JBCS

INTRODUÇÃO

O gênero Baccharis apresenta ampla distribuição em diferentes regiões do Brasil e conta com aproximadamente 500 espécies, das quais cerca de 20% são utilizadas na medicina popular para tratamento de inflamações, males do fígado, reumatismo e úlceras.^1,2 Tais espécies são encontradas nas regiões sul e sudeste do país, principalmente em regiões de altitude (a cerca de 1800-2000 m do nível do mar), que são biomas com predominância de gramíneas e arbustos.³ Do ponto de vista químico, espécies de Bacharis são produtoras de diferentes metabólitos dos quais se destacam flavonoides, diterpenos de esqueletos caurano, labdano e clerodano e também de triterpenoides, principalmente de esqueletos oleanano e ursano.^4-6 Além desses metabólitos, merece destaque a ocorrência de tricotecenos, que são derivados diterpênicos com importantes ações farmacológicas.⁷ Dentre as espécies estudas quimicamente encontra-se B. ligustrina, distribuída amplamente nos estados de Minas Gerais e São Paulo, e que se mostrou constituída essencialmente por dois triterpenos (ácidos oleanólico e ursólico) e dois flavonóides (naringenina e hispidulina).⁸

Como parte dos nossos estudos visando a prospecção de compostos bioativos em espécies de Baccharis,^9-11 as partes aéreas de B. ligustrina foram submetidos à extração assistida por micro-ondas (MAE) usando solução aquosa de 1-butil-3-brometo de metilimidazólio (BMImBr) e o extrato assim obtido foi extraído sucessivamente com hexano e com AcOEt. Após diferentes processos de fracionamento cromatográfico em pequena escala foram obtidos, de ambas as fases de partição, seis derivados fenilpropanoídicos: ácido ferúlico (1), ácido p-cumárico (2), ferulato de n-hexacosila (3), p-cumarato de n-hexacosila (4), p-cumarato de n-octacosila (5) e p-cumarato de n-triacontila (6). Adicionalmente, os derivados C₆C₃ isolados (1-6) foram avaliados quanto a ação antiparasitária, em especial frente as formas amastigotas de Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas. Essa doença, endêmica no Brasil, conta com um único fármaco disponível no país, o benznidazol, extremamente tóxico e com baixa eficácia, especialmente na fase crônica da doença.¹² Frente a essa problemática, a busca de novos protótipos moleculares para o desenvolvimento de futuros fármacos para a doença de Chagas baseados em produtos naturais oriundos da biodiversidade brasileira consiste em uma abordagem importante, particularmente devido a ampla diversificação estrutural dos metabólitos especiais encontrados em espécies vegetais.^13,14

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Partes aéreas de B. ligustrina foram submetidas à extração assistida por micro-ondas (MAE) com solução aquosa de brometo de 1-butil-3-metilimidazólio (BMImBr) e o material assim obtido foi extraído com hexano e com AcOEt. O fracionamento cromatográfico de ambas as fases permitiu a obtenção de seis fenilpropanoides (1-6), como mostrado na Figura 1.

 

 

