JBCS

INTRODUÇÃO

A interface entre os protocolos de expressão e purificação de proteínas, proteômica e técnicas de resolução estrutural (difração de raios X, ressonância magnética nuclear, microscopia eletrônica criogênica, espalhamento de raios X de baixo ângulo e laser de raios X de elétrons livres), tem contribuído significativamente com a identificação e resolução estrutural de alvos terapêuticos biomoleculares.^1-3 Muitos desses alvos contemplam os depósitos de suas coordenadas cartesianas atômicas em bancos de dados com acesso público (ex. Protein Data Bank).⁴

Como consequência, o uso de rotinas in silico nos estágios iniciais da descoberta de fármacos, estruturalmente específicos, tem recebido máxima relevância. Visualizar micromoléculas ligantes interagindo com seus alvos biológicos é parte fundamental da estratégia SBDD (structure-based drug design).^5-8 Esses complexos fornecem detalhes acerca das variáveis que governam o processo de reconhecimento molecular nos sítios de ligação da biomacromolécula receptora. Além disso, quando predições computacionais complementam dados experimentais, obtêm-se caminhos mais sustentáveis no processo de descoberta de fármacos, tendo em vista a redução do uso de recursos, assim como a economia de tempo na triagem e identificação de compostos líderes.^6,9-11

A ancoragem molecular (A.M.), também designada como atracamento ou docagem, é uma metodologia in silico essencial nessa perspectiva, uma vez que fornece o prognóstico dos modos de ligação de micromoléculas (ou macromoléculas) ao interagirem com um sítio receptor.¹² As poses (conformações e orientações) do ligante são encontradas por algoritmos de busca, enquanto que a classificação dessas soluções é conduzida em termos de afinidade pelo sítio de ligação via funções de pontuação (ou funções de score).^2,12,13

Os valores numéricos obtidos pelas funções de pontuação são decorrentes da modelagem matemática das interações, que ocorrem durante a formação de complexos estáveis.^2,14-16 Por sua vez, as funções de pontuação podem ser empíricas, baseadas em campos de força e baseadas no conhecimento. Contudo, as simplificações matemáticas que deixam os cálculos de A.M. mais acelerados tornam as predições de afinidade desses complexos menos acuradas.¹⁷ Consequentemente, para investigar detalhes energéticos das interações/ligações do sistema receptor-ligante, outros métodos computacionais devem ser combinados. Uma prática usual, e confiável, consiste na junção entre a A.M. e a Dinâmica Molecular (D.M.), aplicada ao complexo exportado.^2,3,9,18

Em relação aos algoritmos de busca, se tem pelo menos duas categorias básicas: sistemática e estocástica.¹⁹ Os algoritmos de busca "sistemáticos" são determinísticos, modelam o espaço de busca em intervalos limitados (predefinidos). Os algoritmos estocásticos amostram o espaço de busca por alterações aleatórias nas variáveis de estado até que o critério de término seja atendido.^12,19 Atualmente, os algoritmos estocásticos são considerados pela comunidade científica como mais hábeis na obtenção de soluções representativas, todavia Santos e colaboradores³ afirmam que a comparação entre diferentes algoritmos de busca em softwares de A.M. não é uma tarefa linear, haja vista que diferentes métodos podem ser mais eficientes para uma classe de receptores que outras.

Entre os métodos estocásticos, podem ser destacados os algoritmos genéticos (A.G.).^15,17,19-21 Um A.G. leva essa alcunha por mimetizar o processo de evolução natural. Primeiramente, uma pose é qualificada como cromossomo, o que descreve a posição do ligante no espaço de busca. Uma população inicial de cromossomos é gerada aleatoriamente. Então, a população é submetida a uma série de operações genéticas: mutações (mudanças aleatórias nos cromossomos) e recombinações (mistura entre cromossomos), produzindo novas gerações de poses, as quais são inspecionadas por funções de pontuação que selecionam as mais aptas ao sítio receptor. A rotina é concluída após o desenvolvimento de um número adequado de gerações, parâmetro que é pré-definido pelo usuário.

A A.M. pode ser inserida em diversos seguimentos: processo de descoberta de fármacos, incluindo estudos de QSAR, triagem virtual em larga escala, elaboração de bibliotecas combinatórias, hipóteses de ligação para pesquisas em mutagênese, cristalografia de raios X no ajuste de substratos e antagonistas, dentre outros. No Brasil, existem muitos grupos de pesquisa importantes dentro dessa temática e que utilizam essas ferramentas em suas investigações. Apesar disso, nota-se que são insuficientes os materiais, no idioma português, sobre o modus operandi de como aplicar metodologias de A.M.

