JBCS

INTRODUÇÃO

O gênero Euphorbia, o maior da família Euphorbiaceae, é composto por cerca de 2160 espécies e apresenta maior distribuição em regiões tropicais.¹ Espécies desse gênero têm sido estudadas e uma grande quantidade e diversidade de diterpenos foram isolados.^2-6 Esses diterpenos têm apresentado atividades biológicas, como anti-inflamatória, antiviral, anticancer,^1-3 além de atividade antituberculose de ent-abietanos contra cepas de Mycobacterium tuberculosis e de M. smegmatis.^5,7

A tuberculose (TB), doença transmissível causada pelo bacilo M. tuberculosis, ainda é uma das principais causas de morte em todo o mundo, com registros de 1,2 milhão de óbitos devido à doença em 2019.⁸ No Brasil, em 2020 foram registrados cerca de 67 mil novos casos, colocando o país entre os 30 países com maior carga de TB.⁹ Alguns fatores contribuem para os altos índices de TB apresentados mundialmente, como o abandono do tratamento antes da cura e, consequentemente, o desenvolvimento de cepas resistentes aos fármacos de primeira e segunda linha, gerando assim a necessidade de encontrar novas substâncias antimicobacterianas para combate dessas cepas.¹⁰ Euphorbia phosphorea Mart. é uma rara euforbiácea cactóide do Brasil, encontrada na caatinga e usada na medicina popular para tratamento de úlceras serosas e inflamações.^11-13 Da sua resina foram isolados os triterpenos lupeol, lupenona, taraxerona, acetato de taraxerol e olean-13(18)-en-3-ona.¹¹

Continuando nossas pesquisas com espécies do semiárido, neste estudo, foi realizada uma investigação fitoquímica das raízes de E. phosphorea. Através de técnicas cromatográficas foram isolados dez diterpenos, sendo um inédito, o ent-abietano 11β,12β-dihidróxi-ent-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12α-olídeo (1), e nove conhecidos (2-10). Também foram realizados testes in silico e in vitro para avaliação da atividade antimicobacteriana de todos os diterpenos isolados, contra cepas de M. tuberculosis H37Ra e de M. smegmatis mc²155.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Para separação por cromatografia líquida de média pressão (CLMP) foi utilizado equipamento BUCHI modelo Sepacore flash system X-50 e como fase estacionária sílica gel (40-63 µm, 230-400 mesh, SiliCycle^®). As frações obtidas foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD) utilizando placas de alumínio pré-revestidas com sílica gel _F254 (SiliCycle^®), visualizados sob luz UVGL-58 Mineralight^® com dois comprimentos de onda (254 and 365 nm) e agrupadas de acordo com a similaridade de eluição. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) analítica foi realizada em instrumento Shimadzu Prominence equipado com uma bomba de solvente binária LC-20AT, auto-injetor SIL-20A, sistema degaseificador DGU-20A, detector DAD SPD-M20A, sistema de controle CBM-20A e as colunas de fase reversa 100 10 C18 (250 mm × 4,6 mm preenchida com partículas de 10 µm) ou ACE 5 C18 (250 mm × 4,6 mm e partículas de 5 µm). Para purificação das frações por CLAE foram realizadas separações em escala semi-preparativa e preparativa. Para a primeira técnica foi utilizado um equipamento Shimadzu composto por bomba LC-10AD vp, válvula solenoide FCV-10AL vp, injetor manual Rheodyne, desgaseificador DGU-14A, detector UV-vis SPD-10A vp, controlador de sistema SLC-10A vp e uma coluna semi-preparativa Venusil XBP C18 (250 mm × 10 mm e partículas de 10 µm). Para escala preparativa a purificação foi realizada em um equipamento Shimadzu contendo duas bombas LC-6AD, injetor manual Rheodyne, detector DAD SPD-M10A vp, controlador de sistema SLC-10A vp e coluna preparativa ACE 5 C18 (250 mm × 21,2 mm e partículas de 5 µm). O fluxo empregado para as purificações foi de 3,5 mL min^-1 para a escala semipreparativa e 8,0 mL min^-1 para a preparativa, realizando-se, para ambas, injeções de 100 µL de amostra para cada corrida cromatográfica.

