JBCS

INTRODUÇÃO

No ano de 2022 foram produzidos 23,85 bilhões de litros de leite inspecionados no Brasil. O percentual desse montante destinado ao processamento UHT (do inglês, ultra high temperature) correspondeu a 26,9%, ficando atrás somente da indústria queijeira.¹ Esse dado evidencia a relevância desse setor no cenário lácteo brasileiro.

O processo UHT visa obter produtos comercialmente estéreis, porém a estabilidade microbiológica não garante que o leite vai estar apto ao consumo ao longo do prazo de validade.² A qualidade do produto é influenciada pelas condições de processamento, propriedades físico-químicas e composicionais do leite.³ Durante a vida de prateleira, várias mudanças químicas e físicas podem acarretar características indesejáveis como sedimentação, gelificação e separação de gordura.²

As propriedades físico-químicas do leite são essencialmente um resultado dos equilíbrios que ocorrem entre os constituintes. Os equilíbrios mais notáveis incluem a solubilidade e ionização de sais, interação entre sais e proteínas, além da associação entre proteínas. A estabilidade desse sistema é fortemente afetada pelo tratamento térmico.³

A estabilidade coloidal das micelas de caseína é governada principalmente pela extremidade C-terminal da κ-caseína, que se projeta para a face externa da superfície da micela. A estabilização ocorre por meio de filamentos protuberantes em que o N-terminal da κ-caseína está ligado à estrutura da micela e o C-terminal se direciona para o solvente. A extremidade C-terminal é carregada negativamente devido à presença de resíduos de aminoácidos, que no pH do leite são ionizáveis. Portanto, a estabilização das micelas é proveniente tanto do impedimento eletrostático, devido às cargas negativas, quanto do impedimento estérico, resultante da estrutura dos filamentos de κ-caseína.³

O tratamento térmico acarreta desagregação significativa de κ-caseína das micelas de caseína. A remoção dessa estrutura estabilizadora produz um arranjo micelar que tem uma estabilidade coloidal muito reduzida.² Além disso, o calor promove uma série de alterações no leite como: redução do pH, precipitação do fosfato de cálcio, reações de Maillard, desnaturação de proteínas do soro e desfosforilação da caseína, que apresentam notável influência na estabilidade coloidal.³

Devido à importância do setor de leites UHT no cenário lácteo brasileiro, a relevante influência do processamento, propriedades físico-químicas e composicionais na estabilidade coloidal do leite, além do surgimento de novas categorias de produtos, faz-se necessário investigar os sistemas coloidais de leites UHT e o emprego de aditivos alimentares em produtos disponíveis no mercado das principais regiões consumidoras.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Coleta das amostras

Foram analisadas quarenta amostras de leite UHT (embalagens cartonadas de 1000 mL) provenientes de oito marcas comerciais disponíveis no mercado nacional, sendo quatro do estado de Santa Catarina, vinte e uma de Minas Gerais, seis de São Paulo e nove do Rio Grande do Sul. Dentre as quarenta amostras, quinze receberam fortificação com fosfato tricálcico e trinta e sete adição de sais estabilizantes. Em relação ao teor de gordura, doze amostras foram classificadas como integral, dezesseis como desnatado e doze como semidesnatado.

Análises físico-químicas

A determinação do teor de cálcio iônico foi realizada através da técnica de potenciometria por meio do eletrodo íon-seletivo Thermo Scientific Orion ISE meter/9720BNWP, calibrado previamente com soluções padrões (4, 40 e 4000 ppm).

O pH das amostras foi determinado através do potenciômetro PG2000, calibrado previamente com soluções padrões (pH 4,0 e 7,0).

A aferição da sedimentação foi realizada a partir da determinação da massa de sedimentos, em gramas, aderida à base da embalagem após a remoção do líquido, conforme metodologia de Gaur et al.⁴

A determinação do tempo de coagulação do leite por calor (HCT) foi realizada submetendo 10 mL de amostra em um frasco fechado ao banho de óleo a 155 ºC, conforme método de Dumpler e Kulozik.⁵ Foi determinado o tempo, em segundos, transcorrido desde o início do banho até o momento da formação dos primeiros coágulos.