Portanto, nesta nota técnica, está elaborado um fluxo de trabalho simples para avaliação de um complexo receptor-ligante, por A.M., utilizando como modelo a estrutura do receptor nicotínico de acetilcolina humano α4β2 (PDB ID: 5kxi), resolvida por difração de raios X (3,9 Å), complexada à molécula de nicotina (K_i = 18,2 ± 5,08 nmol L^-1),²²Esquema 1.

Esquema 1. Representação esquemática 2D da estrutura química da nicotina em forma de linhas e identificação numérica dos átomos

Os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) são receptores do neurotransmissor endógeno acetilcolina, sendo divididos em dois grupos: musculares e neuronais.²² O receptor neuronal subtipo α4β2 é majoritário no cérebro de mamíferos, sendo altamente sensível a exposição da molécula de nicotina (agonista). Outrossim, devido as suas funções biológicas estarem relacionadas com diversas desordens neurológicas, como Alzheimer, Parkinson, esquizofrenia e principalmente dependência química à nicotina, o entendimento das propriedades de interação receptor-ligante é fundamental na busca por formas terapêuticas.²²

Visando um público de novos usuários, o texto compreende a instalação dos softwares utilizados (ver seção material suplementar 1S), obtenção e preparo da biomacromolécula e do ligante, realização dos cálculos de A.M., análise de resultados e o preparo de figuras para publicação. Para execução desse trabalho foram empregados softwares e servidores online de livre acesso e/ou versões acadêmicas. Não obstante, o pacote CSDS SYSTEM, contendo os softwares privados Mercury,²³ Hermes e GOLD,^15,17 foi obtido no domínio (dotlib.com.br), segundo a política de acesso vinculada ao Portal Periódicos CAPES.

É importante salientar que esse tutorial prático também possui o objetivo de atingir profissionais de outras áreas do conhecimento, debruçando-se em uma narrativa mais abrangente. Consequentemente, não serão abordados à fundo os aspectos teóricos, acerca dos problemas associados ao processo químico computacional. Advertimos, ainda, que a metodologia foi elaborada para utilização no sistema operacional Windows 10 (64 bits). Por fim, é seguramente aconselhado que, apesar da metodologia elaborada ser útil como um guia inicial, existe espaço para quaisquer aprimoramentos e/ou modificações, que visem atender, de forma mais adequada, outros problemas de A.M.

PARTE EXPERIMENTAL

Aquisição de estrutura 3D da biomacromolécula a partir do servidor online Protein Data Bank (PDB ID: 5kxi)

Ao acessar o domínio https://www.rcsb.org/ na barra de busca, deve-se inserir o código PDB 5kxi.²² Uma vez redirecionado para a página que contém um resumo de informações sobre essa estrutura, o arquivo PDB FORMAT na opção DOWNLOAD FILES pode ser descarregado. Salve o arquivo (5kxi.pdb) em uma pasta criada especificamente para o trabalho.

Análise das interações na estrutura cristalográfica com o servidor online PDBsum

Para avaliar as interações originais ligante-receptor, presentes na estrutura da biomacromolécula alvo, acesse o domínio http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/ digite o código PDB 5kxi e clique em FIND.²⁴ Em seguida, na barra superior, se deve clicar na aba LIGANDS e selecionar o ligante que se deseja obter as interações com o sítio ativo [NCT 402 (A)]. Para descarregar o arquivo *.pdf, contendo tais informações, clique com o botão direito do mouse sobre o símbolo PDF, em seguida clique em salvar link como, e escolha a pasta de trabalho.

Avaliação da qualidade da estrutura cristalográfica com o servidor online PROCHECK

Acesse o domínio https://saves.mbi.ucla.edu/ Faça upload da estrutura cristalográfica obtida na etapa anterior (5kxi.pdb) e clique em RUN PROGRAMS. Em seguida, selecione a opção PROCHECK²⁵ e clique em START. Ao término do processo, clique em RESULTS. Após exibição dos resultados de análise, clique em RAMACHANDRAN PLOT.²⁶ Nesse momento, devem ser observados os resíduos em regiões permitidas ou "outliers", assim como o percentual de resíduos em cada uma dessas regiões (favoured, allowed and outlier). É possível fazer o download do arquivo *.pdf contendo estas informações clicando no link PDF, localizado acima do gráfico de Ramachandran.

Construção de ligantes utilizando o software BIOVIA Discovery Studio Visualizer

Abra o software Discovery Studio Visualizer (DSV)²⁷ e crie uma nova janela de trabalho FILE > NEW > MOLECULE WINDOW. Clique na guia SMALL MOLECULES e selecione a opção SKETCH, localizada na guia SKETCH MOLECULES do painel à esquerda da tela de trabalho.

