBCS

INTRODUÇÃO

Problemas relacionados ao trato urinário são uma crescente preocupação em todo o mundo, sendo que as patologias mais comuns¹ são a incontinência urinária (perda involuntária de urina) e a bexiga hiperativa, que é uma doença reconhecida pela urgência urinária, com aumento da frequência de micção. Essa urgência é de difícil controle e seus sintomas estão normalmente ligados à hiperatividade do músculo detrusor humano, no momento que este se contrai de forma inapropriada, durante o período de enchimento da bexiga.²

A acetilcolina é o neurotransmissor responsável pela contração do músculo detrusor. Fármacos da classe dos antimuscarínicos, também conhecidos como fármacos anticolinérgicos, são compostos sintéticos, conhecidos por sua capacidade de bloquear/inibir a atividade do receptor muscarínico da acetilcolina.³ Tais fármacos atuam reduzindo a atividade muscular espontânea, durante o período de enchimento da bexiga, diminuindo, consequentemente, a frequência urinária e intensidade de contração do músculo detrusor.⁴

Dentre os fármacos antimuscarínicos comercializados mundialmente, os quais têm mostrado eficiência em reduzir os principais sintomas, em até 75% dos casos,⁵ destaca-se a oxibutinina (OXI) (Figura 1(A)), um fármaco quiral, comercializado como racemato e na forma de cloridrato de oxibutina (nome químico: cloridrato de 4-dietilamino-2-butil-fenil-ciclohexil-glicolato), muito utilizado em função de ser o mais barato e mais eficiente dentre os demais, além de ser também disponível na forma de adesivos transdérmicos. A OXI também exerce efeito analgésico local na mucosa vesical e efeito antiespasmódico diretamente sobre o músculo liso, bem como inibe a ação muscarínica da acetilcolina sobre a musculatura lisa.^6,7

Figura 1. Estruturas químicas (A) dos enantiômeros das bases livres (R)-OXI e (S)-OXI e (B) (R)-DEO e (S)-DEO. O asterisco representa o centro estereogênico de cada molécula

A OXI, quando administrada por via oral, sofre pronunciada biotransformação hepática levando à formação da N-desetiloxibutinina (DEO) (Figura 1(B)), que também apresenta atividade anticolinérgica semelhante ao fármaco.⁸ Esse metabólito, junto com o fármaco, contribui para o efeito adverso de boca seca, o que leva muitos pacientes a desistirem do tratamento ou à necessidade de ajuste de dose. Outros efeitos colaterais adversos podem ser: taquicardia, constipação e visão turva.⁹ Nesse sentido, uma forma de minimizar tais efeitos sistêmicos é administrar uma formulação reduzindo a dose da OXI, porém, com aumento na concentração de DEO, ou ainda por meio de formulações orais de liberação controlada.^10,11

A OXI e a DEO apresentam algumas similaridades entre si, além de suas estruturas químicas. Uma propriedade que se destaca é a presença de um centro estereogênico (carbono quiral), que confere à ambas as moléculas, a existência de um par de enantiômeros, conforme evidenciado na Figura 1. Dessa forma, interações estereoespecíficas de cada enantiômero com receptores biológicos promovem diferentes respostas, devido às diferentes propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas dos mesmos.^12-14

Embora se saiba que os (R)-enantiômeros da OXI e da DEO têm atividades antimuscarínicas superiores em relação aos (S)-enantiômeros, sendo que (R)-OXI e (R)-DEO são os enantiômeros responsáveis pela potência anticolinérgica, enquanto o (S)-OXI e (S)-DEO contribuem para uma menor incidência de efeitos adversos, ligando-se mais facilmente às glicoproteínas,^14,15 quando administrados de forma separada, os enantiômeros não têm efeitos terapêuticos tão significativos, em comparação aos resultados alcançados quando ocorre a administração da mistura racêmica.^15,16

Tais fatos tornam importante o desenvolvimento de técnicas e métodos analíticos com alto poder de separação de enantiômeros, conhecidos como métodos de separação enantiosseletiva, os quais permitem a identificação de cada enantiômero individualmente, visando um melhor entendimento acerca do fármaco em questão.^17,18