Os espectros de RMN de ¹H dos compostos 1 e 2 mostraram-se muito semelhantes devido à presença de dois dupletos em δ 6,35/6,28 (J = 16,0 Hz, H-8) e em δ 7,49/7,48 (J = 16,0 Hz, H-7) atribuídos a hidrogênios de sistemas carbonílicos a,b-insaturados em configuração trans. No caso de 2 foram observados também dois dupletos em d 7,50 (J = 8,6 Hz, H-2/H-6) e 6,78 (J = 8,6 Hz, H-3/H-5), referentes a um sistema aromático 1,4-dissubstituido enquanto que, para 1, foram observados três sinais em δ 7,27 (d, J = 2,5 Hz, H-2), 7,08 (dd, J = 8,2 e 2,5 Hz, H-6) e 6,78 (d, J = 8,2 Hz, H-5), indicativos da ocorrência de um anel aromático 1,3,4-trissubstituído. No caso de 1, foi observado um sinal adicional em δ 3,81 (3H), relativo a um grupo metoxílico ligado ao anel aromático. Os espectros de RMN de ¹³C mostraram sinais referentes a carbonos sp² entre δ 113-159 (C-1 a C-8), a carbonos carbonílicos (C-9) em δ 168,0 e 167,9 para 1 e 2 além de um sinal em δ 55,7, relativo ao grupo metoxílico de 1. A comparação dos dados espectrais obtidos com aqueles descritos na literatura^15,16 permitiu caracterizar os compostos 1 e 2 como ácidos ferúlico e p-cumárico, respectivamente. Apesar das similaridades com os espectros de RMN de ¹H dos compostos 1 e 2, aqueles registrados para 3 e 4 mostraram um sinal intenso em d 1,2 além de dois tripletos em d 4,18 (J = 6,7 Hz, H-1') e em d 0,89 (J = 6,5 Hz), sugerindo a ocorrência de ferulato/p-cumarato de cadeia longa. Os espectros de RMN de ¹³C de 3 e 4 mostraram sinais referentes aos carbonos carbonílicos (C-9) em cerca de d 167, sinais atribuídos aos carbonos carbinólicos (C-1') em aproximadamente d 65, enquanto aqueles referentes à cadeia metilênica longa e ao grupo metílico terminal foram observados em d 29 e d 14, respectivamente. Do mesmo modo que definido para 4, os espectros de RMN de ¹H dos compostos 5 e 6 indicaram a ocorrência de ésteres alquílicos do ácido p-cumárico devido aos sinais em d 7,43 (d, J = 8,5 Hz, H-2/H-6), 6,85 (d, J = 8,5 Hz, H-3/H-5), 6,30 (J = 16,0 Hz, H-8), 7,63 (J = 16,0 Hz, H-7) e 4,19 (t, J = 6,6 Hz, H-1'). Além desses, foram observados sinais referentes a hidrogênios de cadeia carbônica saturada em d 1,2 (sl) e 0,89 (t, J = 6,5 Hz). Finalmente, as extensões das cadeias dos compostos 3 - 6 foram definidas por espectrometria de massas com ionização por electrospray, cujos espectros apresentaram picos referentes aos íons [M - H]^- em m/z 557,4563 (3), 527,4446 (4), 555,4774 (5) e 583,5094 (6) consistentes com as fórmulas moleculares C₃₆H₆₂O₄ (erro -1,26), C₃₅H₆₀O₃ (erro -3,41), C₃₇H₆₄O₃ (erro -0,54) e C₃₉H₆₈O₃ (erro 0,69), respectivamente. Assim, após comparação com dados descritos na literatura,^17,18 as estruturas foram definidas como ferulato de n-hexacosila (3), p-cumarato de n-hexacosila (4), p-cumarato de n-octacosila (5) e p-cumarato de n-triacontila (6). Os compostos 1 e 4 foram isolados, respectivamente, de Baccharis uncinella¹⁹ e de B. sphenophylla⁹ ao passo que a ocorrência dos compostos 2, 3, 5 e 6 está sendo descrita pela primeira vez no gênero Baccharis. No entanto, tais compostos foram descritos anteriormente em outras espécies vegetais tais como Gnetum cleistostachyum (2),²⁰ Bauhinia manca (3 - 5),¹⁷ Tapirira guianensis (4 e 5)²¹ e Dendrobium fuscescens (6).¹⁸