A estabilidade ao etanol foi analisada em concentrações de etanol e água entre 72 e 96% (v/v). O teste foi conduzido em placas de Petri, onde foram adicionados 2 mL da solução alcóolica e 2 mL de amostra de leite UHT. Foi avaliada a formação de coágulos nas amostras em cada concentração de etanol, conforme relatado por Costa.⁶

A análise de distribuição de tamanho das partículas foi realizada por meio do analisador de partículas por difração a laser LS 12 320 acoplado ao módulo de análise líquida. Os resultados das amostras foram obtidos utilizando índice de refração de 1,332 para o meio dispersante (água), 1,47 para gordura e 1,57 para as micelas de caseína. A partir das curvas de distribuição granulométrica foi obtido o parâmetro D90 (diâmetro de corte da curva de distribuição acumulada em 90%).

O potencial zeta foi determinado através do analisador Zetasizer Nano ZS90. As amostras de leites UHT foram previamente diluídas em uma razão de 1:500, em água deionizada. Em seguida, as amostras diluídas foram injetadas em cubetas e analisadas.

Tratamento dos dados

As análises estatísticas foram conduzidas por intermédio do software Sigmaplot.⁷ A normalidade dos dados foi testada através do teste de Shapiro-Wilk com significância de 5%. Para a determinação das correlações foi utilizado o teste de Spearman com significância de 5%. O teste utilizado para comparar dois grupos independentes avaliados por meio de uma variável quantitativa com distribuição normal foi o teste t de Student com significância de 5%. O teste utilizado para comparar dois grupos independentes avaliados por meio de uma variável quantitativa sem distribuição normal foi o teste Mann-Whitney com significância de 5%.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Avaliação dos sistemas coloidais

Os sais no leite se distribuem em duas fases: a fase livre ou solúvel e a fase ligada às micelas de caseína, ou coloidal, existindo um equilíbrio termodinâmico dos íons entre elas. Nesse contexto, o íon cálcio destaca-se, pois sua partição entre as fases é fator extremamente crítico para as propriedades físico-químicas do leite e para a estabilidade das micelas de caseína.⁸ A distribuição dos sais entre as fases é afetada por uma série de fatores, como alterações no pH, aquecimento, resfriamento e adição de sais.⁹

O Esquema 1 mostra as ligações interproteínas nas micelas de caseína através das pontes salinas (cálcio).¹⁰ Por isso, é extremamente relevante, do ponto vista coloidal, investigar a concentração do íon cálcio na fase solúvel (cálcio iônico).

 

 

No experimento o teor de cálcio iônico das quarenta amostras de leites UHT comerciais variou entre 1,25 e 2,00 mM, como pode ser observado na Tabela 1.

 

 

Os valores encontrados estão condizentes com os dados reportados na literatura. Tsioulpas et al.¹² avaliaram a concentração de cálcio iônico em leite esterilizado antes do tratamento térmico (1,87 mM) e após seis meses de armazenamento (1,91 mM).

Em outro experimento, Omoarukhe et al.¹³ avaliaram o teor de cálcio iônico em leite processado via UHT e encontraram o valor de 1,57 mM. De acordo com Gaur et al.,⁴ a concentração de cálcio iônico em leite UHT sem adição de estabilizantes foi de 1,33 mM. Segundo Lewis,¹⁴ o teor de cálcio iônico em leite UHT com fortificação de cálcio variou entre 1,10 e 2,23 mM.