Diferentes técnicas analíticas têm sido utilizadas corriqueiramente, de forma eficiente, na separação enantiosseletiva. Essas são normalmente divididas em dois grandes grupos principais: as técnicas de eletromigração - como a eletroforese capilar - e as técnicas cromatográficas - como a cromatografia gasosa e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês High Performance Liquid Chromatography).^19-21 Ao se empregar HPLC, para que cada enantiômero apresente uma interação distinta com as fases estacionária e móvel, uma estratégia recorrente diz respeito à utilização de um seletor quiral (SQ) na fase estacionária, a fim de possibilitar a formação dos chamados complexos diasteroisoméricos (CDTs). Tais complexos diferem entre si quanto ao arranjo estrutural e quanto à estabilidade energética, tendo em vista o estabelecimento de distintas interações intermoleculares dos enantiômeros com o SQ.²²

Os tipos de SQs podem ser agrupados, basicamente, em três principais categorias que são mais utilizadas: i) derivados de polissacarídeos (principalmente amilose e celulose), ii) proteínas e iii) antibióticos macrocíclicos.²³ O uso de colunas quirais derivadas de polissacarídeos é extenso, pois os mesmos podem ser convertidos em diferentes derivados - como triésteres e carbamatos - que geram novos sítios de reconhecimento quiral, proporcionando mais interações - como ligações de hidrogênio, dispersão de London, π-π stacking - entre a fase estacionária e o analito, levando a velocidades de retenção e trajetórias distintas para cada um dos enantiômeros.²⁴

Alebic-Kolbah & Zavitsanos²⁵ realizaram a análise enantiosseletiva da OXI em plasma empregando a coluna Chiralpak^® AD no modo normal. A coluna quiral α₁-glicoproteína ácida foi utilizada no modo normal por Zobrist e colaboradores¹⁵ e Mizushima¹⁴ para a resolução dos enantiômeros da OXI em plasma. Fonseca e colaboradores²⁶ também desenvolveram a separação cromatográfica enantiosseletiva da OXI no modo normal para estudos de biotranformação in vitro empregando a coluna Chiralpak^® AD.

Nesse contexto, a fim de compreender, em nível molecular, o processo de separação enantiosseletiva, auxiliando, dessa forma, a pesquisa experimental a elucidar a ordem de eluição enantiomérica (OEE), a Química Computacional tem se mostrado uma excelente ferramenta complementar para estudos envolvendo separação quiral.^27-29 Diversos estudos têm sido relatados na literatura visando analisar, em nível molecular, o processo de formação dos CDTs (enantiômeros + seletor quiral), além de obter estruturas e propriedades energéticas envolvidas em suas formações. Em tais estudos, a fase estacionária quiral baseada na amilose tris-(3,5-dimetilfenilcarbamato) (ADMPC, do inglês amylose tris (-3,5-dimethylphenylcarbamate)) têm sido uma das mais aplicadas em simulações de dinâmica e docking molecular.^27-29 Métodos quanto-mecânicos puros, a exemplo da Teoria do Funcional de Densidade (DFT, do inglês Density Functional Theory), têm sido ainda pouco usados, devido ao custo computacional elevado associado.^30-32

Em trabalho recente, realizado em nosso grupo de pesquisa, Silva e colaboradores conduziram um estudo experimental/teórico visando a discriminação quiral do fármaco anti-helmíntico e antiparasitário, praziquantel (PZQ). Do ponto de vista teórico, parâmetros estruturais e energéticos, obtidos via cálculos DFT, apontaram a ordem de eluição dos enantiômeros do PZQ, cujos dados corroboraram perfeitamente com os dados experimentais obtidos.³³

Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi investigar, experimentalmente e teoricamente, via experimentos em HPLC e cálculos DFT, o mecanismo de separação enantiosseletiva da OXI, empregando a coluna Chiralpak^® AD (seletor quiral, ADMPC), visando, fundamentalmente, a determinação da OEE. Cabe ressaltar que, até o momento, não foram encontrados relatos na literatura de estudos teóricos envolvendo a enantiosseparação da OXI, conferindo assim, ineditismo ao presente trabalho.

MATERIAIS E MÉTODOS

Seção experimental

Materiais e reagentes

Para análise por HPLC, os seguintes solventes orgânicos foram utilizados para a preparação de fases móveis e de soluções-padrão: n-hexano, metanol, etanol e isopropanol provenientes da J. T. Baker^® Inc (Phillipsburg, EUA). Dietilamina foi utilizada no preparo da fase móvel também sendo também obtida da J. T. Baker^® Inc (Phillipsburg, EUA). Empregou-se água purificada no sistema MILLI-Q PLUS^® - Millipore / Millipore Corporation (Bedford, EUA).