Finalmente, neste estudo, foi avaliada a efetividade contra formas clínicas não replicativas (amastigota intracelular) de T. cruzi dos compostos 1-6 isolados de B. ligustrina. Para tanto, foram determinados os valores de CE₅₀ e de CC₅₀ (Tabela 1), esses últimos frente a fibroblastos murinos (células NCTC), necessários para o cálculo dos índices de seletividade desses compostos. Como observado, os ácidos carboxílicos livres 1 e 2 se mostraram inativos (CE₅₀ > 200 µmol L^-1), enquanto os ésteres 3 e 4 apresentaram potencial com CE₅₀ de 32,2 e 15,7 µmol L^-1, respectivamente, todos sem demonstrar citotoxicidade em células de mamífero até a concentração máxima testada (CC₅₀ > 200 µmol L^-1). No caso de 4, o potencial frente a formas intracelulares de T. cruzi foi similar ao obtido anteriormente (CE₅₀ = 16.9 µmol L^-1).⁹ No caso dos ésteres 5 e 6, ambos com reduzida toxicidade (CC₅₀ > 200 µmol L^-1), os valores de EC₅₀ determinados foram 9,3 e 6,5 mmol L^-1, sendo, no caso de 6, similar ao do controle positivo benznidazol (EC₅₀ = 5,5 µmol L^-1). Tais resultados sugerem que a presença do grupo alquílico é crucial para a atividade frente aos amastigotas sendo potencial intensificado com o aumento da cadeia lateral. Tal observação estaria possivelmente associada ao aumento da lipofilicidade dos ésteres em relação ao ácido p-cumárico uma vez que os valores de log P_o/w foram determinados como 1,29 (2), 10,59 (4), 11,28 (5) e 12,07 (6). Tal característica pode fazer com que tais compostos adquiram um caráter anfifílico permitindo, portanto, que atravessem a membrana celular e atinjam os parasitas no interior das células.^22,23 Tais resultados permitem sugerir, no futuro, a realização de estudos de relação estrutura/atividade com ésteres do ácido p-cumárico contendo diferentes grupos alquílicos seguido da avaliação da atividade frente as formas amastigotas de T. cruzi. Apesar de estudos similares terem sido realizados contra formas extracelulares do parasita,²⁴ nosso trabalho teve um enfoque na forma clínica e intracelular do parasita, os amastigotas, uma vez que são considerados alvos preferenciais em estudos de Drug Discovery.²⁵

 

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos gerais

Experimentos de extração assistida por micro-ondas (MAE) foram realizados em um forno de micro-ondas MAS-I (2450 MHz, Sineo Microwave Chemistry Technology Company, Xangai, China) com uma potência máxima fornecida de 1000 W sendo a temperatura interna monitorada por uma sonda infravermelha. Nas separações cromatográficas em coluna aberta foram utilizados gel de sílica (Merck, 230-400 mesh) e gel de Sephadex LH-20 (Amersham-Bioscience), enquanto nas análises com camada fina foi utilizado gel de sílica 60 PF₂₅₄ (Merck) (0,25 mm) seguido de revelação com luz UV (254 e 366 nm). As separações por CLAE foram efetuadas em cromatógrafo Dionex Ultimate 3000, em coluna Luna Phenomenex C₁₈ (5 µm, 250 mm × 10 mm, 120Å). Os espectros de massas de alta resolução foram registrados em espectrômetro Bruker Daltonics q-ToF Maxis, operando por ionização por electrospray, em modo negativo. Os espectros de ressonância magnética nuclear foram registrados em espectrômetro Varian Inova (¹H: 500 MHz e ¹³C: 125 MHz). CDCl₃ e DMSO-d₆ foram utilizados como solventes e como referência interna o sinal residual do solvente.

Material vegetal

As partes aéreas de B. ligustrina DC. (Asteraceae) foram coletadas em Campos do Jordão/SP, Brasil em junho de 2017 recebendo o código de coleta SISGEN A4123E4. Uma exsicata foi preparada e comparada com aquela de número SPSF37589, catalogada no Herbário D. Bento Pickel, do Instituto Florestal de São Paulo (PMSP).