O espectro de massas de alta resolução com ionização por electrospray (EMAR-IES) foi obtido em equipamento Bruker modelo micrOTOF II, operando no modo positivo. Os espectros de RMN de ¹H, ¹³C e bidimensionais foram adquiridos no espectrômetro Bruker AVANCE III HD (400 MHz e 100 MHz para ¹H e ¹³C, respectivamente) usando CDCl₃ como solvente e utilizando sinais do CHCl₃ residual (δ_H 7,24 e δ_C 77,0) como padrão de referência para os deslocamentos químicos. As análises de infravermelho foram realizadas nos espectrômetros PerkinElmer Frontier FT-IR, com pastilhas de KBr e número de onda medido em cm^-1. A rotação óptica foi obtida em aparelho JASCO DIP-370.

Material vegetal

As raízes de E. phosphorea foram coletadas no Parque das Pedras (7º04'36" S, 36º03'40" W), localizado no município de Pocinhos, Paraíba, Brasil em maio de 2017. O registro de acesso ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) foi obtido sob o número A22E9B0. A identificação botânica foi realizada pelo Dr. José Iranildo Miranda de Melo e uma exsicata foi depositada no Herbário Manuel de Arruda Câmara da Universidade Estadual da Paraíba, sob código HACAM 883.

Extração e isolamento

As raízes de E. phosphorea foram secas em estufa de ar circulante a 45 °C por 72 h e, em seguida, trituradas produzindo 995,0 g de pó. Esse material foi então submetido ao processo de extração por maceração com n-hexano (3 L), durante 72 h por 3 vezes. Em seguida, a solução extrativa obtida foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida em evaporador rotativo a uma temperatura média de 40 °C, resultando em 65,7 g de extrato hexânico. Uma alíquota desse extrato (7,0 g) foi fracionada por CLMP usando sílica gel e gradientes dos solventes Hex:AcOEt (100:0 → 0:100) e AcOEt:MeOH (100:0 → 30:70), resultando em 101 frações de 50 mL que após análise em CCD foram agrupadas em 28 (Hx1 Hx28). A fração Hx11 (787,3 mg) obtida em Hex:AcOEt (85:15) foi purificada por CLAE semi-preparativa com sistema gradiente de água e acetonitrila, de 40 a 100% em 80 minutos a 215 nm, dando origem aos compostos 2 (7,4 mg, t_R 52,1 min) e 3 (6,1 mg, t_R 63,2 min). A fração Hx15 (243,5 mg) obtida em Hex:AcOEt (80:20) também foi purificada por CLAE semi-preparativa com gradiente de água e acetonitrila de 30 a 100% em 140 minutos a 220 nm, fornecendo os compostos 4 (7,4 mg, t_R 75,8 min) e 5 (4,5 mg, t_R 85,3 min). A fração Hx18 (177,8 mg) eluída em Hex:AcOEt (70:30) foi purificada por CLAE preparativa com sistema gradiente de água e acetonitrila de 50 a 80% em 60 minutos e foi obtido o composto 6 (1,6 mg, t_R 53 min). A fração Hx20 (51 mg) obtida em Hex:AcOEt (60:40) foi purificada por CLAE semi-preparativa com sistema gradiente de água e acetonitrila de 45 a 75% em 65 minutos a 215 nm e foi obtido o composto 7 (2,6 mg, t_R 55,2 min). A fração Hx22 (156,2 mg) obtida em Hex:AcOEt (40:60) foi purificada por CLAE preparativa com sistema isocrático de água e acetonitrila 43:57 durante 15 min, seguido de sistema isocrático de água e acetonitrila 58:42 por 50 min e foram obtidos os compostos 8 (1,5 mg, t_R 70 min), 9 (1,8 mg, t_R 49 min), 1 (1,2 mg, t_R 53 min) e 10 (2,2 mg, t_R 65 min).