Obs.: Para instruções/comandos básicos sobre a construção de moléculas, utilizando o DSV, ver seção material suplementar 2S.

Construção da molécula de nicotina

i) Com a opcao SKETCH selecionada, desenhe o anel piridinico. Para criar ligacoes duplas, selecione a ligacao desejada e aperte a tecla 2 no teclado (3 para ligacoes triplas). Alternativamente, com a opcao SKETCH selecionada, clique sobre a ligacao desejada (dois cliques para ligacoes triplas). Ainda, e possivel selecionar todas as ligacoes simultaneamente com a tecla shift e mudar seus atributos em um unico comando. Deve-se clicar com o botao direito do mouse sobre a selecao e pressionar a opcao BONDS, localizando a lista de ligacoes disponiveis;

ii) Para mudar um atomo de carbono por nitrogenio, selecione o atomo desejado e pressione a tecla “N”. Neste caso, a funcao SELECT deve estar habilitada. Tambem e possivel fazer essa mudanca clicando com o botao direito sobre um atomo ja selecionado e alterando-o em ELEMENT;

iii) A esquerda da area de edicao, clique em H ADD para adicionar hidrogenios e em CLEAN GEOMETRY para otimizar os angulos e as distancias da molecula. O comando CLEAN GEOMETRY pode ser utilizado para otimizar uma subunidade da estrutura em particular;

iv) Com a opcao SKETCH ainda selecionada, clique no atomo de hidrogenio da posicao 3 do anel piridinico e transmute-o para carbono, permitindo assim a construcao do anel pirrolidinico. A seguir, adicione os hidrogenios utilizando a funcao H ADD (Figura 1).

v) Clique em dois atomos de hidrogenio desse novo atomo de carbono para transmuta-los em mais dois atomos de carbono (seguido da adicao dos hidrogenios). Faca isso mais uma vez, ate que tenhamos 5 atomos de arbono, alem do anel piridinico. Para fechar o ciclo, clique no primeiro atomo desejado e em seguida no segundo (ambos os cliques com a funcao SKETCH selecionada). Em seguida, clique em CLEAN GEOMETRY; Atenção! O hidrogenio ligado ao carbono terciario (C7) deve estar para cima em relacao ao nitrogenio piridinico (N1). Selecione  a funcao TORSION e altere o angulo diedro formado pelos atomos “A”, “B”, “C” e “D”, mantendo o botao esquerdo do mouse pressionado (Figura 2A).

vi) Selecione o atomo de carbono (sp3) da posicao 8, ligado diretamente ao carbono terciario, e transmute-o em nitrogenio. Com a funcao SELECT habilitada, selecione o nitrogenio criado e clique sobre o mesmo com o botao direito do mouse. Em seguida, va ate a aba CHARGE e selecione a opcao +1; Atenção! Quando um atomo de nitrogenio em configuracao eletronica sp3 forma tres ligacoes, o mesmo possuira um par de eletrons livres e carga zero. Contudo, no caso em questao, o atomo de nitrogenio N8 esta protonado. Logo, esse atomo contribuiu com seu par isolado para formar uma quarta ligacao, essa tera a natureza de ligacao covalente coordenada. Como consequencia, o N8 deve receber uma carga positiva, embora o mesmo seja mais eletronegativo que o atomo de H e o atomo de carbono C12 diretamente ligados a ele.

vii) Com a funcao SELECT habilitada, clique no atomo de hidrogenio mais alto, ligado ao nitrogenio pirrolidinico N8, aqui referimo-nos ao atomo de H que esta direcionado para o usuario conforme indicado na Figura 2B, e transmute-o em carbono, seguido da adicao de hidrogenios, Figura 2C; Atenção! Para melhor representar a nicotina, isso e, na mesma orientacao e conformacao encontrada na estrutura cristalografica (PDB ID: 5kxi),22 e importante que o atomo de hidrogenio pirrolidinico, ligado ao nitrogenio, esteja direcionado para baixo do anel.

viii) Sugere-se uma mudanca no nome do ligante para “NCT” a fim de facilitar a analise posterior dos resultados de ancoragem molecular. Para isso, clique na seta que abre a janela de hierarquia e clique duas vezes sobre o nome da molecula. Altere o nome para NCT e pressione a tecla Enter. Em seguida, selecione toda a estrutura e utilize o comando CLEAN GEOMETRY. Salve a molecula em formato *.mol2 (NCT.mol2) em FILE > SAVE.