O pH do leite UHT exerce efeito relevante na sedimentação. A redução do pH (< 6,55) pode aumentar acentuadamente os níveis de sedimentação. Outro fator preponderante, que claramente implica em aumento da massa de sedimentos, é o teor de cálcio iônico. O aumento da concentração desse íon (> 2,0 mM) eleva o risco de sedimentação.⁴

O processamento UHT causa uma dissociação significativa de κ-caseína das micelas, que são amplamente estabilizadas pela κ-caseína em sua superfície. Devido a isso, as micelas com depleção de κ-caseína são instáveis e podem formar agregados via ponte de cálcio, se o pH do leite estiver abaixo dos níveis críticos e/ou o cálcio iônico estiver acima dos níveis críticos.⁴

Não foi observada correlação estatisticamente significativa (p > 0,05) entre a massa de sedimentos e o pH e entre a massa de sedimentos e o cálcio iônico (Tabela 2). Uma possível explicação para isso é que as amostras analisadas não apresentaram valores de pH inferiores a 6,55 e as concentrações de cálcio iônico não foram superiores a 2,0 mM.

 

 

O método mais utilizado para determinar a estabilidade do leite ao calor é o tempo de coagulação ao submeter a amostra a uma determinada temperatura (HCT). Assim como no caso da sedimentação, o pH e a concentração de cálcio iônico exercem alta influência na estabilidade térmica das micelas de caseína.³ O HCT aumenta à medida que o pH é elevado, até que atinja o valor máximo em pH natural do leite (6,6-6,7). Entre pH 6,7 e 7,0, os valores de HCT decrescem.³ Para a faixa de pH (6,62-6,80) na qual se encontram as amostras do experimento, não foi observada correlação estatisticamente significativa (p > 0,05) entre o HCT e o pH (Tabela 2). Uma possível explicação é que o leite apresenta alta estabilidade térmica nessa faixa de pH e nas concentrações de cálcio iônico das amostras (1,25-2,00 mM).

A estabilidade ao etanol é um teste amplamente utilizado no Brasil na previsão da estabilidade térmica do leite.⁶ O leite UHT após incubação a 35-37 ºC durante sete dias deve ser estável ao etanol 68%.¹⁵ Por meio da Tabela 1, pode-se observar que os resultados variaram entre 82 e 98% e foram muito superiores ao mínimo estabelecido pela legislação brasileira. Costa⁶ avaliou a estabilidade ao etanol para leites pasteurizados com a adição de diferentes sais estabilizadores. Os valores encontrados variaram entre 82 e 96%. Karlsson et al.¹⁶ testaram a estabilidade ao etanol para leites UHT sem estabilizantes durante a vida de prateleira. Imediatamente após o processamento, a amostra apresentou o valor de 80%.

A estabilidade coloidal do leite UHT é altamente influenciada pelo tamanho das partículas presentes no meio, especialmente pelo glóbulo de gordura. Por isso, é realizado o processo de homogeneização, a fim de evitar a separação de gordura durante o armazenamento. Deeth e Lewis¹⁷ recomendaram que o valor de D90 para leite homogeneizado não ultrapasse 1,7 µm, ou seja, 90% das partículas não devem apresentar tamanho superior a esse valor. Além disso, um processo adequado de homogeneização deve fornecer D90 abaixo de 1,3 µm.¹⁷ Pode-se observar que o maior valor de D90 encontrado foi de 1,24 µm (Tabela 1). Portanto, os valores encontrados para as amostras de leites UHT comerciais estavam dentro da faixa apropriada, o que indica uma homogeneização eficiente.