Banco de dados

A partir do banco de dados ChEMBL foram selecionadas estruturas químicas de produtos naturais, sintéticos e de medicamentos utilizados na terapêutica no tratamento da tuberculose para a construção do modelo preditivo (ChEMBL ID: CHEMBL360). Os compostos foram classificados a partir da pCIM (-log(CIM)), ressaltando que a CIM (Concentração Inibitória Mínima) representa a concentração mínima necessária para limitar o crescimento visível de uma bactéria. Compostos com pCIM > 4,74 foram considerados ativos, e com pCIM < 4,73 foram considerados inativos. Essa divisão é realizada de modo a ter um número necessário de amostras para se criar um padrão e aumentar a probabilidade de acerto do modelo em selecionar moléculas ativas, ou seja, quanto maior o pCIM menor a concentração do composto químico e consequentemente mais potente é sua atividade, contudo, é necessário ter um número suficiente de amostras para que o modelo possa distinguir os compostos ativos dos inativos.

Para todas as estruturas foram utilizados códigos SMILES como dados de entrada para o Marvin 18.10.0, 2018, ChemAxon¹⁴ (http://www.chemaxon.com). Usou-se ainda o software Standardizer JChem 18.10.0, 2018, ChemAxon¹⁵ o qual converte as diversas estruturas químicas em representações canônicas personalizadas, ou seja, altera a forma de escrever o anel aromático de modo a incluir todas as formas ressonantes. Essa padronização é de suma importância para criar bibliotecas de compostos consistentes, além de obter as estruturas em formas canônicas, adicionar hidrogênios, aromatizar, gerar o 3D e salvar os compostos em formato SDF.

Descritores Volsurf+ v.1.0.7

Descritores moleculares foram gerados e usados para prever as propriedades biológicas e físico-químicas das moléculas dos dois bancos de dados depois que as moléculas foram transformadas em uma representação molecular, ou seja, foram escritas de modo que o programa reconheça as estruturas químicas e possa realizar o cálculo dos descritores moleculares. O software VolSur+ v.1.0.7^16,17 pode calcular 128 descritores moleculares usando campos de interação molecular (MIF, do inglês Molecular Interaction Fields) por meio das seguintes sondas: N1 (sonda doadora de ligação de hidrogênio), O (sonda receptora de ligação de hidrogênio), OH (sonda de água) e DRY (sonda hidrofóbica), esses MIFs são calculados ao redor da molécula alvo.

Modelos Random Forest

Utilizou-se o Knime 4.4.0 the Konstanz Information Miner Copyright, 2003-2020, www.knime.org¹⁸ para geração e análise do modelo de predição in silico. O banco de moléculas com as atividades conhecidas, banco obtido a partir do ChEMBL, juntamente com seus descritores moleculares foi importado do programa Volsurf+ v.1.07, particionado em dois conjuntos de moléculas, um para treino e outro para teste do modelo, representando 80 e 20% de todos os compostos, respectivamente. Essa partição foi realizada de maneira estratificada, ou seja, mantendo a proporção de moléculas ativas e inativas nos dois conjuntos.

O modelo foi criado utilizando a técnica de validação externa quíntupla (do inglês "5-fold external validation"), cujo grupo de treino foi particionado cinco vezes, criando cinco bancos com a mesma proporção de moléculas ativas e inativas. Assim, foram criados cinco modelos para a validação externa. Nessa validação o conjunto de teste foi utilizado para avaliar os modelos criados. Em seguida foi realizada a análise de performance como sendo a média dos cinco modelos.^19,20 Para a criação desse modelo de predição foi utilizado o algoritmo Random Forest (RF), selecionando os parâmetros de 100 florestas e 1550953075932 sementes na geração de números aleatórios para o modelo.

Na avaliação da performance do modelo foi analisada a sensibilidade (taxa de verdadeiro positivo, ou seja, taxa de ativos), especificidade (taxa de verdadeiro negativo, ou seja, taxa de inativos), precisão (previsibilidade geral), valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN), bem como a avaliação da curva ROC (do inglês Receiver Operating Characteristics), que descreve o desempenho real do modelo.

Também foi utilizado o coeficiente de correlação de Matthews (MCC - "Matthews correlation coeficiente"), para avaliar o modelo globalmente a partir dos resultados obtidos na matriz de confusão. O MCC é um coeficiente de correlação entre as classificações binárias observadas e preditivas. Isso resulta em um valor entre -1 e +1, onde um coeficiente de +1 representa uma previsão perfeita, 0 é nada mais que uma previsão aleatória e -1 indica desacordo total entre previsão e observação.^21,22

O coeficiente de correlação de Matthews pode ser calculado a partir da seguinte fórmula:

em que VP é o valor do verdadeiro positivo, VN é o valor do verdadeiro negativo, FP é o valor dos falsos positivos e FN dos falsos negativos.