Figura 1. Posição do átomo de hidrogênio, transmutado para carbono (em amarelo, quando selecionado)

Figura 2. (A) Átomos envolvidos no ângulo diedro (ângulo de torção) entre os anéis da estrutura proposta. (B) Indicação do átomo de hidrogênio do nitrogênio N8, o qual deverá ser transmutado para carbono (C12) com posterior adição de hidrogênios. (C) estrutura da nicotina resultante

Especiação in silico do estado de protonação do ligante, utilizando o MarvinSketch

Abra o software MarvinSketch²⁸ e construa a molécula de nicotina (ver material suplementar, seção 3S). Para simular o estado de protonação da nicotina em pH fisiológico, clique na aba CALCULATIONS > PROTONATION > pKa. Não faça nenhuma alteração na janela que se abre e pressione OK > OK. Selecione e mantenha pressionada a barra de rolagem até encontrar o pH 7,4, considerado como o valor de pH fisiológico padrão para esse tipo de predição. Observe que a micro-espécie mais significativa é a segunda (Figura 3), que corresponde à nicotina protonada no anel pirrolidínico.

Figura 3. Janela com os resultados do cálculo de pKa

Otimização geométrica do ligante, por meio dos softwares CCDC Mercury e MOPAC2016

O cálculo de otimização geométrica da molécula de nicotina será conduzido em nível semi-empírico, utilizando o pacote MOPAC2016,²⁹ a partir da interface gráfica do software CCDC Mercury.²³ Assim, carregue no Mercury, o arquivo NCT.mol2. Para melhor visualização, sugere-se utilizar o estilo "bolas e bastões", selecione DISPLAY > STYLES > BALL AND STICK, na barra de ferramentas. Em seguida, para editar o arquivo de entrada do MOPAC2016, pressione consecutivamente CSD-MATERIALS > CALCULATIONS > MOPAC (Figura 4).

Figura 4. Iniciar o MOPAC pela interface do Mercury

Na opção MOPAC clique em reticências [...] (Figura 5), e carregue o arquivo executável MOPAC2016.exe, previamente instalado.

Figura 5. Carregar programa MOPAC pela interface do Mercury

Para iniciar os cálculos de otimização geométrica, selecione o hamiltoniano PM7 na opção HAMILTONIAN.³⁰ Marque as opções OPTIMISE GEOMETRY e CALCULATE BOND ORDERS. Digite os comandos "CHARGE=+1" e "XYZ" na caixa de texto EXTRA KEYWORDS e clique em SUBMIT. Escolha um local para salvar os resultados do cálculo, com extensão *.mol2. Sugere-se uma nova pasta, por exemplo "ligantes_do_tutorial_PM7".

Ancoragem molecular

Redocagem da nicotina por meio do programa CCDC GOLD

Redocagem da nicotina por meio do programa CCDC GOLD

i) Inicialmente, inicie o software GOLD.15,17 Automaticamente, a interface grafica Hermes sera acionada. Para realizar o carregamento da proteina de interesse siga WIZARD > PROTEINS > LOAD PROTEIN e selecione o arquivo 5kxi.pdb. Nessa mesma janela, marque a opcao FIX ALL PROTEIN ROTABLE BONDS, para trabalhar com a ancoragem molecular em modo rigido. Em seguida, ainda na mesma janela, clique na aba 5KXI ao lado de GLOBAL OPTIONS e selecione a opcao PROTONATION & TAUTOMERS, clicando em seguida no botao ADD HYDROGENS, conforme demonstrado na Figura 6.

ii) Em seguida, na opcao EXTRACT/DELETE WATERS, delete todas as moleculas de água. (Obs.: Em muitos casos, moleculas de água funcionam como ponte, que medeiam interacoes, entre o ligante e residuos-chave. Sendo assim, essas “águas” sao importantes no calculo de docking e sugerimos fortemente que seja realizada, previamente, uma inspecao visual, para confirmacao. Ao confirmar a inexistencia de tal condicao, pode-se executar o procedimento de exclusao de todas as moleculas de água co-cristalizadas).

iii) Após esse procedimento, na opcao DELETE LIGANDS, marque todas as caixas de texto dos ligantes a serem removidos e clique na opcao EXTRACT. Para cada ligante, o programa solicitara uma identificacao e o diretorio no qual o mesmo sera salvo. Aqui e recomendado usar os nomes originais para os ligantes, salvando o ligante “A_1” em um local de facil acesso, tendo em vista que ele sera usado como referencia para os calculos dos desvios (RMSD), na etapa de redocagem.