As matrizes alimentares contêm partículas eletricamente carregadas, que interagem umas com as outras e com o meio. O potencial zeta tem o objetivo de avaliar a estabilidade do leite a partir da determinação da carga elétrica líquida do sistema. O limiar de potencial zeta entre sistemas estáveis e instáveis foi definido: ± 0-10 (muito instável), ± 10-20 (relativamente estável), ± 20-30 (moderadamente estável) e ± 30 mV (altamente estável).¹⁸ Os constituintes que têm o maior fator de contribuição são as micelas de caseína e a membrana do glóbulo de gordura. Os leites desnatado e integral em pH natural do leite apresentam os potenciais zeta de -18 e -22 mV, respectivamente.¹⁹

Gaucher et al.¹⁹ avaliaram o potencial zeta de amostras de leite UHT semidesnatado que não foram homogeneizadas e encontraram valores entre -18 e -22 mV. Anema²⁰ avaliou amostras de leite UHT desnatado e não homogeneizado e obteve valores entre -14 e -16 mV. Em outro experimento, Tsioulpas et al.¹² testaram o efeito da adição de sais estabilizadores em leite desnatado, esterilizado, não homogeneizado e após seis meses de produção, e encontraram valores de potencial zeta entre -26,0 e -28,7 mV.

A partir da Tabela 1, pode-se observar que os valores de potencial zeta variaram entre -24,10 e -32,9 mV. A diferença entre os resultados encontrados e os reportados na literatura é consistente com esperado. O experimento utilizou amostras de leite UHT comerciais submetidas à homogeneização, cujo objetivo é aumentar a estabilidade coloidal do leite. Portanto, os valores de potencial zeta menores que os da literatura (provenientes de leites não homogeneizados) podem ser atribuídos ao efeito da homogeneização nas amostras. Esse processo acarreta a diminuição do potencial zeta dos glóbulos de gordura, devido à adsorção de proteínas do soro e micelas de caseína na superfície do glóbulo.²¹

Avaliação da influência de aditivos na estabilidade coloidal das amostras de leites UHT comerciais

Avaliação da influência da adição de sais estabilizadores na estabilidade coloidal das amostras

Durante o tratamento térmico, as concentrações de cálcio e fosfato na fase coloidal aumentam.²² Isso ocorre devido à redução na solubilidade do fosfato de cálcio, acarretando diminuição da concentração de Ca e Pi (fosfato inorgânico) na fase solúvel.²² A adição de sais estabilizadores (citratos e fosfatos) reduz a concentração de cálcio iônico no meio, pois agem como agentes quelantes.²³ Por isso, amostras que sofreram adição de sais estabilizadores apresentaram menores teores de cálcio iônico (Figura 1a). Gaur et al.⁴ avaliaram a adição de diferentes fosfatos e citratos e concluíram que os teores de cálcio iônico das amostras apresentaram redução significativa.

 

 

O tratamento térmico promove a remoção da estrutura estabilizadora (filamentos protuberantes de κ-caseína) e produz um arranjo micelar que tem uma estabilidade coloidal muito reduzida, portanto, extremamente propenso à agregação induzida pela atividade do íon cálcio.² Outra condição que afeta a estabilidade coloidal é adição de etanol, que promove redução na constante dielétrica da solução, o que causa colapso da estrutura estabilizadora de κ-caseína.¹⁶ Por isso, amostras sem estabilizantes, logo, com maior teor de cálcio iônico, indicaram menor tempo de coagulação por calor (Figura 1b) e menor estabilidade ao álcool (Figura 1c).

A acidificação do leite acarreta a protonação dos grupos carboxilatos dos resíduos de aminoácidos (Glu e Asp). Essa alteração no balanço de cargas da extremidade C-terminal da κ-caseína, que é naturalmente carregada negativamente, causa desestabilização do impedimento eletrostático entre as micelas de caseína e, consequentemente, perturbação da estabilidade coloidal, levando à agregação.³ As amostras com adição e sem adição de estabilizantes não apresentaram diferenças estatisticamente significativas na massa de sedimentos (Figura 1d) ou no pH (Figura 1e). Isso se deve ao fato de nenhuma amostra apresentar valor de pH inferior a 6,55. Apesar de as amostras sem estabilizantes apresentarem maiores concentrações de cálcio iônico, não foram observados valores superiores a 2,0 mM, o que também explica a não existência de diferenças significativas em relação à sedimentação.