O domínio de aplicabilidade (APD) foi utilizado para analisar os compostos dos conjuntos de testes, avaliando se suas previsões eram confiáveis. O APD é baseado em distâncias euclidianas e medidas de similaridade entre os descritores do conjunto de treinamento são usadas para definir o domínio da aplicabilidade; portanto, se um composto do conjunto de teste tiver distâncias e semelhanças além desse limite, sua previsão não será confiável. O cálculo do APD é realizado através da fórmula:

em que d e σ são as distâncias euclidianas e o desvio médio padrão, respectivamente, dos compostos no conjunto de treinamento. Z é um valor de corte empírico e, neste trabalho, o valor de Z foi usado como 0,5.^22,23

Atividade antimicobacteriana

Para a realização dos testes de avaliação da atividade antimicobacteriana foram utilizadas as drogas controle: rifampicina (RIF) e moxifloxacino (MOX), adquiridas da Sigma-Aldrich, e isoniazida (INH), obtida da ACROS Organics. As cepas de M. tuberculosis (H37Ra) e M. smegmatis (mc²155) foram cultivadas conforme descrito por Taneja e colaboradores.²⁴ Os ensaios foram realizados em triplicata, utilizando microplacas de poliestireno com 96 poços em fundo em U.²⁵

Todas as amostras, incluindo as usadas como controle positivo, foram sempre mantidas em meio Middlebrook 7H9 + ADC + DMSO 2.5%. As soluções controle (RIF, MFX e INH) foram preparadas na concentração de 1 mmol L^-1 em DMSO. Enquanto os diterpenos foram solubilizados em DMSO a uma concentração de 20 mmol L^-1 e depois diluídos em caldo Middlebrook 7H9 para atingir uma concentração de 500 µmol L^-1. Diluições seriadas foram realizadas mantendo a concentração final de DMSO em 2,5% para todos os poços.

Para determinação da CIM contra M. tuberculosis as suspensões micobacterianas das cepas H37Ra foram diluídas em meio 7H9 a uma densidade óptica teórica (DO 600 nm) de 0,003 e incubadas por 7 dias a 37 ºC. Em seguida, foram adicionados 30 µL de solução de resazurina a 0,02% e incubadas novamente incubação por 48 h a 37 graus para análise do crescimento bacteriano por redução de resazurina. A leitura dos resultados considerou azul para cepas mortas e rosa para cepas viáveis. INH, RIF e MOX foram utilizados como controle positivo.²⁶

Para a avaliação da CIM para cepas de M. smegmatis mc²155, foram utilizados os mesmos parâmetros acima, diferenciando nas suspensões micobacterianas que foram diluídas a uma densidade óptica teórica (DO 600 nm) de 0,0005, e o período de incubação de 24 h, a 37 ºC. A leitura dos resultados também considerou azul para cepas mortas e rosa para cepas viáveis. MOX foi usado como controle positivo.^24,26

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo químico do extrato hexânico das raízes de E. phosphorea levou ao isolamento de dez compostos (1-10) (Figura 1), sendo um novo diterpeno 11β,12β-dihidróxi-ent-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12α-olídeo (1) e nove compostos relatados anteriormente na literatura. Suas estruturas químicas foram determinadas com base na análise de dados espectroscópicos de RMN uni e bidimensionais, espectrometria de massas de alta resolução com ionização por electrospray (EMAR-IES), infravermelho (IV), dicroísmo circular eletrônico (ECD, do inglês Eletronic Circular Dichroism) e comparação com dados na literatura. Os dados de RMN de ¹H e ¹³C do composto 1 estão compilados na Tabela 1.