iv) Retorne para a aba GLOBAL OPTIONS e clique na opcao DEFINE BINDING SITE. Nessa janela, marque a opcao POINT. Digite as coordenadas x = 67.3680, y = -27.2034 e z = -39,0781 e clique em VIEW. (Obs.: As coordenadas x, y, z sao definidas como a centro da esfera de simulacoes, a qual contempla o sítio de ligacao. Neste tutorial escolheu-se um ponto que coincide exatamente com a posicao cartesiana do atomo de nitrogenio pirrolidinico (N8) da ligante nicotina que esta co-cristalizado na estrutura da biomacromolecula PDB ID 5kxi. Todavia, e importante destacar que para cada sistema se deve analisar a melhor posicao com base, principalmente, em criterios experimentais). E possivel alterar o raio a ser considerado para o sítio de ligacao na caixa de texto SELECT ALL ATOMS WITHIN. Aqui, recomenda-se o raio de 10 A para o cálculo. (Obs.: E possivel medir o tamanho de uma molecula dentro do proprio Hermes. Para isso, clique na opcao SHOW HYDROGENS na parte superior do software e em seguida mude o PICKING MODE para MEASURE DISTANCES. Feito

isso, basta clicar sobre os dois atomos cuja distância se quer medir e o valor em angstrom aparecera acima de uma linha tracejada na tela). O valor da distância medida pode ser verificado na forma de lista em DISPLAY > MORE INFORMATION > DISTANCE LIST.

v) Alternativamente, e possivel definir o sítio de ligacao com base na posicao de algum atomo de referência que se julgue adequado. No caso apresentado, o centro sera definido nas coordenadas do nitrogenio pirrolidinico, do ligante de referência (“A_1”). Atenção! E importante salientar que uma vez escolhida a referência para uma redocagem, deve-se mante-la durante as ancoragens subsequentes (por exemplo, se estivermos usando “A_1” como referência e imperativo NÃO usar “D_1” para definir o sítio de ligacao para outras simulacoes, dentro da mesma rotina de cálculo). Essa observacao e desnecessaria para calculos subsequentes que utilizam o mesmo arquivo *.conf gerado pela redocagem, entretanto, e de extrema importancia na ocasiao de ancoragens que sejam programadas do inicio, ou seja, novos arquivos *.conf. vi) Na aba DEFINE BINDING SITE, com a opcao POINT selecionada, minimize a janela GOLD Setup a fim de deixar visivel a estrutura tridimensional da proteina na interface grafica. Utilize os botoes do mouse, esquerdo (rotacionar) e direito (aproximar ou afastar), para fazer com que toda a extensao da proteina fique visivel no Hermes, (Figura 7):

vii) Dentro da janela MOLECULE EXPLORER, na aba DISPLAY, e possivel observar que o software ainda exibe os ligantes removidos. Clique duas vezes na checkbox ao lado de ALL ENTRIES, para que o Hermes esconda todas as estruturas. Em seguida, clique sobre a checkbox ao lado de “A_1”.

viii) Utilize o mouse para centralizar e aproximar a molecula visualizada, a fim de facilitar a selecao do atomo correto. Em sequência, clique no atomo de nitrogenio do anel pirrolidinico do ligante para defini-lo como centro do sítio de ligacao. Feito isso, maximize a janela GOLD setup que deve estar localizada abaixo do MOLECULE EXPLORER. Se a definicao for bem-sucedida, uma esfera vermelha podera ser visualizada ao redor do ponto em questao, quando a janela estiver maximizada. Alem disso, as coordenadas obtidas devem ser as mesmas ja mencionadas neste tutorial, mostradas na Figura 8.

ix) Após a definicao do sítio de ligacao, dirija-se a opcao SELECT LIGANDS e clique em ADD, para adicionar a molecula de nicotina, previamente otimizada (NCT.mol2). Idealmente, trabalha-se entre 50 e 100 poses de ancoragem, contudo, para esta nota tecnica, selecione 10 poses de ancoragem. Posteriormente, clique nas reticencias [...], ao lado de REFERENCE LIGAND, e selecione como referência o ligante extraido A_1.

x) Va para a opcao FITNESS & SEARCH OPTIONS e desmarque a opcao ALLOW EARLY TERMINATION e selecione a funcao de pontuacao CHEMPLP, em SCORING FUNCTION. O programa GOLD contém 4 funcoes basicas de pontuacao: GoldScore, ChemScore, CHEMPLP e ASP, sendo possivel utilizá-las de forma exclusiva ou em conjunto, dependendo do objetivo do usuario. As funcoes sao parametrizadas distintamente, de modo que e sempre necessario avaliar qual delas sera mais eficiente para o sistema estudado.31

xi) Em seguida, clique na opcao RUN GOLD Na janela que se abre, selecione a pasta na qual devem ser salvos os resultados (ex.: docking_tutorial) e marque a caixa PROTEIN (caso a mesma esteja desmarcada) para salvar a estrutura preparada para o cálculo. Clique em SAVE para iniciar o cálculo, conforme mostrado na Figura 9. Uma vez finalizado o cálculo, clique em VIEW SOLUTIONS. Em seguida, clique em CLOSE para fechar a janela do cálculo, fazendo o mesmo para a janela de programacao do cálculo, deixando apenas a interface, Hermes, aberta. Os resultados serao mostrados na janela MOLECULE EXPLORER, na aba