Avaliação da influência do enriquecimento de cálcio na estabilidade coloidal das amostras

As amostras com e sem adição de fosfato tricálcico não apresentaram diferenças estatisticamente significativas no teor de cálcio iônico (Figura 2a). Apesar da adição de Ca₃(PO₄)₂, as amostras com enriquecimento não exibiram valores elevados no teor de cálcio iônico. Isso pode ser explicado devido a adição de sais estabilizantes nessas amostras.

 

 

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no pH (Figura 2b) e teor de cálcio iônico (Figura 2a) entre as amostras com ou sem enriquecimento de cálcio. Além disso, os valores encontrados não ultrapassaram os limites indicados pela literatura. Porém, a massa de sedimentos (Figura 2c) em amostras com adição de Ca₃(PO₄)₂ foi significativamente maior. A possível causa para esse fenômeno está associada a solubilidade dos demais aditivos alimentares fortificantes que ocorrem nessas amostras. Cabe ressaltar a presença de pirofosfato férrico, que é insolúvel em água.

Não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas no tempo de coagulação por calor (Figura 2d). Porém, a estabilidade ao etanol (Figura 2e) foi significativamente menor nas amostras com enriquecimento de cálcio.

Esses dois testes de desestabilização do leite apresentam correlações quando analisados sob a ótica da disponibilidade de cálcio no meio. Porém, existem uma série de alteração induzidas pelo calor que apresentam notável influência na estabilidade coloidal.²⁴ Por isso, não é adequado traçar correlações quantitativas entre os dois métodos. Segundo Anema,² o teste do álcool é geralmente eficaz na avaliação de leites com qualidade excepcionalmente boa ou ruim. Porém, é menos adequado para discriminar amostras que apresentam estabilidade intermediária.

 

CONCLUSÕES

Com o desenvolvimento do presente estudo, foi possível caracterizar e avaliar o sistema coloidal de quarenta amostras de leites UHT comercializados nas regiões Sul e Sudeste. Os resultados dos parâmetros analisados indicaram uma estabilidade coloidal pertinente para esse tipo de matriz, além de um processo de homogeneização industrial eficiente. O pH das amostras e a concentração de cálcio iônico apresentaram valores consoantes com os dados da literatura. As estabilidades ao etanol das amostras apresentaram valores muito superiores do que aqueles estabelecidos pela legislação. As análises de potencial zeta mostraram valores menores que os reportados na literatura. Uma possível explicação está relacionada ao processo de homogeneização das amostras de leite UHT comerciais. Nenhuma amostra apresentou valor de D90 maior que 1,3 µm. Esse resultado evidencia que os leites UHT foram submetidos a processos de homogeneização eficientes.

As amostras que sofreram adição de estabilizantes apresentaram menor teor de cálcio iônico, maior tempo de coagulação por calor e maior estabilidade ao etanol, quando comparadas as amostras que não continham sais estabilizadores. Isso ocorre devido à natureza quelante desses sais, que sequestram os íons cálcio. Amostras com e sem adição de estabilizantes não apresentaram diferença significativa em relação a massa de sedimentos, pois os valores de pH e cálcio iônico não foram superiores a 6,55 e inferiores a 2,0 mM, respectivamente.

As amostras que receberam adição de fosfato tricálcico apresentaram maior sedimentação, pois os aditivos alimentares fortificantes que ocorrem nessas amostras apresentam baixa solubilidade. Amostras com e sem adição de Ca₃(PO₄)₂ não apresentaram diferenças significativas e relação ao cálcio iônico, pH e tempo de coagulação por calor. Portanto, a diferença encontrada em relação a estabilidade ao etanol pode estar associada a limitação desse método em discriminar amostras que apresentam estabilidade intermediária.