Soluções-padrão

O racemato de cloridrato de oxibutinina (99%) foi gentilmente cedido por Watson Laboratories (Corona, CA, EUA). As soluções-padrão de oxibutinina foram preparadas em metanol nas concentrações de 1,0-400,0 μg mL^-1, a partir de uma solução estoque de 1,0 mg mL^-1. As soluções preparadas foram estocadas a-20^oC e na ausência de luz, podendo ser usadas em até três dias sem sinais de degradação.²⁶

Equipamentos

A análise enantiosseletiva da oxibutinina foi realizada em cromatógrafo Shimadzu^® (Kyoto, Japão), composto por uma bomba modelo LC-10AT, um detector por absorção no UV-Visível modelo SPD-10Avp operando em 227 nm e um controlador SCL-10Avp. As injeções foram feitas manualmente em injetor Rheodyne^® modelo 7125 (Cotati, USA) com amostrador de 20 µL. Os dados foram coletados e analisados pelo software Solutions Shimadzu^® (Kyoto, Japão). A separação enantiosseletiva foi realizada em uma coluna quiral Chiralpak^® AD (250 mm × 4,6 mm, 10 µm) em condições de fase normal.

Seção teórica

Todos os cálculos de otimização de geometria e frequências harmônicas foram realizados empregando-se a DFT, em nível M06 2X/6-31G(d,p)³⁴ para os enantiômeros (R) e (S) da OXI, para o modelo reduzido da ADMPC, bem como, para os respectivos CDTs formados entre os enantiômeros e fase estacionária quiral. Todas as estruturas foram completamente otimizadas e caracterizadas como mínimos verdadeiros na Superfície de Energia Potencial (SEP) através da análise das frequências harmônicas, sendo todas as frequências calculadas reais. O funcional M06-2X foi escolhido por incluir em seu formalismo efeitos de dispersão, os quais são comumente observados em complexos moleculares, como os CDTs.³⁵

O efeito do solvente foi considerado de forma implícita através do Modelo Contínuo de Solvatação baseado na Densidade (SMD, do inglês Solvation Model Density).³⁶ Utilizou-se o n-hexano (ε = 1,88) uma vez que, experimentalmente, a fase móvel continha esse solvente em maior proporção (ver seção experimental).

As propriedades energéticas obtidas para formação dos CDTs - energia eletrônica (∆E) e energia livre de Gibbs (∆G) - foram calculadas a partir das Equações (1) e (2).

Ao realizar cálculos de energia de complexação, envolvendo sistemas contendo interações não covalentes, utilizando o Modelo da Supermolécula³⁷ surge um erro associado, chamado de erro de superposição de bases (BSSE, do inglês Basis Set Superposition Error), o que causa um abaixamento artificial da energia de estabilização do complexo molecular em relação às espécies interagentes isoladas. Nesse sentido, o BSSE foi avaliado utilizando a abordagem de Boys e Bernardi.³⁸

Todos os cálculos foram realizados no pacote computacional Gaussian 09³⁹ e os programas GaussView 5.0 e ArgusLab 4.0.1, utilizados como ferramentas gráficas para construção de modelos moleculares e visualização dos resultados de cálculo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Seção experimental

A separação enantiosseletiva da OXI foi avaliada baseada em trabalho anterior,²⁶ na qual empregou-se a coluna Chiralpak^® AD em condições de fase normal. Dessa forma, várias modificações da fase móvel foram realizadas para se adequar a uma melhor separação cromatográfica. Depois de alguns experimentos, variando as proporções de fase móvel e solventes orgânicos modificadores, verificou-se que n-hexano: isopropranol: etanol: dietilamina (94:4:2:0,05, v/v/v/v) foi suficiente para promover uma separação de linha de base (Resolução, Rs > 3) dos enantiômeros. A Figura 2 apresenta a separação enantiosseletiva da OXI.

Figura 2. Cromatograma referente à separação enantiosseletiva da oxibutinina. Condições cromatográficas: coluna Chiralpak^® AD (250 mm × 4,6 mm, 10 µm); fase móvel constituída por n-hexano: isopropranol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v); vazão de 1 mL min^-1 e detecção em 210 nm. Em azul destaca-se a separação dos enantiômeros da OXI em solução-padrão e em preto a linha de base referente à fase móvel estudada

A ordem de eluição foi baseada em trabalhos anteriores,^25,26 nos quais foram realizadas análises enantiosseletivas empregando soluções-padrão dos enantiômeros puros de (R)-OXI e (S)-OXI. Os enantiômeros da OXI foram coletados de acordo com as condições estabelecidas por Alebic-Kolbach & Zavitsanos²⁵ e a OEE posteriormente, foi confirmada por Fonseca e colaboradores.²⁶ Após a coleta dos enantiômeros separados e já identificados, eles foram injetados na condição descrita na Figura 2. Como conclusão final, constatou-se que o (R)-enantiômero do fármaco elui mais rapidamente que seu antípoda (S)-enantiômero.