 

 

 

 

O composto 1 foi obtido como cristais incolores, com rotação óptica [α]²⁵ - 8,5 (c 0,001, MeOH). Sua fórmula molecular foi determinada por EMAR-IES que mostrou o pico do íon [M+H]⁺ com m/z 333,2054 (calcd. para C₂₀H₂₉O₄, 333,2060) compatível com a fórmula molecular C₂₀H₂₈O₄. O espectro de infravermelho mostrou bandas de absorção para grupamentos hidroxila em 3488 e 3446 cm ¹, e em 1744 e 1603 cm^-1 para uma γ-lactona α,β,γ,δ-insaturada. O espectro de RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz) mostrou sinais para três metilas (δ_H 0,71, 0,82, 0,89), um grupo metil vinílico (δ_H 1,85), um grupo oximetínico (δ_H 3,85, J = 6,4 Hz) e um hidrogênio olefínico (δ_H 6,19). O espectro de RMN de ¹³C (CDCl₃, 100 MHz) indicou a presença de 20 carbonos, associados a quatro metilas, cinco carbonos metilênicos, quatro carbonos metínicos e sete carbonos não hidrogenados. Os sinais em δ_C 113,1 (C-14), 119,9 (C-15), 152,2 (C-13), 153,5 (C-8) e 172,9 (C-16) indicaram a presença do grupo γ-lactona α,β,γ,δ-insaturada semelhante aos diterpenos ent-abietanos isolados anteriormente em espécies de Euphorbia. Também foram observados os sinais em δ_C 70,2 (C-11) e 102,0 (C-12), sugerindo que o composto 1 seria semelhante ao composto conhecido 11β-hidróxi-12β-metóxi-ent-abieta-8(14),13(15),-dien-16,12α-olídeo isolado de E. ebracteolata²⁷ apresentando como diferença a presença de um grupo hidroxila em C-12 (δ_C 102,0), enquanto o composto relatado por Liu e colaboradores apresenta um grupo metoxila em C-12 (δ_C 105,3). Os espectros de RMN de ¹H e de ¹³C apresentaram ainda os deslocamentos δ_H 2,24 (td, J =14,0; 6,1 Hz, H-7ax), 2,50 (ddd, J = 14,0, 4,6, 1,8 Hz, H-7eq), característicos de hidrogênios metilênicos, e δ_C 36,4 para o carbono metilênico C-7. Foram observadas as correlações por HMBC dos hidrogênios metilênicos H-7ax (δ_H 2,24) com C-6 (δ_C 23,3), C-8 (δ_C 153,5) e C-14 (δ_C 113,1) e H-7eq com C-5 (δ_C 54,2), C-8 (δ_C 153,5), C-9 (δ_C 59,0) e C-14 (δ_C 113,1), do hidrogênio oximetínico H-11 (δ_H 3,85) com C-9 (δ_C 59,0), C-10 (δ_C 40,7) e C-12 (δ_C 102,0), do hidrogênio vinílico H-14 (δ_H 6,19) com C-7 (δ_C 36,4), C-8 (δ_C 153,5), C-9 (δ_C 59,0) e C-12 (δ_C 59,0), e entre os hidrogênios alílicos da metila C-17 (δ_H 1,85) com C-13 (δ_C 152,2), C-15 (δ_C 119,9) e C-16 (δ_C 172,9). A estereoquímica relativa de C-11 foi determinada por NOESY, atribuindo a hidroxila em C-11 com orientação β a partir das correlações entre os hidrogênios da metila C-20 e H-11, indicando para H-11 orientação α (Figura 2). Foram observadas também correlações dos hidrogênios desta mesma metila (C-20) com H-6ax, dos hidrogênios da metila C-19 com H-11, e de H-5/H-7ax/H-9. Em relação a configuração absoluta do composto 1, o espectro experimental de ECD obtido em CHCl₃ (Figura 3S) apresentou efeito Cotton negativo em aproximadamente 285 nm, semelhantes ao observado para o espectro de ECD do eupholide C.²⁸ As diferenças estruturais entre os compostos, uma hidroxila em C-7 e um grupo metoxi em C-12 em eupholide C, não interferem significativamente nos cromóforos dos compostos e por isso pode-se inferir que ambos os compostos possuem a mesma orientação espacial dos átomos. Logo, foi determinado a configuração absoluta do composto 1 como 5R, 9S, 10R, 11R, 12R. Com base nesses dados, foi possível propor 1 como um novo diterpeno ent-abietano denominado 11β,12β-dihidróxi-ent-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12α-olídeo. Os demais compostos conhecidos foram identificados como: jolkinolídeo A (2),²⁹ jolkinolídeo E (3),²⁹ euforina H (4),³⁰ eufopilolídeo (5),³¹ jolkinolídeo F (6),³² ent-12-hidróxi-12[R]-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12-olídeo (7),³³ ent-11α-hidroxiabieta-8(14),13(15)-dien-16,12α-olídeo (8),²⁹ 17-hidroxijolkinolídeo B (9),⁶ caudicifolina (10)^29,34 (Tabelas 1S, 2S e 3S).