DOCKING SOLUTIONS, que devera ser mostrada, automaticamente, após o término do cálculo. Os valores dos desvios medios quadraticos (em A) obtidos entre as poses da molecula NTC e a referência A_1 podem ser visualizados arrastando a barra de rolagem dessa janela para o lado direito, Figura 10.

xii) Selecione o resultado com a maior pontuacao (PLP.Fitness) e clique em FILE > EXPORT COMPLEX > NOME_DO_ARQUIVO (EX.: COMPLEXOS_EXPORTADOS) > SALVAR. Todos os arquivos exportados do GOLD, no formato *.mol2, podem ser abertos em qualquer computador, mesmo sem os arquivos de entrada elaborados previamente ao calculo de ancoragem. Contudo, e importante salientar que outros arquivos obtidos no *.conf nao poderao mais ser abertos pelo GOLD se forem copiados para outras pastas, ou se as pastas forem renomeadas.

Figura 7. Visualização da estrutura da proteína no GOLD

Figura 8. Ponto central da esfera de interação definido como sítio ativo da simulação

Figura 9. Confirmar início do cálculo das poses de ancoragem

Figura 10. Janela de resultados

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise dos resultados da ancoragem molecular, utilizando o software DSV

Tão importante quanto a elaboração da metodologia computacional, a etapa de interpretação dos dados exportados, em estudos de ancoragem molecular, consiste na avaliação da orientação e conformação da micromolécula no sítio de ligação.³² Além disso, consiste também em identificar quais são os resíduos chave e as forças intermoleculares que suportaram o reconhecimento complexo receptor-ligante.^12,32

Nesse sentido, após o carregamento do arquivo exportado do GOLD, no software DSV, analisam-se tanto as interações intermoleculares quanto os demais parâmetros mencionados, utilizando a ferramenta LIGAND INTERACTIONS, a qual está disponível na aba RECEPTOR-LIGAND INTERACTIONS, conforme a Figura 11.

Figura 11. Localização da ferramenta Ligand interactions

Ressalta-se que essa ferramenta permite inspecionar os complexos obtidos, por cálculos A.M. e aqueles determinados experimentalmente, desde que haja um arquivo de entrada, contendo as coordenadas cartesianas atômicas, no formato *.pdb.⁴

Na etapa de inspeção, após observar a conformação ativa do ligante, o usuário pode priorizar os contatos não-covalentes mais relevantes. Para tal, habilitando o painel de monitoramento do DSV, a aba NON-BOND permite ao usuário caracterizar as interações presentes no complexo, ao mesmo tempo, verificando quais são os parâmetros geométricos (distância e ângulo) associados. Na Tabela 1, podem ser visualizados alguns parâmetros geométricos, tipo de interação, cor atribuída e categoria das interações favoráveis, habitualmente listadas, em complexos receptor-ligante.

No exemplo em questão, o qual apresenta o menor valor para raiz do desvio-médio quadrático (RMSD ≈ 1,5 Å), pode ser observado que o ligante simulado (NCT.mol2) exibe uma pose (orientação e conformação) estabilizada no bolsão de ligação do receptor nicotínico de acetilcolina α4β2, entre as interfaces α-β, a partir da formação de contatos não-covalentes com resíduos chave, Figura 12.

Figura 12. Tela de trabalho do DSV com o complexo nicotina-α4β2 e esquema 2D da molécula de nicotina. As interações intermoleculares estão exibidas como linhas tracejadas, diferenciadas por cores em tipo e natureza (Verde = interação de hidrogênio clássica; Laranja = interação eletrostática; Roxa = Interações hidrofóbicas; Rosa = Interações parcialmente hidrofóbicas). Obs.: Para uma melhor visualização, apenas os hidrogênios polares são mostrados, CHEMISTRY > HYDROGENS > SHOW POLAR

Na tela de trabalho do DSV, as linhas tracejadas representam os contatos não-covalentes, sendo cada cor referente a uma categoria (natureza) de interação (ex. a linha tracejada verde indica a formação de uma interação de hidrogênio clássica do tipo D-H•••A, sendo D = doador e A = aceitador). É importante salientar que o software DSV, em configuração padrão, utiliza essa paleta de cores tão-somente para diferenciar as interações. Todavia, o usuário poderá definir a cor da interação, clicando na coluna referente a cor na aba NON-BOND e selecionar aquela que melhor represente o sistema de interesse.