A ordem de eluição da OXI obtida ainda é confirmada por trabalhos encontrados na literatura. A exemplo, tem-se o trabalho de Ali e colaboradores,⁴⁰ em que, ao utilizar a CLAE com o mesmo seletor quiral e fase móvel bastante semelhante - sem o etanol e com proporções ligeiramente diferentes dos demais solventes - o enantiômero (S) apresentou-se mais retido no sistema cromatográfico do que o (R). Zhang e colaboradores⁴¹ também propuseram a mesma OEE pra (S)-OXI e (R)-OXI.

Seção teórica

Embora os modelos teóricos utilizados para descrição da estrutura dos SQs derivados de polissacarídeos sejam complexos, ou seja, contêm um grande número de átomos e com a estrutura helicoidal evidenciada (Figura 3(A)), diversos autores concordam que o mecanismo de discriminação quiral desta classe de SQs passam, majoritariamente, por interações dos analitos com os grupos amino (-NH) e carbonila (C=O) da fase estacionária, além de possíveis interações π-π, no caso de racematos aromáticos e estéricas repulsivas.^42,43 Nesse sentido, no presente trabalho, o modelo comumente utilizado da ADMPC (Figura 3(A)) foi reduzido a um esqueleto de amilose ligado a apenas uma cadeira lateral do grupo tris-(3,5-dimetilfenilcarbamato) (Figura 3(C)), a fim de reduzir o custo computacional e o tempo de cálculo atrelado ao sistema supramolecular. Cabe ressaltar que esse procedimento metodológico já foi feito com sucesso em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa, envolvendo separações enantioméricas.^32,33

Figura 3. Em (A) modelo completo de estrutura helicoidal, comumente usado em simulações de dinâmica e docking molecular,^27-29 em (B) parte do modelo completo original, evidenciando o grupo tris-(3,5-dimetilfenilcarbamto) e em (C) modelo original reduzido a um esqueleto de amilose ligado a uma cadeira lateral do grupo tris-(3,5-dimetilfenilcarbamato) na qual haverá interação com os enantiômeros do analito, usado em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa^32,33

Uma vez obtidas as estruturas otimizadas, em nível M06 2X/6 31G(d,p), para os enantiômeros da OXI, bem como para o modelo reduzido da ADMPC (MR-ADMPC) e levando-se em conta os valores numéricos de densidade de carga sob cada átomo em destaque nos mapas de potencial eletrostático molecular (MPE) para as espécies interagentes (Figura 4), foi proposta a formação de duas ligações de hidrogênio, a fim de maximizar a interação entre a OXI e o MR-ADMPC: (i) a primeira ligação (LIGAÇÃO A), considerou-se a interação entre um átomo de hidrogênio (H1) ligado a um átomo de oxigênio (O2) do analito e um átomo de oxigênio (O1') da MR-ADMPC; (ii) já a segunda ligação (LIGAÇÃO B) levou em conta a interação entre átomo de oxigênio (O1) da OXI, e um átomo de hidrogênio (H1') ligado a um átomo de nitrogênio (N1') da fase estacionária (ver numeração dos átomos supracitados na Figura 4).

Figura 4. Mapas do Potencial Eletrostático obtidos para as estruturas otimizadas da: (A) OXI e (B) MR-ADMPC, com destaque para as densidades de carga sob os átomos considerados sítios de interação. Os átomos de hidrogênio foram omitidos para facilitar a visualização

Considerando as duas ligações (A e B) propostas, foram obtidos dois CDTs distintos, os quais foram nomeados (R)-OXI...[MR-ADMPC] e (S)-OXI...[MR-ADMPC]. A Tabela 1 mostra as propriedades energéticas, ∆E e ∆G, calculadas para os respectivos CDTs, cujos valores foram estimados em meio contendo n-hexano, através do modelo de solvatação implícito SMD.