 

REFERÊNCIAS

1. Embrapa; Anuário Leite 2023; Embrapa Gado de Leite: Juiz de Fora, 2023.

2. Anema, S. G.; Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2019, 18, 140. [Crossref]

3. Huppertz, T. Em Advanced Dairy Chemistry, Volume 1B: Proteins: Applied Aspects; McSweeney, P. L. H.; O'Mahony, J. A., eds.; Springer Science: New York, 2016, cap. 7.

4. Gaur, V.; Schalk, J.; Anema, S. G.; Int. Dairy J. 2018, 78, 92. [Crossref]

5. Dumpler, J.; Kulozik, U.; Int. Dairy J. 2015, 49, 111. [Crossref]

6. Costa, C. H. F.: Avaliação Microestrutural do Leite Pasteurizado Submetido ao Teste do Álcool Visando Processamento UHT; Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, Brasil, 2016. [Link] acessado em Novembro 2024

7. Sigmaplot, version 14; Systat Software Inc., San Jose, CA, USA, 2017.

8. Wang, Q.; Ma, Y.; Int. Dairy J. 2020, 110, 104713. [Crossref]

9. Gaucheron, F.; Reprod., Nutr., Dev. 2005, 45, 473. [Link] acessado em Novembro 2024

10. de Kruif, C. G.; Huppertz, T.; Urban, V. S.; Petukhov, A. V.; Adv. Colloid Interface Sci. 2012, 36, 171. [Crossref]

11. Hindmarsh, J. P.; Smith, J. R.; Carr, A. J.; Watkinson, P. J.; J. Food Eng. 2019, 242, 31. [Crossref]

12. Tsioulpas, A.; Koliandris, A.; Grandison, A. S.; Lewis, M. J.; Food Chem. 2010, 122, 1027. [Crossref]

13. Omoarukhe, E. D.; On-Nom, N.; Grandison, A. S.; Lewis, M. J.; Int. J. Dairy Technol. 2010, 63, 504. [Crossref]

14. Lewis, M. J.; Int. J. Dairy Technol. 2011, 64, 1. [Crossref]

15. Ministério de Estado da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA); Portaria No. 370 de 4 de setembro de 1997, Regulamento Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade do Leite UHT (UAT); Diário Oficial da União (DOU), Brasília, No. 172, de 04/09/1997, p 52-53. [Link] acessado em Novembro 2024

16. Karlsson, M. A.; Langton, M.; Innings, F.; Malmgren, B.; Höjer, A.; Wikström, M.; Lundh, Å.; Heliyon 2019, 5, 9. [Crossref]

17. Deeth, H. C.; Lewis, M. J.; High Temperature Processing of Milk and Milk Products, 1^st ed.; John Wiley & Sons: Chichester, 2017.

18. Cano-Sarmiento, C.; Téllez-Medina, D. I.; Viveros-Contreras, R.; Cornejo-Mazón, M.; Figueroa-Hernández, C. Y.; García-Armenta, E.; Alamilla-Beltrán, L.; García, H. S.; Gutiérrez-López, G. F.; Food Eng. Rev. 2018, 10, 113. [Crossref]

19. Gaucher, I.; Mollé, D.; Gagnaire, V.; Gaucheron, F.; Food Hydrocolloids 2008, 22, 130. [Crossref]

20. Anema, S. G.; Int. Dairy J. 2017, 75, 56. [Crossref]

21. Michalski, M. C.; Michel, F.; Sainmont, D.; Briard, V.; Colloids Surf., B 2002, 23, 23. [Crossref]

22. Nieuwenhuijse, H.; Huppertz, T.; Int. Dairy J. 2022, 126, 105220. [Crossref]

23. Deeth, H. C.; Lewis, M. J.; Int. J. Dairy Technol. 2015, 68, 1. [Crossref]

24. Horne, D. S. Em Advanced Dairy Chemistry, Volume 1B: Proteins: Applied Aspects; McSweeney, P. L. H.; O'Mahony, J. A., eds.; Springer Science: New York, 2016, cap. 9.

 

Editor responsável pelo artigo: Nelson H. Morgon