Como segue, o complexo nicotina-α4β2 indica que o nitrogênio pirrolidínico (N8), o qual se encontra protonado, estabelece três interações de natureza eletrostática cátion···π com os anéis aromáticos das cadeias laterais dos resíduos de W149 e Y197, Figura 12. Além disso, devido a protonação do átomo de N8, ocorre a formação de uma interação de hidrogênio clássica (N-H···O) com o átomo de O carbonílico da cadeia principal do resíduo de W149. Duas interações hidrofóbicas do tipo σ···π são observadas entre a metila, C12, e o anel aromático da nicotina com as cadeias laterais dos resíduos de Y197 e L484, respectivamente. Finalmente, um contato do tipo π···PI (par isolado) entre a subunidade aromática da nicotina e o átomo de enxofre presente na cadeia lateral do resíduo de C193 auxilia a estabiliza da nicotina no bolsão de ligação.

O algoritmo genético do software GOLD modula as orientações e conformações do ligante, visando encaixá-lo em um ou mais mínimos de energia do sítio ativo do receptor.¹⁵ Prontamente, as populações de cromossomos são criadas e avaliadas pelos operadores genéticos (mutação, recombinação ou crossover), mapeando-se os parâmetros de geometria do ligante. Nessa conjuntura, o A.G. combina a sobrevivência entre as melhores soluções com intercâmbio de informações genéticas para formar estruturas heurísticas aperfeiçoadas, ou seja, os ligantes com melhores adaptabilidade (orientação e conformação) no sítio de ligação. Os valores das pontuações, compostas pela modelagem das interações receptor-ligante e afinidade, são conduzidas pela função de pontuação pré-definida pelo usuário.^2,13-15,19

No exemplo em questão, foi aplicada a metodologia de redocagem para validação da rotina de cálculo empregada na simulação. É advertido que este protocolo tem maior eficiência em situações nas quais as moléculas otimizadas e o ligante co-cristalizado são estruturalmente similares.^12,32 Além disso, nessa metodologia é importante manter a estrutura da proteína fixa (rígida), a fim de garantir a conformação obtida experimentalmente, dos resíduos do sítio ativo. Nessa etapa, examina-se a capacidade do A.G. conduzir o ligante otimizado à conformação determinada pelo ligante co-cristalizado (reprodução do dado experimental). Na prática, o usuário deve, ao final do cálculo, observar os valores de RMSD com base na sobreposição das posições cartesianas dos átomos não-hidrogenóides, referentes as moléculas (simulada e original), no sítio de ligação. São plausíveis os protocolos com valores da raiz do desvio-médio quadrático não superiores a 2,0 Å.^{2,12,13,19,34}

Edição de figuras, utilizando o software PyMol

Para realizar a inspeção visual, ambos os arquivos (complexo exportado e a estrutura original 5kxi.pdb) são carregados no PyMol.³⁵ É importante destacar que a estrutura da biomacromolécula alvo pode ser obtida por homologia (modelagem molecular comparativa), no caso da ausência do arquivo 3D nos bancos de dados de proteínas (ver material suplementar, seção 4S).

Com o software PyMol aberto, as estruturas devem ser suprimidas: ALL > H > EVERYTHING. Os ligantes de interesse são selecionados na barra de sequência, DISPLAY > SEQUENCE, sendo o ligante co-cristalizado denominado como NCT (localizado entre as cadeias A e B do receptor) e no complexo exportado o ligante é identificado como UNK, e está localizado no início da barra de sequência. Para facilitar a inspeção, na opção (SELE) a função S, "show", é habilitada com posterior clique em STICKS. Por conseguinte, faz-se necessário remover os hidrogênios através da função A "Action" > HYDROGENS > REMOVE. Ainda, o usuário tem a opção de alterar a cor do plano de fundo para branco, DISPLAY > BACKGROUND > WHITE, Figura 13.

Figura 13. Moléculas de nicotina sobrepostas: simulada (C, em azul claro) e co-cristalizada (C, em verde), apresentadas como "sticks" e com os respectivos átomos de H suprimidos. Além disso, etapa de alteração do plano de fundo

Para expandir a seleção e apresentar as cadeias laterais dos resíduos que compõem o sítio de ligação, basta habilitar a proteína como "cartoon" (ALL > S "SHOW" > CARTOON) e clicar com o botão direito do mouse sobre o ligante co-cristalizado, seguindo ACTIONS > EXPAND > BY 5 Å, RESIDUES, conforme demostrado na Figura 14.