 

 

Modelo preditivo para M. tuberculosis

Na análise do modelo de predição RF, foi observado que o modelo preditivo para M. tuberculosis construído obteve bons resultados de desempenho, com uma acurácia de 77%. A curva ROC e o MCC também obtiveram resultados satisfatórios, curva ROC foi de 0,86 e MCC a 0,56, revelando um modelo com boas taxas de classificação, performance e robustez. É importante lembrar que modelos perfeitos possuem valores de performance de 1 (100%).

Uma curva ROC demonstra de maneira tridimensional a performance de um modelo e representa a sensibilidade (verdadeiro positivos) em função dos falsos positivos (1 - especificidade). É calculado então a área sob a curva (AUC) aonde seus valores vão de 0 a 1. Quanto mais próximo de 1 do eixo Y melhor é o acerto do modelo.^35,36 A Tabela 2 descreve as características do modelo quanto ao poder preditivo e a Figura 3 revela a performance e robustez do modelo através da curva ROC.

 

 

 

 

Com o alto desempenho do modelo criado, foi realizada então a triagem das dez moléculas isoladas de E. phosphorea, a fim de selecionar aquelas potencialmente ativas contra M. tuberculosis. O modelo RF foi capaz de selecionar cinco moléculas com potencial ativo variando entre 51 e 61%, dentro do domínio de aplicabilidade, sendo a molécula cinco aquela que apresentou a maior probabilidade de potencial ativo. Apesar das probabilidades estarem baixas é importante lembrar que o corte realizado no modelo para moléculas ativas foi elevado, ou seja, as moléculas foram consideradas ativas no modelo quando possuíam pMIC > 4,76. Os compostos 4, 5, 8, 9 e 10 apresentaram probabilidade de serem ativos no modelo RF. Na Tabela 3 encontra-se o valor de predição para cada uma das moléculas analisadas.

 

 

Atividade antimicobacteriana

Os dez compostos isolados de E. phosphorea apresentaram baixa atividade frente as cepas de M. tuberculosis H37Ra e M. smegmatis mc²155 (Tabela 3). Entre todos os compostos, o composto 5 apresentou inibição do crescimento com a menor concentração (CIM = 62,5 µmol L^-1), validando o modelo preditivo que indicava esse composto com a maior probabilidade de apresentar atividade contra para M. tuberculosis. O composto 9 foi o único entre os testados a apresentar resposta inibitória contra M. smegmatis, também com CIM de 62,5 µmol L^-1.

 

CONCLUSÕES

A investigação química do extrato hexânico das raízes de E. phosphorea levou ao isolamento de um novo diterpeno 11β,12β-dihidróxi-ent-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12α-olídeo (1) e nove compostos conhecidos jolkinolídeo A (2), jolkinolídeo E (3), euforina H (4), eufopilolídeo (5), jolkinolídeo F (6), ent-12-hidróxi-12[R]-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12-olídeo (7), ent-11α-hidroxiabieta-8(14),13(15)-dien-16,12α-olídeo (8), 17-hidroxijolkinolídeo B (9) e caudicifolina (10), todos relatados pela primeira vez na espécie. Os compostos apresentaram baixa atividade frente as cepas de Mycobacterium. O composto 5 apresentou resposta contra M. tuberculosis com a menor concentração, corroborando com o resultado apresentado no estudo in silico.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros de IV, de RMN uni e bidimensionais, e de EMAR-IES estão disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (código de financiamento 001) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro e bolsas de pesquisa, ao Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise (LMCA-UFPB) e ao Centro Analítico de Instrumentação da Universidade de São Paulo (Central Analítica IQ-USP) pela aquisição dos espectros, e ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Tuberculose (INCT-TB) pela colaboração.

 

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