Analisando os dados dispostos na Tabela 1, é possível observar, a partir dos valores de ΔE e ΔG, que o complexo (S)-OXI...[MR-ADMPC] é ligeiramente mais estável que o complexo (R)-OXI...[MR-ADMPC]. Este fato pode explicado através das interações intermoleculares estabelecidas em cada CDT (Figura 5).

Figura 5. Geometrias otimizadas dos CDTs: (A) (R)-OXI...[MR-ADMPC] e (B) (S)-OXI...[MR-ADMPC], evidenciando as ligações de hidrogênio e interações N'-O estabelecidas, as quais são representadas por linhas tracejadas e pontilhadas, respectivamente. Os átomos de hidrogênio não envolvidos nas interações foram omitidos para facilitar a visualização

Apesar de ambos CDTs apresentarem o mesmo tipo e mesmo número de interações intermoleculares, as ligações de hidrogênio formadas a partir dos átomos O2, O1 e H1 da OXI, assim como, a interação dipolar O2-N1', são essenciais para uma melhor compreensão da maior estabilidade do complexo (S)-OXI...[MR-ADMPC] em relação ao (R)-OXI...[MR-ADMPC]. Nota-se claramente na Tabela 2 que as distâncias de interação são sempre menores para o complexo (S)-OXI...[MR-ADMPC] em comparação ao (R)-OXI...[MR-ADMPC], com destaque para a interação O1-H1', cerca de 0,4 Å menor, tornando-a o principal responsável pela diferença de energia entre os complexos. Desse modo, evidencia-se que as interações mais curtas, portanto, mais fortes do ponto de vista eletrostático, acabam promovendo, uma sutil maior estabilidade para o complexo (S)-OXI...[MR-ADMPC]. Além disso, como pode ser visto na Tabela 1 (valores entre parênteses), a estabilidade relativa entre os complexos não muda quando o BSSE foi considerado.

Devido à semelhança estrutural dos CDTs, era de se esperar que a diferença energética entre eles fosse, de fato, pequena. Apesar disso, a ligeira diferenciação energética, bem como na magnitude das forças de interações estabelecidas, sugere, em nível molecular, a discriminação quiral.

Finalmente, considerando os resultados energéticos e estruturais obtidos, verifica-se que a OEE corrobora com os resultados previstos experimentalmente, com o uso da fase estacionária ADMPC e n-hexano como fase móvel. Assim, conclui-se que (R) OXI eluirá primeiro do que o (S)-OXI, uma vez que o complexo (R)-OXI...[MR-ADMPC] é menos estável e, portanto, com menor retenção no sistema cromatográfico.

CONCLUSÕES

No presente trabalho realizou-se um estudo teórico/experimental com o intuito de entender o processo de separação enantiosseletiva, bem como a ordem de eluição do fármaco antimuscarínico OXI, o qual tem sido amplamente utilizado em doenças do trato urinário. Na primeira etapa, a separação enantiosseletiva da OXI foi avaliada via HPLC, empregando-se a coluna Chiralpak^® AD. Após vários testes, variando-se as proporções da fase móvel e solventes orgânicos modificadores, constatou-se que n-hexano: isopropranol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v) foi suficiente para promover uma separação de linha de base (Resolução, Rs > 3) dos enantiômeros. Assim, a ordem de eluição enantiomérica foi conseguida, evidenciando no sistema cromatográfico que (R)-enantiômero do fármaco elui mais rapidamente que seu antípoda (S)-enantiômero.

Na segunda etapa, a fim de compreender o processo de separação enantiosseletiva da OXI, em nível molecular, cálculos DFT foram realizados, em nível M06-2X/6-31G(d,p). De acordo com os resultados obtidos, foi possível entender a natureza das interações envolvidas no processo de separação, por meio da obtenção das estruturas otimizadas, em meio de n-hexano, dos CDTs formados entre os enantiômeros da OXI e o modelo reduzido da fase estacionária. As estabilidades dos complexos, analisadas através dos valores de ∆E e ∆G, foram explicadas pela formação de ligações de hidrogênio estabelecidas. Além disso, o estudo teórico contribuiu para explicação, em nível molecular, da ordem de eluição obtida experimentalmente. Por fim, o presente trabalhou mostrou como a Química Computacional pode ser extremamente útil na elucidação do reconhecimento quiral em separações enantiosseletivas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES, Finance Code 001) pelo suporte financeiro. Este trabalho é resultado também da colaboração científica entre pesquisadores membros da Rede Mineira de Química (RQ‐MG), cujo projeto é financiado pela FAPEMIG.

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