Figura 14. (Esquerda) Seleção e formatação dos resíduos, em um raio de 5 Å do ligante de interesse. (Direita) Aumento de transparência da estrutura em "cartoon"

Mantendo os resíduos selecionados, deve ser habilitada a função S, à direita da opção (SELE), optando pela forma STICKS. Uma melhor visualização é adquirida alterando a cor do ligante co-cristalizado em relação aos resíduos previamente expandidos. Nesse sentido, mantenha-o selecionado aplicando em sequência o comando C > BY ELEMENT, escolhendo uma das cores do painel. Aqui, foi escolhida a coloração laranja para os átomos de carbono. Ao mesmo tempo, é sugerido o comando SETTING > TRANSPARENCY > CARTOON > 80%, para melhorar a visualização, conforme mostrado na Figura 14.

Antes de completar a edição da figura, podem ser coletadas as coordenadas da pose, segundo a visão atual na tela, com a palavra-chave GET_VIEW, o qual deve ser digitada pelo usuário na linha de comando em frente ao nome "PyMol>", pressionando a tecla Enter ao final do processo, Figura 15.

Figura 15. Coordenadas cartesianas da pose de A.M. segundo a visão atual da tela; Linha de comandos do PyMol. Moléculas do ligante nicotina sobrepostas: simulada (C, em azul claro), co-cristalizada (C, em laranja) e resíduos do sítio de ligação (C, em verde) com no máximo 5 Å de distância do ligante. Todas as moléculas estão apresentadas como "sticks" e com os respectivos átomos de H omitidos para melhor visualização

Essas coordenadas podem ser utilizadas, posteriormente, para analisar outros ligantes ancorados, com o mesmo receptor, a partir da mesma orientação. Para realizar esse procedimento, é suficiente colar, Ctrl+V, as coordenadas já coletadas na linha de input dos comandos e pressionar a tecla Enter.

As rotinas de A.M. devem ser validadas, sendo a redocagem o método mais utilizado. Nessa abordagem, a estrutura do ligante co-cristalizado da proteína é removido do sítio de ligação. Em sequência, o algoritmo deverá recalcular a orientação e conformação do ligante no bolsão de ligação. Serão considerados protocolos aptos, ou bem sucedidos, caso haja concordância entre o modo de ligação experimental e o calculado. Aqui, a pose de maior pontuação apresentou valor de RMSD = 1,5 Å, isso é, RMSD < 2Å, considerada uma rotina apta para o sistema em questão.

Finalmente, para gerar uma figura de alta qualidade, visando relatórios técnicos, artigos, dentre outros, seleciona-se a opção DRAW/RAY > RAY(slow), conforme exemplificado na Figura 16.

Figura 16. Gerar figuras de alta qualidade com a função Ray

Quando o software terminar o cálculo, pressione FILE>SAVE IMAGE TO FILE, para salvar a imagem no diretório desejado. Para salvar um arquivo de seção contendo as modificações feitas até o momento, siga os comandos FILE > SAVE SESSION AS e escolha o local desejado, Figura 17.

Figura 17. Salvar arquivo de sessão no PyMol

Obs.: A opção de nomear os resíduos de aminoácidos nesse software pode resultar em figuras poluídas visualmente. Portanto, é aconselhável identificar os resíduos, posteriormente, com um editor de imagem (ex. Paint ou PowerPoint).

CONCLUSÕES

No decorrer deste texto, uma rotina computacional de fácil acesso e de baixo custo foi descrita, objetivando apresentar as principais etapas que pertencem a um procedimento de A.M., visando um público de usuários recentes e não especialistas. Nesse sentido, foram abordadas as etapas obtenção do arquivo 3D da biomacromolécula de interesse, construção e otimização do ligante, especiação do estado de protonação em pH fisiológico, condução da simulação de A.M. por meio do software GOLD, visualização do complexo receptor-ligante e monitoramento das interações intermoleculares via software DSV, concluindo com a edição de figuras de qualidade para publicação, utilizando o software PyMol.

Por fim, é fortemente reiterado que essa metodologia deve ser modificada, em algumas etapas, para resolução de problemas individuais de A.M. No entanto, o mesmo pode servir como um guia inicial aos interessados em SBDD.

MATERIAL SUPLEMENTAR

O Material Suplementar citado ao longo do trabalho está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br em formato pdf, com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Adicionalmente, agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Projeto Regular, Processo 2018/00187-7, pelo apoio financeiro ao LaQMedSOMM, que foi fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.

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