Extração e isolamento dos constituintes químicos

As partes aéreas de B. ligustrina, secadas e moídas (25 g), foram submetidas à extração assistida por micro-ondas (MAE) com 50 mL de mistura contendo H₂O:BMImBr 1:1 (v/v) durante 15 min a 60 °C, sendo o líquido iônico brometo de 1-butil-3-metilimidazólio (BMImBr) preparado conforme descrito na literatura.²⁶ Após esse procedimento, a solução foi filtrada e extraída sucessivamente com hexano (3 × 25 mL) e com AcOEt (3 × 25 mL). Após secagem com Na₂SO₄ e evaporação dos solventes sob pressão reduzida, foram obtidos 121 mg e 412 mg das fases em hexano e em AcOEt, respectivamente. Parte da fase em n-hexano (100 mg) foi submetida a fracionamento cromatográfico em gel de sílica utilizando-se misturas de n-hexano/AcOEt (9:1, 8:2, 7:3, 1:1, 6:4 e 3:7) fornecendo seis frações (H1 - H6). A fração H2 (12 mg) foi purificada via CLAE (C₁₈, MeOH:H₂O 3:7 com 0,1% de HCOOH), fornecendo 3 (5,1 mg), 4 (2,9 mg), 5 (0,7 mg) e 6 (0,5 mg). Parte da fase em AcOEt (150,0 mg) foi submetida à permeação em gel de Sephadex LH-20 eluída com MeOH fornecendo cinco frações (A1 - A5). A fração A2 (64,1 mg) mostrou-se composta por uma mistura de 1 + 2 enquanto a fração A3 (2,2 mg) mostrou-se constituída majoritariamente por 2. Parte de fração A2 (30,0 mg) foi purificada via CLAE (C₁₈, MeOH:H₂O 1:1 com 0,1% de HCOOH), fornecendo 1 (14,8 mg) e 2 (10,2 mg).

Parasitas

Formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi foram cultivadas em células LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Cells - ATCC CCL 7) em meio RPMI-1640, suplementado com 2% de soro fetal bovino (SFB) e mantidas a temperatura de 37 °C em estufa com 5% CO_2.^27,28 As formas amastigotas foram obtidas por meio da infecção de macrófagos aplicados a 1×10⁵/poço com formas tripomastigotas na proporção de 5:1 parasitas/macrófagos e incubadas por quatro horas. Os parasitas foram contados em hemocitômetro e depois aplicados a 1×10⁶/poço em placas de 96 poços.

Células de mamíferos

Fibroblastos de camundongo, NCTC clone 929 (American Type Culture Collection - ATCC CCL-1), foram fornecidas pela Seção de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, e armazenadas em nitrogênio líquido a temperatura -70 °C. Posteriormente foram mantidas em meio M-199 suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%, sob a temperatura de 37 °C em estufa com 5% de CO₂.²⁹

Determinação do potencial frente as formas amastigotas de T. cruzi

Para determinar a atividade contra amastigotas intracelulares, macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram infectados com formas tripomastigotas de T. cruzi. Os macrófagos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c foram plaqueados em uma lâmina de câmara de 16 poços (NUNC, 1 × 10⁵/poço) e incubados por 24 h a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Tripomastigotas foram lavados em meio RPMI-1640, contados e utilizados para infectar os macrófagos (parasita:macrófago, razão = 10:1). Após 2 h de incubação a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂, os parasitas não internalizados foram removidos por lavagem com meio. Os compostos a serem testados (1-6) foram incubados com macrófagos infectados (48 h a 37 °C, 5% CO₂) em concentração seriada usando benznidazol como droga padrão. Ao final do ensaio, as lâminas foram fixadas com MeOH e coradas com Giemsa antes da contagem em microscópio de luz (EVOS M5000,THERMO). Os valores de EC₅₀ foram calculados conforme descrito previamente.^27,28

Determinação da toxicidade frente a células de mamíferos

A citotoxicidade dos compostos 1-6 foi avaliada utilizando-se células NCTC (clone 929), na concentração de 6×10⁴ células/poço. As células foram incubadas com os compostos isolados, em diluição seriada, em meio M-199 e 10% de soro fetal bovino em placas de 96 poços. Em seguida, as células foram mantidas em estufa a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 h. Após esse período, foram adicionados 20 µL de resazurina a 10%, seguido de incubação por 20 h, com a leitura realizada da mesma forma descrita acima.²⁹

Análise estatística

Os dados obtidos representam a média e o desvio padrão de amostras duplicadas de dois ensaios independentes. Os valores de CE₅₀ foram calculados usando curvas sigmoide dose-resposta no software GraphPad Prism 5.0.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros de RMN ¹H, RMN ¹³C e de massas referentes aos compostos estudados no presente trabalho estão disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br em formato pdf, com acesso livre.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPESP (2021/02789-7), CNPq e CAPES pelo apoio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho. F. F. C., A. G. T. e J. H. G. L. agradecem ao CNPq pelas bolsas de produtividade em pesquisa.

 

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